Summary
وهي مغلفة خلق الدقيقة أنسجة الكولاجين باستخدام المواد الهلامية اسطوانية ، تسمى وحدات ، والتي تحتوي على الخلايا المدمجة والتي السطح مع الخلايا البطانية.
Abstract
يصف هذا البروتوكول تصنيع نوع من الأنسجة الصغيرة تسمى الوحدات. نهج الوحدة يولد موحدة ، والأنسجة وقابلة للأوعية دموية. يمكن جعل وحدات من الكولاجين وكذلك غيرها من المواد أو gelable crosslinkable. وهم حوالي 2 ملم وطولها 0.7 ملم وقطرها على تلفيق ولكن تقليص الحجم مع الخلايا المدمجة أو عندما تكون مغلفة وحدات مع الخلايا البطانية. وحدات فردية وصغيرة بما يكفي أن الخلايا المضمنة في حدود انتشار الأوكسجين والمواد المغذية الأخرى ولكن يمكن أن تكون معبأة معا لتكوين وحدات أكبر الأنسجة التي perfusable. هذه الأنسجة هي وحدات في البناء لأنه لا يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من أنواع مختلفة من الخلايا أو المغلفة على الوحدات قبل أن يتم تعبئتها معا لتكوين أنسجة معقدة. هناك ثلاث خطوات رئيسية لجعل وحدات : (1) تحييد خلايا الكولاجين وتضمينها في ذلك ، (2) التبلور الكولاجين في أنبوب والقطع وحدات و (3) وحدات الطلاء مع الخلايا البطانية.
Protocol
1) إعداد الأنابيب
- قطع 2-3 أطوال متر من أنابيب البولي ايثيلين (0.76 ملم x معرف 1،22 مم OD).
- الصفحات إبرة G1 20 في واحدة من نهاية الأنبوب.
- لفائف الأنابيب ووضعها في كيس ختم المحولات الذاتية (7 1 / 2 "× 13"). ينبغي وضع طرفي الأنبوب في نهاية تفض من الحقيبة ، وسجلت في مكان مع الشريط التعقيم الغاز.
- كيس ختم والغاز تعقيم.
2) تحييد الكولاجين
ملاحظة : 1 مل من الكولاجين يملأ حوالي 2 متر من أنابيب البولي ايثيلين.
- مكان المبلغ اللازم من الكولاجين اللازمة لطول المرجوة من الأنابيب في أنبوب مخروطي 15 مل والحفاظ على الجليد.
- إضافة UL 128 من 10X α - MEM لكل مل من الكولاجين في أنبوب ومزيج من قبل مرارا وتكرارا pipetting الحل. ملاحظة : (1) إن الحل يجب أن يتم خلط بدوره الصفراء كما α - MEM في الكولاجين حمض و (2) في محاولة للحد من الفقاعات عند الخلط.
- تحييد الكولاجين بإضافة بيكربونات الصوديوم 0،8 M حتى الكولاجين لديه درجة الحموضة من 7.4. عن التقدير العام للدرجة الحموضة إضافة بيكربونات الصوديوم حتى يتحول الحل الكولاجين الأصفر لون وردي فاتح. ملاحظة : عادة ما يستغرق 3-60 ميكروليتر لكل مل من الكولاجين.
- إبقاء الكولاجين تحييد على الجليد حتى جاهزة للاستخدام مثل الكولاجين وتحييد جل إن لم يكن يحتفظ بها في 4 درجات مئوية.
3) التضمين من خلايا (اختياري)
ملاحظة : اعتمادا على نوع من الخلايا يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من الخلايا بتركيز ما بين 1 مليون خلية لكل مليلتر إلى 20 مليون خلية لكل مليلتر. استخدام الوسيلة اللازمة للخلايا التي تريد تضمينها.
- إزالة وسائل الاعلام من الخلايا ويغسل مع PBS 5 مل.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 3 مل التربسين - EDTA.
- احتضان الخلايا في التربسين - EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام مل 7.
- عدد الخلايا.
- نقل العدد المطلوب من الخلايا لتضمين لأنبوب مخروطي 15 مل.
- بيليه الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح وسائل الاعلام قبالة بيليه الخلية.
- Resuspend الخلايا في تحييد الكولاجين والحفاظ على الجليد.
4) من التبلور الكولاجين
- في خزانة السلامة البيولوجية قطع نهاية مختومة من الحقيبة التي تحتوي على أنابيب البولي إثيلين.
- نعلق حقنة مل 3 إلى الإبرة 20G في النهاية واحدة من الأنابيب باستخدام ملاقط معقمة. إبقاء الأنابيب في الحقيبة.
- إدراج الطرف الآخر من الأنبوب إلى تحييد الكولاجين حتى التلميح في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطية باستخدام ملاقط معقمة. الحفاظ على أنبوب مخروطي على الجليد.
- سحب الكولاجين في أنابيب البولي اثيلين بواسطة المكبس من التراجع المحقنة ببطء.
ملاحظة : إذا لم يتم سحبها الكولاجين في الأنبوب ثم إلى فقاعات سرعان ما سيشكل في الكولاجين. - بعد سحب الكولاجين عن طريق الأنابيب ، وسحب الإبرة 20G من أنابيب وضعت كلا الطرفين مرة أخرى في الحقيبة. اغلاق الشريط الحقيبة.
- احتضان الكيس عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. إذا كان يحتوي على خلايا الكولاجين الوجه ثم كيس على كل 15 دقيقة. ذلك أن الخلايا لا تسوية على جانب واحد من وحدة نمطية.
5) قطع من أنابيب تحتوي على الكولاجين تبلور
- الأوتوكلاف الرؤوس وشفرة للجهاز التقطيع ودرج على عقد الأنابيب.
- تجميع جهاز القطع.
- أنابيب توضع على صينية معقمة أمام قطع الجهاز وتحميل الأنابيب في الجهاز القطع.
- انشاء أنبوب 50 مل تحتوي على 25 مل المخروطية وسائل الإعلام على منفذ للجهاز لجمع القطع وحدات خفض الانتاج.
ملاحظة : استخدام وسائل الإعلام التي تحتوي على وحدات لFBS حتى الكولاجين فقط باعتبارها وحدات منفصلة لا من دون أنابيب FBS في وسائل الإعلام. إذا كانت وحدات تحتوي على خلايا استخدام وسائل الإعلام اللازمة للخلايا المضمنة. إذا كان هناك أي خلايا المضمنة في استخدام وسائل الإعلام وحدات للخلايا بطانة الأوعية الدموية. - ضبط الجهاز القطع لخفض 2 مم أطوال من الأنابيب وقطع الأنابيب.
- احتضان وحدات خفض بنسبة 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في أنبوب مخروطي 50 مل.
6) وحدات إزالة الكولاجين من الأنابيب
- دوامة انبوب مخروطي 50 مل تحتوي على وحدات في الأنابيب لمدة 10 ثانية.
ملاحظة : كن لطيفا عندما يفصل جزءا لا يتجزأ من وحدات ذات كثافة عالية لتجنب الخلية الكسر. - اسمحوا حدات تستقر في قاع الأنبوب. يستغرق حوالي 5 دقائق.
- باستخدام مجموعة واسعة الفم ماصة 10 مل المصلية نقل وحدات لتسوية أنبوب مخروطي 15 مل.
- كرر الخطوات من 6،1-6،3 مرتين.
- انتقل إلى الخطوة 7 إلى معطف مع وحدات خلايا بطانية أو وحدات نقل إلى لوحة الثقافة الأنسجة غير المعالجة.
7) وحدات الطلاء مع الخلايا البطانية
- وحدات تسوية في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي 15 مل مع 5 مل من وسائل الإعلام عن اله جزءا لا يتجزأ من الخلايا.
- إزالة وسائل الاعلام من الخلايا البطانية وتغسل مع PBS 5 مل.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 3 مل التربسين - EDTA.
- احتضان الخلايا في التربسين - EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام مل 7.
- عدد الخلايا. الحاجة 5x10 6 خلايا بطانية لكل مليلتر من وحدات معبأة في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطية.
- بيليه الخلايا في 300 XG لمدة 5 دقائق و 5 مل resuspend في وسائل الاعلام الخلية البطانية.
- أضف 5 مل من وسائل الإعلام التي تحتوي على خلايا بطانة الأوعية الدموية إلى وحدات.
ملاحظة : هذا يعطي نسبة 50:50 من أنواع وسائل الإعلام اللذين وجدناه على العمل من أجل بقاء وظيفة كل من أنواع الخلايا. اختبار استخدام وسيلة شارك في صياغة ثقافة لضمان الصيانة السليمة للالظواهر من أنواع الخلايا اثنين قبل استخدامه. - احتضان وحدات مع الخلايا البطانية على حد سواء بشكل ثابت وحيوي.
- وحدات ثابتة لمزيج الحضانة مع الخلايا البطانية التي كتبها قلب وتعيين أنبوب تستقيم عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تكرار.
- البذور حيوي الخلايا البطانية التي تعصف بلطف الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- كرر حضانة ثابت مرتين.
- وضع وحدات في لوحة غير نسيج الثقافة واحتضان تعامل بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- المكان في اليوم التالي وحدات جديدة في لوحة الثقافة غير الأنسجة تعامل مع وسائل الاعلام الطازج (إذا باستخدام مزيج 50:50 شارك في ثقافة النظام) لإزالة الخلايا البطانية غير مرتبط.
- احتضان الوحدات التي هي المغلفة مع الخلايا البطانية حتى أنها تغطي 100 ٪ من مساحة الوحدات. هذا يستغرق عادة حوالي 7 أيام.
8) الممثل النتائج :
وسوف ننظر في وحدات اسطوانية عندما الأولى هي إزالتها من الأنبوب. إذا كانت جزءا لا يتجزأ من وحدات تحتوي على خلايا و / أو المغلفة مع الخلايا البطانية يمكنهم العقد تصل إلى 50 ٪ في حجم وتطوير شكل بيضاوي الشكل (1). وسوف تصبح أيضا وحدات أكثر كثافة وأكثر مبهمة عند عرضها بواسطة المجهر الضوئي (الشكل 1). أيضا عندما الخلايا البطانية ومتموجة على السطح من وحدات هناك تشكيل منعطفات ضيقة وهو ما يمكن ملاحظته من خلال تلوين المناعي من كادهيرين - VE (الشكل 2). وقد أثبت التحليل الشامل نقل تلك الوحدات هي قادرة على دعم كثافات عالية الخلية (8X10 7 خلية / سم 3) من دون وضع نخرية الأساسية نظرا لعدم كفاية نقل الأكسجين ، والتي غالبا ما تكون مشكلة أكبر في أنسجة الجسم (على سبيل المثال وحدات كبيرة من القطر ، D = 1.4 مم) (الشكل 3).
الشكل 1 : وحدة تصنيع والانكماش. وحدة الانكماش وقعت خلال الأيام الثلاثة التالية HUVEC - C (البطانية خط الخلية) بذر النتائج أصغر بكثير وحدة وطول قطرها (P <0.001) (A). وقد وزعت بشكل موحد جزءا لا يتجزأ من الخلايا ضمن وحدات HepG2 في وقت لتصنيع وجدوى الإبقاء على ارتفاع (B). [الخلايا الحية الخضراء ، الحمراء الخلايا الميتة] [مقتبس من Corstorphine 2010]
الشكل 2 : VE كادهيرين تلطيخ مناعي من التقاطعات EC الخلية مشددة بعد 10 أيام من شركة كهرباء المناطق الريفية حيث المطلي على سطح وحدة نمطية. مقياس بار = 50 ميكرومتر.
الشكل 3 : تلطيخ ماسون وثلاثي الألوان من وحدات نموذجية (0.76 مم الأولي) وحدات كبيرة (1.4 مم الأولي) لشرح تأثير القيود نشر الأوكسجين. سبعة أيام بعد التصنيع ، وكان عدد كبير من الخلايا الميتة تشكلت داخل الأساسية من وحدات كبيرة (لوحة السفلية اليمنى) ، ولم يبق إلا على حافة رقيقة (~ 200μm سميكة) من الخلايا قادرة على البقاء. العكس من ذلك ، الإبقاء على وحدات صغيرة لتوزيع موحد وعال من الخلايا الحية. [الوحدات المدمجة مع HepG2 الخلايا والمغلفة مع الخلايا البطانية.] [من التقاط Corstorphine 2010]
الشكل 4 : (أ) HMEC - 1 المصنفة على poloxamine -- وحدات الكولاجين. بعد رش البذور وحدات poloxamine - الكولاجين الاحتفاظ شكلها اسطواني ، وهناك خصائص المرفق محدودة مقارنة الخلية وحدات فقط الكولاجين 1 يوم. مقياس بار = 200 ميكرومتر. (ب) صورة المجهر ضوء وحدة نمطية تحتوي على الكولاجين PLGA المستندة المجهرية القابلة للتحلل. مقياس بار = 500 ميكرومتر.
الشكل 5 : أمثلة للفحوصات في المختبر. (أ) فحص الأوعية الدموية : يمكن الشعرية مثل التشكيلات على وحدة المصنف مع الخلايا البطانية الكشف بسهولة وكميا بعد 5 أيام من الحضانة مع الخلايا الجذعية المستمدة من دسم. (ب) الصور المجهري متحد البؤر لمقايسة العيش / قتيلا على وحدات فيها لياليtaining للخلايا الحية الخضراء والحمراء هي الخلايا الميتة.
الشكل 6 : الوحدات المدمجة التي تحتوي على الكولاجين الخلايا الجذعية الوسيطة والطبقة السطحية من خلايا بطانة الأوعية الدموية. تعرضت وحدات لإجهاد القص (~ 0.64 DYN / سم 2) لمدة 7 أيام في غرفة ميكروفلويديك والبدء في إظهار الانصهار في نقاط الاتصال. هي ملطخة الخلايا البطانية مع vWF (البني) والوسيطة نوى الخلايا الجذعية تظهر الأزرق (H & E). مقياس شريط = 100μm.
الشكل 7 : مئات من الوحدات التي تحتوي على الكولاجين والخلايا الجذعية المستمدة من دسم (ASC) والمغلفة مع بطانة الاوعية الدموية الدقيقة الخلايا البشرية (HMEC) يتم زرعها تحت جلد الفأر لدراسة ASC / HMEC تفاعل في الجسم الحي للتطبيقات التجدد الدهون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ونحن ملفقة عدة مختلفة الدقيقة الأنسجة باستخدام الوحدات المدمجة مع أنواع مختلفة من الخلايا 11/01. لقد نجحنا في تضمين العضلية الأولية ، والجزر ، والخلايا الجذعية الدهنية وخلايا انسجة الوسيطة وكذلك خطوط الخلية عدة بما في ذلك HepG2 ، NIH 3T3 واستنساخ خلايا الكبد 9. لقد كنا المغلفة الوحدات مع أنواع عدة من الخلايا البطانية بما في ذلك الخلايا البطانية الأورطي الفئران البشرية والخلايا البطانية الوريد السري والخلايا البطانية الإنسان الاوعية الدموية الدقيقة. كما تم الوحدات المنتجة مع مزيج من الكولاجين والبوليمر poloxamine أو التي تحتوي على المخدرات يبلغ حجمه المجهرية (الشكل 4). وقد ثبت في عدة فحوصات المختبر لتكون متوافقة مع وحدات بما في ذلك وصمة عار ، المناعي الغربية ، الأوعية الدموية ، الامار الانتشار زرقاء والمقايسات يعيش / ميت (الشكل 5). كما كانت هذه المادة تستخدم في غرف ميكروفلويديك (الشكل 6) وزرعها في الفئران والجرذان (الشكل 7) لدراسة التفاعل بين أنواع مختلفة من الخلايا والأنسجة كيف يتم تشكيلها الجزئي من الاستجابة المضيف. وحدات لديها العديد من التطبيقات ، ويمكن استخدامها لدراسة تأثير زراعة الأنسجة 3D على الخلايا ، والتفاعل بين الخلايا المختلفة في التشكل 3D ، وإعادة تشكيل الأنسجة الدقيقة في غرفة ميكروفلويديك وإعادة تشكيل الجسم الحي في الدقيقة الأنسجة من قبل المضيف استجابة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم توفير التمويل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (EB 001013) ، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث وكندا ، والكندي معاهد أبحاث الصحة. نشكر الدكتور AP McGuigan لخبرتها في مجال التنمية والمساعدة من وحدات.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic tubing PE60 | BD Biosciences | 427416 | Different diameter of tubing can be used to change the diameter of the modules |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200-072 | |
| Purcol acidificed collagen, 3 mg/mL | Cedarlane Labs | 5005-B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 20G needle | BD Biosciences | 305175 | Diameter of the needle needs to be similar to the diameter of the tubing |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 15 mL tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2” x 13” | Cardinal Health | 92713 | |
| 10 ml Wide Tip serological pipet | BD Biosciences | 357504 | |
| 10 ml serological pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml serological pipet | BD Biosciences | 357543 |
References
- Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules. , (2010).
- Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2010).
- Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats. Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).
- Leung, B. M., Sefton, M. V. A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells. Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).
- McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected]. Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct. J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering. Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design criteria for a modular tissue-engineered construct. Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules. Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).
- Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells. Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).
