Summary
Создание микро-тканей с использованием цилиндрической гели коллагена, называемых модулей, которые содержат встроенные клетки и поверхность которого покрыта эндотелиальных клеток.
Abstract
Этот протокол описывает изготовление типа микро-ткани называются модулями. Модульный подход создает единый, масштабируемый и васкуляризированной тканей. Модули могут быть изготовлены из коллагена, а также других gelable или сшиваемых материалов. Они примерно в 2 мм в длину и 0,7 мм в диаметре при изготовлении, но уменьшаться в размерах со встроенными клетками или когда модули покрыты эндотелиальных клеток. Модулей в отдельности достаточно малы, что встроенный клетки находятся в пределах диффузионного предела кислород и другие питательные вещества, но модули могут быть упакованы вместе, чтобы сформировать большие тканей, которые perfusable. Эти ткани имеют модульную в строительстве, потому что разные типы клеток могут быть встроены в систему или нанесенным на модули, прежде чем они упакованы вместе, чтобы сформировать комплекс тканей. Существуют три основные шаги создания модулей: (1) нейтрализующие коллагена и вложение клетки в ней, (2) гелеобразования коллагена в трубку и резки модулей и (3) покрытия модулей с эндотелиальных клеток.
Protocol
1) Подготовка труб
- Вырезать 2 до 3 м длины трубы из полиэтилена (0,76 мм ID х 1,22 мм OD).
- Тема 20 G1 иглу в один конец трубы.
- Катушка труб и место в преобразователях самостоятельно уплотнение сумка (7 1 / 2 "х 13"). Двух концах трубки должны быть помещены в конце распечатал пакет и выявляются в месте с газом ленты стерилизации.
- Сумки печать и газа стерилизовать.
2) Нейтрализация Коллаген
Примечание: 1 мл коллаген заполняет около 2 м полиэтиленовых труб.
- Место необходимое количество коллагена, необходимого для требуемой длины труб в 15 мл коническую трубку и держать на льду.
- Добавить 128 мкл 10x α-MEM на мл коллагена к трубке и перемешать несколько раз пипеткой решение. Примечание: (1) Решение должно желтеют, как α-MEM смешивается с подкисленной коллагена и (2) стараются свести к минимуму пузырьки при смешивании.
- Нейтрализовать коллагена, добавив 0,8 M бикарбоната натрия до коллаген имеет рН 7,4. Для общей оценки бикарбоната натрия добавить рН до желтого раствора коллагена оказывается светло-розового цвета. Примечание: как правило, занимает от 30 до 60 мкл на каждый мл коллагена.
- Держите нейтрализованы коллагена на льду до полной готовности для использования в качестве нейтрализованы коллагена гель будет, если не хранить при температуре 4 ° C.
3) Вложение Cells (опционально)
Примечание: В зависимости от типа клеток клетки могут быть встроены в концентрации от 1 млн. клеток на мл до 20 млн. клеток в мл. Использование среды, необходимые для ячеек, которые требуется внедрить.
- Удаление информации из ячеек и промойте 5 мл PBS.
- Удалить PBS и добавить 3 мл трипсина-EDTA.
- Инкубируйте клетки в трипсин-ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° C.
- Ресуспендируют клеток в средствах массовой информации 7 мл.
- Граф клеток.
- Передача необходимое количество клеток для встраивания в 15 мл коническую трубку.
- Гранул клетки при 300 мкг в течение 5 мин.
- Аспирируйте СМИ от осадок клеток.
- Ресуспендируют клеток в нейтрализованы коллагена и держать на льду.
4) Желирующие коллагена
- В кабинете биологической безопасности отрезать запечатанный конец мешок с полиэтиленовой трубы.
- Прикрепить 3 мл шприц иглой 20G в один конец трубки использованием стерилизованных пинцетом. Держите трубку в сумке.
- Вставьте другой конец трубки в нейтрализованы коллагена, пока наконечник в нижней конической трубе использованием стерилизованных пинцетом. Держите конической трубе на льду.
- Вытяните коллагена в полиэтиленовой трубы от втягивания поршень шприца медленно.
Примечание: Если коллагена втягивается в трубку, чтобы быстро, то пузырьки образуют в коллаген. - После потянув коллагена через трубку, потяните 20G иглу из трубки и положил обоих концах обратно в сумку. Лента мешок закрыты.
- Инкубируйте мешок при температуре 37 ° С в течение 60 мин. Если коллагена содержит клетки, затем переверните сумку через каждые 15 мин. таким образом, чтобы клетки не оседают на одной стороне модуля.
5) резка труб содержащих гель Коллаген
- Автоклав заголовки и лезвия для резки и поднос держать трубку.
- Соберите режущего аппарата.
- Место труб в стерильном лотке перед отрезное устройство и загрузить трубопровод в режущего аппарата.
- Настройка 50 мл коническую трубку, содержащую 25 мл среды на выходе из режущего аппарата для сбора сократить модулей.
Примечание: Используйте среду, содержащую FBS даже для коллагена только модули, модули не отдельно от трубки без FBS в СМИ. Если модули содержат клетки используют средства массовой информации, необходимых для встроенных элементов. Если Есть нет встроенного клеток в модули используют СМИ для эндотелиальных клеток. - Установите режущий аппарат, чтобы сократить 2 мм длины труб и вырезать трубки.
- Инкубируйте сократить модулей при 37 ° С в течение 60 минут в 50 мл коническую трубку.
6) Удаление Коллаген модули из трубы
- Vortex 50 мл коническую трубку с модулями в трубы на 10 сек.
Примечание: Будьте аккуратны при разделении модулей с встроенной высокой плотности клеток, чтобы избежать поломки. - Давайте модулей оседают на дне пробирки. Занимает около 5 мин.
- Используя широкий рот 10 мл пипетки серологические передачи поселились модулей для 15 мл коническую трубку.
- Повторите шаги с 6,1 до 6,3 раза.
- Перейдите к пункту 7, чтобы покрыть модулей с эндотелиальные клетки или передачу модули для не-культуры тканей лечение пластины.
7) Покрытие модулей с эндотелиальных клеток
- Settle модули в нижней части 15 мл коническую трубку с 5 мл среды для йэлектронной встроенных элементов.
- Удаление информации из эндотелиальных клеток и промыть 5 мл PBS.
- Удалить PBS и добавить 3 мл трипсина-EDTA.
- Инкубируйте клетки в трипсин-ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° C.
- Ресуспендируют клеток в средствах массовой информации 7 мл.
- Граф клеток. Нужна 5x10 6 эндотелиальных клеток на мл упакованные модули, в нижней части конической трубе.
- Гранул клетки при 300 мкг в течение 5 минут и ресуспендируют в 5 мл эндотелиальных СМИ клетки.
- Добавить 5 мл среды, содержащей эндотелиальных клеток модулей.
Примечание: Это дает соотношении 50:50 из двух типов информации, которые мы нашли, чтобы работать для выживания и функции обоих типах клеток. Испытание использования совместно культуральной среде разработана для обеспечения надлежащего обслуживания фенотипы двух ячеек типа перед ее использованием. - Инкубируйте модулей с эндотелиальных клеток как статически и динамически.
- Для статических инкубации смесь модулей с эндотелиальных клеток путем инверсии и установить трубку вертикально при температуре 37 ° С в течение 15 мин. Повторить.
- Динамически семян эндотелиальные клетки осторожно покачайте его трубке при 37 ° С в течение 60 мин.
- Повторите статического инкубации в два раза.
- Место модулей в не-культуры тканей рассматриваются пластины и инкубировать в течение ночи при температуре 37 ° C.
- Следующим местом день модулей в новых, не-культуры тканей рассматривается пластина со свежими СМИ (50:50 смеси при использовании совместно системе культуры), чтобы удалить одиноких эндотелиальных клеток.
- Инкубируйте модулей, которые покрыты эндотелиальных клеток, пока они покрывают 100% поверхности модулей. Это обычно занимает около 7 дней.
8) представитель Результаты:
Модули будут выглядеть цилиндрические, когда они впервые будут удалены из трубы. Если модули содержат встроенный клеток и / или покрыты эндотелиальных клеток, они могут сокращаться до 50% в объеме и развивать овальную форму (рис. 1). Модули также станет более плотным и непрозрачным, если смотреть с помощью световой микроскопии (рис. 1). Кроме того, когда эндотелиальные клетки сливающийся на поверхности модулей происходит образование плотных контактов, которые можно увидеть с помощью иммунофлуоресценции окрашивание VE-кадгерина (рис. 2). Анализ Массоперенос показал, что модули могут поддерживать высокую плотность клетки (8х10 7 клеток / см 3) без развития некротических ядро из-за неадекватного транспорта кислорода, что зачастую проблематично в больших тканей (например, модули большого диаметра, D = 1,4 мм) (рис. 3).
Рисунок 1: изготовление модулей и сжатия. Модуль сокращения произошли в течение трех дней после HUVEC-C (эндотелиальной клеточной линии) посева результаты, но значительно меньший диаметр и длина модуля (р <0,001) (). Встроенные HepG2 клетки были равномерно распределены внутри модулей во время изготовления и сохранила высокую жизнеспособность (B). [Live клетки зеленым; мертвые клетки красной] [адаптировано из Corstorphine 2010]
Рисунок 2: VE-кадгерина иммунофлуоресцентного окрашивания ЕС плотные соединения ячейка 10 дней после РАЭК, где покрытие на поверхности модуля. Шкала бар = 50 мкм.
Рисунок 3: trichrome окрашивания Массона типичных модулей (0,76 мм начального диаметра) и крупные модули (1,4 мм начального диаметра) демонстрируют эффект ограничения диффузии кислорода. Семь дней после изготовления, большое количество мертвых клеток были сформированы в ядро крупных модулей (нижняя правая панель), оставив лишь тонкий ободок (~ 200 мкм толщиной) жизнеспособных клеток. С другой стороны, небольшие модули сохранили форму и высокое живых клеток. [Модули с встроенной HepG2 клетками и покрыты эндотелиальных клеток.] [Взято из Corstorphine 2010]
Рисунок 4: () HMEC-1 посеяны на poloxamine - коллаген модулей. После 1-й день посева poloxamine-коллагеновые модули сохраняют свою цилиндрическую форму и существует ограниченный свойства вложения ячейки по сравнению с коллагена только модули. Шкала бар = 200 мкм. (Б) светового микроскопа образ коллагена модуль, содержащий PLGA основе биоразлагаемых микросфер. Шкала бар = 500 мкм.
Рисунок 5: Примеры в пробирке анализов. () Ангиогенеза анализа: капиллярная образований на модуле засеяно эндотелиальные клетки могут быть легко обнаружены и количественно через 5 дней инкубации с жировой ткани стволовых клеток. (B) конфокальной микроскопии изображений живых / мертвых анализа на модулях, где ссодержащих для живых клеток зеленая и для мертвых клеток красного цвета.
Рисунок 6: Коллаген модули, содержащие встроенные мезенхимальных стволовых клеток и поверхностного слоя эндотелиальных клеток. Модули подвергались напряжения сдвига (~ 0,64 дин / см 2) в течение 7 дней в микрожидкостных камеры и начинают проявлять слияние в точках соприкосновения. Эндотелиальные клетки окрашивали Виллебранда (коричневый) и мезенхимальных стволовых клеток, ядер появляется синий (H & E). Шкала бар = 100 мкм.
Рисунок 7: Сотни коллагена модули, содержащие жировой полученные стволовые клетки (ASC) и покрыты правам микрососудистой эндотелиальных клеток (HMEC) имплантируется под кожу мышей для изучения ASC / HMEC взаимодействия в естественных для жирной приложений регенерации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы изготовили несколько различных микро-тканей с использованием модулей с встроенной различных типов клеток 1-11. Мы успешно внедренный первичных кардиомиоцитов, островков, клетки жировой стволовых и мезенхимальных стромальных клеток, а также нескольких клеточных линий, включая HepG2, NIH 3T3 и клонировать 9 клеток печени. У нас есть покрытие модули с несколькими типами клеток эндотелия аорты крыс в том числе эндотелиальных клеток, пупочной вены человека эндотелиальных клеток и человеческих эндотелиальных клеток капилляров. Модули были также подготовлены со смесью коллагена и poloxamine полимера или содержащие наркотики элюированием микросфер (рис. 4). Несколько в пробирке анализы показали, чтобы быть совместимым с модулей, включая иммунофлюоресценции, иммуноблоттинга, ангиогенез, Аламар синий распространения и жить / мертвых анализы (рис. 5). Они также используются в микрожидкостных камер (рис. 6) и имплантировали в мышей и крыс (рис. 7) для изучения взаимодействия между различными типами клеток и как микро-ткани отремонтирован принимающей ответ. Модули имеют много приложений и может быть использован для изучения эффекта 3D культуры ткани на клетки, взаимодействие разных клеток в 3D-конформации, реконструкции микро-ткани в микрожидкостных камере и в естественных условиях реконструкции микро-ткани хост ответ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Финансирование было предоставлено Национальным институтом здоровья (EB 001 013), естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады и канадских институтов исследований в области здравоохранения. Мы благодарим д-ра А. П. Макгиган для нее опыт и помощь в разработке модулей.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic tubing PE60 | BD Biosciences | 427416 | Different diameter of tubing can be used to change the diameter of the modules |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200-072 | |
| Purcol acidificed collagen, 3 mg/mL | Cedarlane Labs | 5005-B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 20G needle | BD Biosciences | 305175 | Diameter of the needle needs to be similar to the diameter of the tubing |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 15 mL tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2” x 13” | Cardinal Health | 92713 | |
| 10 ml Wide Tip serological pipet | BD Biosciences | 357504 | |
| 10 ml serological pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml serological pipet | BD Biosciences | 357543 |
References
- Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules. , (2010).
- Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2010).
- Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats. Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).
- Leung, B. M., Sefton, M. V. A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells. Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).
- McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected]. Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct. J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering. Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design criteria for a modular tissue-engineered construct. Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules. Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).
- Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells. Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).
