Summary
使用圆柱胶原凝胶，称为模块，其中包含嵌入细胞表面的微组织的创建是涂有内皮细胞。
Abstract
这个协议描述的称为模块的微观组织类型制造。该模块的方法生成统一的，可扩展性和吻合血管的组织。该模块可制成胶原蛋白，以及其他gelable或交联材料。他们后制造的直径约2毫米长，0.7毫米，但在尺寸缩小与嵌入式细胞或模块与内皮细胞涂。单独的模块都足够小，嵌入细胞内的氧气和其他营养物质的扩散限制，但模块可以打包在一起，形成较大的组织，perfusable。因为不同类型的细胞，可以嵌入在或涂在模块之前，他们挤在一起，形成复杂的组织，这些组织都采用模块化施工。模块有三个主要步骤：（1）中的胶原蛋白和嵌入在它的细胞，（2）凝胶在管内的胶原蛋白和切割与内皮细胞的模块和（3）涂层的模块。
Protocol
1）准备油管
- 切割2至3米长度的聚乙烯管（0.76毫米内径× 1.22毫米外径）。
- 20 G1的针管端成一个主题。
- 线圈油管并将其放置在一个转换器，自密封袋（7 1 / 2“× 13”）。油管的两端应置于袋启封，并在地方与气体消毒磁带录音。
- 密封袋和气体消毒。
2）中和胶原蛋白
注：1毫升的胶原蛋白填充聚乙烯管材约2米。
- 将所需的油管到15毫升的锥形管的长度所需要的必要数量的胶原蛋白，并保持在冰上。
- 加入128微升10倍的α- MEM中每毫升含胶原管，并通过反复吹打的解决方案组合。注：（1）解决方案应该是混合变成黄色α- MEM到酸化的胶原蛋白和（2）尽量减少气泡，当混合。
- 胶原蛋白中加入0.8 M碳酸氢钠，直到胶原蛋白的pH值7.4。对于一般估计的pH添加碳酸氢钠，直到黄色的胶原蛋白溶液变成浅粉色的颜色。注：通常需要30％至60μL每毫升胶原蛋白。
- 置于冰上瓦解胶原蛋白，直到准备使用的瓦解胶原凝胶，如果不保持在4 ° C。
3）嵌入细胞（可选）
注：根据细胞类型的细胞可以被嵌入在一个细胞每毫升1万至20万每毫升细胞之间浓度。使用您要嵌入的细胞所需的介质。
- 从细胞中移除的媒体，用5 mL PBS冲洗。
- 删除PBS和添加3 mL的胰蛋白酶EDTA。
- 胰蛋白酶EDTA细胞孵育5分钟，在37 ° C。
- 7毫升媒体重悬细胞。
- 计数细胞。
- 嵌入到一个15毫升的锥形管，转移所需的细胞数量。
- 5分钟沉淀细胞XG 300。
- 吸过的细胞颗粒的介质。
- 重悬在瓦解胶原细胞，并保持在冰上。
4）胶原凝胶
- 在生物安全柜切断含有聚乙烯管袋的密封端。
- 在使用消毒镊子管的一端，将3毫升注射器20G针。保持管囊中。
- 油管的另一端插入瓦解胶原蛋白，直到使用消毒镊子锥形管的底部是尖。保持锥形管上冰。
- 回缩注射器的柱塞慢慢拉进聚乙烯管材的胶原蛋白。
注：如果胶原蛋白是被拉进油管，然后迅速泡沫将形成中的胶原蛋白。 - 通过油管拉胶原蛋白后，拉出20G针管回入袋两端。磁带的袋子关闭。
- 在37℃，60分钟收入囊中。如果胶原蛋白细胞，然后翻转过来，每15分钟的袋子。使细胞不解决，以模块的一面。
5）切割油管胶凝胶原蛋白
- 高压灭菌器的头和刀片切割设备和托盘举行油管。
- 组装切割设备。
- 在前面切割设备的无菌托盘放置在油管和加载到切割设备的油管。
- 设置了一个50 ml锥形管内含有25毫升的媒体在切割设备的出口，以收集削减模块。
注意：使用媒体含有FBS胶原唯一的模块甚至模块不无FBS在媒体的管分开。如果模块包含电池使用嵌入式细胞所需的媒体。如果有模块中没有嵌入细胞使用的内皮细胞的媒体。 - 集切割设备，减少了2毫米的油管长度和降低油管。
- 孵育削减模块在37 ° C为60分钟在50 mL锥形管。
6）卸下油管胶原模块
- 涡街50 mL锥形管中，在10秒管材模块。
注：分离高密度嵌入式模块，以避免破损时要轻柔。 - 让模块解决试管底部。注意到大约5分钟。
- 使用宽口10毫升血清移液器结算模块转移到15 mL锥形管。
- 重复步骤6.1至6.3的两倍。
- 转到加强与内皮细胞治疗非组织培养板或传输模块7大衣模块。
7）涂层与内皮细胞的模块
- 日媒体5毫升到15 mL锥形管的底部与解决模块发送嵌入细胞。
- 删除媒体从内皮细胞，并用5 mL PBS冲洗。
- 删除PBS和添加3 mL的胰蛋白酶EDTA。
- 胰蛋白酶EDTA细胞孵育5分钟，在37 ° C。
- 7毫升媒体重悬细胞。
- 计数细胞。需要5X10 6每毫升装在锥形管的底部模块的内皮细胞。
- 5分钟和5毫升的内皮细胞介质的悬浮颗粒的细胞在300 XG。
- 添加5毫升含有内皮细胞的模块媒体。
注：这给我们已经发现两种类型的细胞的生存和功能的两个媒体类型的比例为50:50。测试使用共同培养液中，制定适当的维修，以确保在使用它之前的两种细胞类型的表型。 - 孵育的内皮细胞，静态和动态的模块。
- 对于静态孵育内皮细胞混合模块反转设置管直立在37 ° C为15分钟。重复。
- 动态种子内皮细胞轻摇管在37 ° C为60分钟。
- 重复静态孵化两次。
- 模块放置在一个非组织培养处理的板孵育过夜，于37 ° C。
- 第二天模块与新媒体在一个新的非组织文化对待板（50:50混合系统如果使用联合培养）删除独立的内皮细胞。
- 孵育内皮细胞涂，直到它们涵盖100％的模块表面的模块。这通常需要7天左右。
8）代表性的成果：
该模块的外观圆柱时，他们首先从管中删除。如果模块包含嵌入式细胞和/或涂内皮细胞，它们可以承揽量的50％，并制定一个椭圆形（图1）。该模块也将成为更密集，更不透明时，通过光镜（图1）。另外内皮细胞融合模块表面有一个VE -钙粘蛋白的免疫荧光染色（图2）可以看到的紧密连接形成。传质分析表明，模块能够支持不开发一个坏死的核心，由于运输氧气不足，这往往是在较大的组织问题（如模块，大直径D = 1.4的高细胞密度（8 × 10 7细胞/厘米3）毫米）（图3）。
图1：模块制造和收缩。模块的收缩发生在3天以下的人脐静脉内皮细胞C（内皮细胞株），播种的效果明显变小模块的直径和长度（P <0.001）（一）。嵌入式的HepG2细胞均匀分布在制造的时间内模块和保留高可行性（二）。 [活细胞绿色死细胞红] [2010年从Corstorphine改编]
图2：VE -钙粘蛋白免疫荧光染色欧共体RAEC紧细胞后10天，模块表面涂路口。比例尺= 50微米。
图3：马尾松三色染色典型的模块（初始直径0.76毫米）和大（初始直径1.4毫米）模块表现出的氧气扩散的限制影响。 7天以下制造，已经形成了大量的死细胞内的大的模块（右下面板）的核心，离开只差RIM活菌（〜200微米厚）。相反，小模块保留一个统一和高分配的活细胞。 [模块嵌入式HepG2细胞和内皮细胞的涂层。] [2010年从Corstorphine]
图4：（一）HMEC - 1接种于poloxamine -胶原蛋白模块。播种poloxamine胶原模块保留他们的圆柱状，有是有限的细胞附着性能比胶原只有模块1日之后。比例尺= 200微米。 （二）光显微镜图像的PLGA为基础的可生物降解微球的胶原蛋白含有模块。比例尺= 500微米。
图5： 在体外实验的例子。 （一）血管生成的实验：毛细血管般的形态与内皮细胞种子的模块，可以轻松地检测和量化后5天的潜伏期与脂肪来源的干细胞。 （二）共聚焦显微镜图像，其中的S模块上的生活/死亡检测泰宁活细胞，是绿色的，死细胞，是红色的。
图6：包含嵌入式的间质干细胞和内皮细胞表面层的胶原蛋白模块。模块暴露剪应力（〜0.64 DYN /厘米2），7天一个微腔，并开始显示出在接触点的融合。内皮细胞的vWF（棕色）染色，间质干细胞的细胞核呈现蓝色（H＆E）。比例尺=100μm的。
图7：数以百计的含脂肪来源的干细胞（ASC）和涂人微血管内皮细胞的胶原蛋白模块（HMEC）植入老鼠的皮肤下，研究ASC / HMEC体内脂肪再生应用的互动。
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Discussion
我们编造了几个不同的微观组织，使用与不同的细胞类型1-11嵌入式模块。我们已经成功地嵌入原发性心肌细胞，胰岛，脂肪干细胞和间质基质细胞以及一些包括肝癌，NIH 3T3和克隆肝细胞的细胞株。我们涂有几种类型包括大鼠主动脉血管内皮细胞，人脐静脉内皮细胞和人类微血管内皮细胞内皮细胞的模块。模块也已产生胶原蛋白和poloxamine聚合物或含有药物洗脱微球（图4）的混合物。 在体外实验中，一些被证明是兼容模块，包括免疫荧光法，免疫印迹，血管生成，alamar蓝色扩散和生活/死亡检测（图5）。他们也被用于在微流控室（图6），并植入小鼠和大鼠（图7），研究不同类型的细胞和微观组织是如何改造的宿主反应的互动。模块有许多应用，可用于3D组织培养的影响，对细胞的研究在三维构象不同的细胞相互作用的微观组织重塑一个微腔，并在体内重塑微观组织由一台主机使用响应。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
经费是由美国国立卫生研究院（EB 001013），自然科学和工程研究理事会，加拿大和加拿大卫生研究院。我们感谢美联社麦圭根博士和她的专长，帮助模块的开发。Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic tubing PE60 | BD Biosciences | 427416 | Different diameter of tubing can be used to change the diameter of the modules |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200-072 | |
| Purcol acidificed collagen, 3 mg/mL | Cedarlane Labs | 5005-B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 20G needle | BD Biosciences | 305175 | Diameter of the needle needs to be similar to the diameter of the tubing |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 15 mL tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2” x 13” | Cardinal Health | 92713 | |
| 10 ml Wide Tip serological pipet | BD Biosciences | 357504 | |
| 10 ml serological pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml serological pipet | BD Biosciences | 357543 |
References
- Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules. , (2010).
- Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2010).
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