Summary
Oprichting van micro-weefsels met behulp van cilindrische collageen gels, genaamd modules, die ingesloten cellen en dat het oppervlak bevatten, is bekleed met endotheelcellen.
Abstract
Dit protocol beschrijft de fabricage van een type micro-weefsels genaamd modules. De module aanpak genereert uniform, schaalbaar en gevasculariseerd weefsel. De modules kunnen worden gemaakt van collageen en andere gelable of verknoopbare materialen. Ze zijn ongeveer 2 mm lang en 0,7 mm in diameter bij de fabricage, maar krimpen in omvang met ingesloten cellen of wanneer de modules zijn bekleed met endotheelcellen. De modules individueel zijn klein genoeg dat de ingebedde cellen binnen de diffusie limiet van zuurstof en andere voedingsstoffen, maar modules kunnen samen verpakt worden om grotere weefsels die zijn perfusable vormen. Deze weefsels zijn modulair opgebouwd, omdat verschillende celtypen kunnen worden ingebed in of gecoat op de modules voordat ze worden samen verpakt om complexe weefsels te vormen. Er zijn drie belangrijke stappen voor het maken van de modules: (1) het neutraliseren van het collageen en de inbedding in de cellen, (2) geleermiddelen het collageen in de buis en het snijden van de modules en (3) het bekleden van de modules met endotheelcellen.
Protocol
1) Bereiding van Tubing
- Knip 2 tot 3 m lengte van polyethyleen buis (0,76 mm ID x 1,22 mm OD).
- Draad een 20 G1 naald in een uiteinde van de slang.
- Spoel de slang en plaats in converters een zelf-seal zakje (7 1 / 2 "x 13"). De twee uiteinden van de buizen moeten worden geplaatst aan het einde van de onverharde zak en tape op zijn plaats met gas sterilisatie tape.
- Seal zak en gas te steriliseren.
2) neutralisatie van Collageen
Let op: 1 ml van collageen vult ongeveer 2 m van polyethyleen buizen.
- Leg de benodigde hoeveelheid collageen die nodig is voor de gewenste lengte van de slang in een 15 ml conische buis en blijf op ijs.
- Voeg 128 uL van 10x α-MEM per ml van collageen aan de buis en meng door herhaaldelijk pipetteren de oplossing. Let op: (1) De oplossing moet geel als de α-MEM wordt gemengd om te zetten in de aangezuurde collageen en (2) proberen te bellen minimaliseren bij het mengen.
- Neutraliseer het collageen door het toevoegen van 0,8 M natriumbicarbonaat totdat het collageen heeft een pH van 7,4. Voor een algemene schatting van de pH-waarde toe te voegen natriumbicarbonaat tot de gele collageen-oplossing maakt een licht roze kleur. Opmerking: Het duurt meestal 30 tot 60 pi per elke mL van collageen.
- Houden geneutraliseerd collageen op ijs totdat u ze gaat gebruiken als de geneutraliseerde collageen gel indien niet bewaard op 4 ° C.
3) Inbedding van cellen (optioneel)
Opmerking: Afhankelijk van het celtype de cellen kan worden ingebed in een concentratie van tussen de 1 miljoen cellen per ml naar 20 miljoen cellen per ml. Gebruik het medium die nodig zijn voor de cellen die u wilt insluiten.
- Verwijder het afdrukmateriaal uit cellen en was met 5 ml PBS.
- Verwijder de PBS en voeg 3 ml trypsine-EDTA.
- Incubeer de cellen in trypsine-EDTA voor 5 min op 37 ° C.
- Resuspendeer cellen in 7 ml media.
- Tellen cellen.
- Breng de benodigde aantal cellen voor het inbedden van een 15 ml conische buis.
- Pellet de cellen op 300 xg gedurende 5 minuten.
- Aspireren media uit de cel pellet.
- Resuspendeer de cellen in de geneutraliseerde collageen en te houden op het ijs.
4) Gelling van Collageen
- In een biologisch veiligheidskabinet afgesneden van de verzegelde einde van de zak met de polyethyleen buis.
- Bevestig een 3 ml spuit aan de 20G naald in de ene uiteinde van de slang met behulp van gesteriliseerde pincet. Houd de slang in de zak.
- Steek het andere uiteinde van de slang in het geneutraliseerde collageen totdat de punt is aan de onderkant van de conische buis met behulp van steriele pincet. Houd de conische buis op ijs.
- Trek het collageen in de polyethyleen buizen door het terugtrekken van de zuiger van de spuit langzaam.
Opmerking: Als het collageen wordt getrokken in de slang om snel te bellen dan zal vormen in het collageen. - Na het trekken van het collageen door de slang, trek de 20G naald uit buizen en weer beide uiteinden in de zak. Tape de zak dicht.
- Incubeer de zak bij 37 ° C gedurende 60 minuten. Als het collageen bevat cellen dan draait u de tas over elk 15 minuten. zodat de cellen niet vestigen aan de ene kant van de module.
5) Het snijden van catheter met de Gegeleerde Collageen
- Autoclaaf headers en blad voor de snij-inrichting en de lade naar buizen vast te houden.
- Monteer de snij-inrichting.
- Plaats buis in een steriele bak voor snij-inrichting en laad de slang in het snij-apparaat.
- Opzetten van een 50 ml conische buis met 25 ml van de media bij de uitlaat van de snij-inrichting om de snede modules te verzamelen.
Opmerking: Gebruik media die FBS zelfs voor collageen-only modules als de modules niet los van de slang, zonder FBS in de media. Als de modules bevatten cellen gebruiken de media die nodig zijn voor de ingesloten cellen. Als er geen ingebed cellen in de modules gebruik maken van de media voor de endotheelcellen. - Stel het snij-inrichting tot 2 mm lengte van de slang snijden en de slang te snijden.
- Incubeer gesneden modules bij 37 ° C gedurende 60 min in de 50 ml conische buis.
6) Het verwijderen van collageen Modules van Tubing
- Vortex 50 ml conische buis bevat modules in de buizen voor 10 sec.
Let op: Wees voorzichtig bij het scheiden van modules ingebouwd met een hoge celdichtheid om breuk te voorkomen. - Laat modules naar de bodem van de buis. Duurt ongeveer 5 minuten.
- Met behulp van een brede mond 10 ml serologische pipet overdracht de vaste modules om een 15 ml conische buis.
- Herhaal de stappen 6,1 tot 6,3 keer.
- Ga naar stap 7 te laag modules met endotheelcellen of overdracht modules om een niet-weefselkweek behandeld plaat.
7) Coaten van de modules met endotheliale cellen
- Vestigen modules in de bodem van een 15 ml conische buis met 5 ml van media voor ee embedded cellen.
- Verwijder het afdrukmateriaal uit de endotheelcellen en was met 5 ml PBS.
- Verwijder de PBS en voeg 3 ml trypsine-EDTA.
- Incubeer de cellen in trypsine-EDTA voor 5 min op 37 ° C.
- Resuspendeer cellen in 7 ml media.
- Tellen cellen. Need 5x10 6 endotheliale cellen per ml verpakt modules op de bodem van de conische buis.
- Pellet de cellen op 300 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer in 5 ml endotheelcellen media.
- Voeg de 5 ml van de media die endotheelcellen aan de modules.
Opmerking: Dit geeft een 50:50 verhouding van de twee media types die we hebben gevonden om te werken voor de overleving en functie van beide celtypen. Test het gebruik van een co-cultuur medium geformuleerd om goed onderhoud van fenotypen van de twee cellen typen zorgen alvorens het te gebruiken. - Incubeer de modules met de endotheliale cellen zowel statisch en dynamisch.
- Voor statische incubatie mix modules met endotheliale cellen door inversie en rechtop zet de buis bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Herhalen.
- Dynamisch zaad van de endotheelcellen door zachtjes schommelen van de buis bij 37 ° C gedurende 60 minuten.
- Tweemaal herhalen statische incubatie.
- Plaats de modules in een niet-weefselkweek behandelde plaat en 's nachts bij 37 ° C. incubeer
- De volgende dag plaats van de modules in een nieuwe niet-weefselkweek behandeld plaat met vers medium (50:50 mix bij gebruik van co-cultuur systeem) niet gehecht endotheliale cellen te verwijderen.
- Incubeer modules die zijn gecoat met endotheliale cellen totdat ze 100% van het oppervlak van de modules. Dit duurt meestal ongeveer 7 dagen.
8) representatieve resultaten:
De modules zal er cilindrische wanneer ze voor het eerst worden verwijderd uit de tube. Als de modules bevatten ingebedde cellen en / of zijn bedekt met endotheliale cellen kunnen ze maximaal contract tot 50% in volume en de ontwikkeling van een ovale vorm (figuur 1). De modules zal ook dichter en meer ondoorzichtig wanneer bekeken door lichtmicroscopie (figuur 1). Ook als de endotheelcellen zijn samenvloeiende op het oppervlak van de modules is er een formatie van tight junctions, die kan worden gezien door immunofluorescentiekleuring van VE-cadherine (figuur 2). Massa-overdracht analyse heeft aangetoond dat de modules zijn geschikt voor hoge dichtheden cel (8x10 7 cellen / cm 3) zonder het ontwikkelen van een necrotische kern als gevolg van onvoldoende zuurstof vervoeren, die vaak problematisch is in grotere weefsels (bv. modules van grote diameter, D = 1,4 mm) (Figuur 3).
Figuur 1: Module fabricatie en contractie. Module krimp opgetreden tijdens de drie dagen na HUVEC-C (endotheel cellijn) seeding resultaten aanzienlijk kleiner module diameter en lengte (p <0,001) (A). Embedded HepG2 cellen werden gelijkmatig verdeeld binnen de modules op het moment van fabricage en behield een hoge levensvatbaarheid (B). [Live cellen groen; dode cellen red] [aangepast van Corstorphine 2010]
Figuur 2: VE-cadherine immunofluorescentie kleuring van EG-tight junctions cel 10 dagen na RAEC waar coating op het oppervlak van een module. Schaalbalk = 50 pm.
Figuur 3: trichroom vlekken Masson's van typische modules (0,76 mm initiële diameter) en grote modules (1,4 mm initiële diameter) tonen het effect van zuurstof diffusie beperkingen. Zeven dagen na de fabricage, had een groot aantal dode cellen gevormd binnen de kern van de grote modules (onderste rechter paneel), waardoor er slechts een dunne rand (~ 200μm dik) van levensvatbare cellen. Omgekeerd, de kleine modules behouden een uniforme en hoge distributie van levende cellen. [Modules ingebed met HepG2 cellen en bekleed met endotheelcellen.] [Genomen uit Corstorphine 2010]
Figuur 4: (A) HMEC-1 gezaaid op poloxamine - collageen modules. Na dag 1 van het zaaien poloxamine-collageen modules behouden hun cilindrische vorm en is er beperkte celhechting eigenschappen in vergelijking met collageen alleen modules. Schaalbalk = 200 micrometer. (B) licht microscoop beeld van een collageen-module met PLGA-op basis van biologisch afbreekbaar microsferen. Schaalbalk = 500 pm.
Figuur 5: Voorbeelden van in vitro testen. (A) Angiogenese test: capillaire-achtige formaties op de module gezaaid met endotheliale cellen kunnen gemakkelijk worden opgespoord en gekwantificeerd na 5 dagen incubatie met vet-afgeleide stamcellen. (B) confocale microscopie beelden van een levende / dode test op modules waar de ste handhaven voor de levende cellen is groen en voor de dode cellen is rood.
Figuur 6: Collageen modules met ingesloten mesenchymale stamcellen en een oppervlaktelaag van endotheelcellen. Modules werden blootgesteld aan shear stress (~ 0,64 dyn / cm 2) voor 7 dagen in een microfluïdische kamer en beginnen te fusion zien op punten van contact. Endotheelcellen zijn gekleurd met vWF (bruin) en de mesenchymale stamcellen kernen verschijnen blauw (H & E). Schaalbalk = 100 urn.
Figuur 7: Honderden collageen modules met adipose-stamcellen (ASC) en bedekt met Human microvasculaire endotheelcellen (HMEC) worden geïmplanteerd onder de huid van muizen tot ASC / HMEC interactie in vivo regeneratie voor vet toepassingen te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben verzonnen verschillende micro-weefsels met behulp van modules ingebed met verschillende celtypen 1-11. We hebben met succes embedded primaire cardiomyocyten, eilandjes, adipose mesenchymale stamcellen en stromale cellen evenals verschillende cellijnen waaronder HepG2, NIH 3T3 en kloon 9 levercellen. We hebben bekleed de modules met verschillende soorten endotheelcellen waaronder rat aorta endotheel-cellen, humane navelstreng endotheel cellen en humane microvasculaire endotheelcellen. Modules zijn ook gemaakt met een mengsel van collageen en een poloxamine polymeer of met drug-eluting microsferen (figuur 4). Verschillende in vitro testen hebben aangetoond dat ze compatibel met modules waaronder immunofluorescentie, western blot, angiogenese, Alamar blauw proliferatie en leven / dood assays (figuur 5). Ze zijn ook gebruikt in microfluïdische kamers (Figuur 6) en geïmplanteerd in muizen en ratten (figuur 7) om de interactie tussen de verschillende celtypen en hoe de micro-weefsels worden gerenoveerd door de gastheer respons onderzoek. Modules hebben vele toepassingen en kan worden gebruikt voor de studie van het effect van 3D-weefselkweek op cellen, interactie van de verschillende cellen in een 3D-conformatie, herinrichting van micro-weefsels in een microfluïdische kamer en in vivo remodellering van micro-weefsels door een gastheer reactie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De financiering werd verstrekt door de National Institutes of Health (EB 001013), Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada en de Canadese Institutes of Health Research. Wij danken dr. AP McGuigan voor haar expertise en te helpen in de ontwikkeling van modules.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic tubing PE60 | BD Biosciences | 427416 | Different diameter of tubing can be used to change the diameter of the modules |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200-072 | |
| Purcol acidificed collagen, 3 mg/mL | Cedarlane Labs | 5005-B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 20G needle | BD Biosciences | 305175 | Diameter of the needle needs to be similar to the diameter of the tubing |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 15 mL tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2” x 13” | Cardinal Health | 92713 | |
| 10 ml Wide Tip serological pipet | BD Biosciences | 357504 | |
| 10 ml serological pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml serological pipet | BD Biosciences | 357543 |
References
- Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules. , (2010).
- Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2010).
- Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats. Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).
- Leung, B. M., Sefton, M. V. A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells. Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).
- McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected]. Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct. J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering. Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design criteria for a modular tissue-engineered construct. Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules. Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).
- Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells. Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).
