Summary
Création de micro-tissus en utilisant des gels de collagène cylindriques, appelés modules, qui contiennent des cellules embarqués et dont la surface est recouverte de cellules endothéliales.
Abstract
Ce protocole décrit la fabrication d'un type de micro-tissus appelés modules. L'approche module génère uniforme, les tissus extensibles et vascularisé. Les modules peuvent être faites de collagène ainsi que d'autres matériaux gélifiable ou réticulables. Ils sont environ 2 mm de longueur et 0,7 mm de diamètre à la fabrication, mais diminuer en taille avec des cellules ou lorsque les modules sont recouverts avec des cellules endothéliales. Les modules individuellement sont suffisamment petits pour que les cellules sont intégrées dans la limite de diffusion de l'oxygène et autres nutriments, mais les modules peuvent être emballés ensemble pour former de grands tissus qui sont perfusable. Ces tissus sont de conception modulaire, car différents types de cellules peuvent être intégrés dans ou enduit sur les modules avant qu'ils ne soient emballés ensemble pour former des tissus complexes. Il ya trois étapes principales pour rendre les modules: (1) la neutralisation du collagène et d'incorporation des cellules en elle, (2) gélification du collagène dans le tube et couper les modules et (3) revêtement des modules avec des cellules endothéliales.
Protocol
1) Préparation des tubes
- Couper 2 à 3 m de longueur de tuyaux en polyéthylène (0,76 mm ID x 1,22 mm de diamètre extérieur).
- Enfilez une aiguille 20 G1 à une extrémité du tube.
- Enrouler le tube et le placer dans une auto-joint convertisseurs poche (7 1 / 2 "x 13"). Les deux extrémités de la tubulure doit être placé à la fin descellé du sac et scellés en place avec du ruban stérilisation au gaz.
- Sceller le sac et le gaz stériliser.
2) Neutralisation de collagène
Note: 1 ml de collagène remplit environ 2 m de tuyaux en polyéthylène.
- Placer la quantité nécessaire de collagène nécessaire à la longueur désirée du tube dans un tube de 15 ml conique et de garder sur la glace.
- Ajouter 128 ul de 10x α-MEM par ml de collagène dans le tube et mélanger en pipetant plusieurs reprises la solution. Note: (1) La solution doit virer au jaune comme le α-MEM est mélangé dans le collagène acidifiés et (2) essayer de minimiser les bulles lors du mélange.
- Neutraliser le collagène en ajoutant 0,8 M bicarbonate de sodium jusqu'à ce que le collagène a un pH de 7,4. Pour une estimation générale du bicarbonate de sodium ajouter du pH jusqu'à ce que la solution de collagène jaune vire au rose pâle. Nota: Il faut généralement de 30 à 60 pi pour chaque ml de collagène.
- Gardez collagène neutralisé sur la glace jusqu'au moment de l'utiliser comme le collagène neutralisée sera un gel s'il n'est pas conservé à 4 ° C.
3) Intégrer des cellules (en option)
Remarque: En fonction du type cellulaire, les cellules peuvent être intégrées à une concentration comprise entre 1 million de cellules par mL à 20 millions de cellules par ml. Utilisez le support requis pour les cellules que vous souhaitez intégrer.
- Retirez le support à partir des cellules et laver avec 5 ml de PBS.
- Retirer du PBS et ajouter 3 ml de trypsine-EDTA.
- Incuber les cellules dans de la trypsine-EDTA pendant 5 min à 37 ° C.
- Resuspendre les cellules dans les médias ml 7.
- Compter les cellules.
- Transférer le nombre requis de cellules pour l'intégration à un tube de 15 ml conique.
- Pellet les cellules à 300 xg pendant 5 min.
- Aspirer les médias hors du culot cellulaire.
- Resuspendre les cellules dans le collagène neutralisé et de garder sur la glace.
4) Gélification du collagène
- Dans une enceinte de sécurité biologique couper l'extrémité scellée du sac contenant les tuyaux en polyéthylène.
- Attacher une seringue de 3 ml à l'aiguille 20G dans l'une des extrémités du tube en utilisant une pince à épiler stérilisée. Gardez le tuyau dans le sac.
- Insérez l'autre extrémité du tuyau dans le collagène neutralisé jusqu'à la pointe est au fond du tube conique en utilisant une pince à épiler stérilisée. Garder le tube conique sur la glace.
- Tirez le collagène dans les tuyaux en polyéthylène en rétractant le piston de la seringue lentement.
Remarque: Si le collagène est tiré dans le tube à bulles rapidement puis se forme dans le collagène. - Après avoir tiré le collagène par le tube, retirez l'aiguille 20G sur de tubes et de mettre les deux extrémités dans le sac. Tape le sac fermé.
- Incuber le sac à 37 ° C pendant 60 min. Si le collagène contient des cellules, puis retournez le sac sur toutes les 15 min. afin que les cellules ne sont pas réglées sur un côté du module.
5) Découpe de tubes contenant du collagène gélifié
- Têtes autoclave et la lame pour le dispositif de coupe et le bac à tenir tube.
- Assemblez le dispositif de coupe.
- Placer dans un tube de plateau stérile en face du dispositif de coupe et de charger le tube dans le dispositif de coupe.
- Mettre en place un tube conique de 50 ml contenant 25 ml de médias à la sortie du dispositif de coupe pour recueillir les modules de coupe.
Remarque: Utilisez les médias contenant FBS même pour le collagène seule modules comme les modules ne se séparent pas de la tubulure sans FBS dans les médias. Si les modules contiennent des cellules utiliser le support requis pour les cellules embarquées. S'il n'ya pas de cellules intégrées dans les modules utilisent les médias pour les cellules endothéliales. - Réglez le dispositif de coupe pour couper 2 mm de longueur de tube et couper le tuyau.
- Incuber coupé modules à 37 ° C pendant 60 min dans le tube conique de 50 ml.
6) Suppression des modules du collagène à partir de tubes
- Vortex du tube conique de 50 ml contenant des modules dans le tube pendant 10 sec.
Note: Soyez doux lorsque la séparation avec les modules intégrés à haute densité cellulaire pour éviter les bris. - Laissez les modules se déposent au fond du tube. Cela prend environ 5 min.
- En utilisant une large bouche pipette de 10 ml sérologique transférer les modules installés dans un tube de 15 ml conique.
- Répétez les étapes 6.1 à 6.3 fois.
- Passez à l'étape 7 à des modules de revêtement avec des cellules endothéliales ou des modules de transfert à une plaque de culture tissulaire non traitée.
7) Revêtement des modules avec des cellules endothéliales
- Settle modules dans le fond d'un tube 15 ml conique avec 5 mL de médias pour ee intégré cellules.
- Retirez le support à partir des cellules endothéliales et les laver avec 5 ml de PBS.
- Retirer du PBS et ajouter 3 ml de trypsine-EDTA.
- Incuber les cellules dans de la trypsine-EDTA pendant 5 min à 37 ° C.
- Resuspendre les cellules dans les médias ml 7.
- Compter les cellules. Besoin 5x10 6 cellules endothéliales par ml de modules emballé au fond du tube conique.
- Pellet les cellules à 300 xg pendant 5 min et remettre en suspension dans 5 ml de cellules endothéliales des médias.
- Ajouter les 5 ml du support contenant les cellules endothéliales des modules.
Note: Ceci donne un ratio de 50:50 de la deux types de média que nous avons trouvé à travailler pour la survie et la fonction des deux types de cellules. Test de l'utilisation d'un moyen de co-culture formulés pour assurer le bon entretien des phénotypes des cellules deux types avant de l'utiliser. - Incuber les modules avec les cellules endothéliales à la fois statique et dynamique.
- Pour statiques modules mélange d'incubation avec des cellules endothéliales par inversion et placer le tube en position verticale à 37 ° C pendant 15 min. Répéter.
- Dynamiquement semences les cellules endothéliales en secouant délicatement le tube à 37 ° C pendant 60 min.
- Répétez incubation statique à deux reprises.
- Placez les modules dans une plaque de culture de tissus non traités et incuber une nuit à 37 ° C.
- Le lieu le lendemain des modules dans une plaque de culture non de nouveaux tissus traités par du milieu frais (mélange 50:50 si vous utilisez le système de co-culture) pour enlever les seules cellules endothéliales.
- Incuber les modules qui sont revêtus de cellules endothéliales jusqu'à ce qu'ils couvrent 100% de la surface des modules. Cela prend habituellement environ 7 jours.
8) Les résultats représentatifs:
Les modules cylindriques se penchera la première fois qu'ils sont retirés du tube. Si les modules contiennent des cellules intégrées et / ou sont revêtues de cellules endothéliales, ils peuvent contracter jusqu'à 50% en volume et de développer une forme ovale (figure 1). Les modules seront également devenue plus dense et plus opaque lorsqu'il est vu par microscopie optique (figure 1). Aussi, quand les cellules endothéliales sont confluentes sur la surface des modules il ya une formation de jonctions serrées qui peuvent être vus par immunofluorescence de la VE-cadhérine (Figure 2). L'analyse de transfert de masse a montré que les modules sont capables de supporter de fortes densités cellulaires (8x10 7 cellules / cm 3) sans développer un noyau nécrotique due à transporter l'oxygène insuffisante, ce qui est souvent problématique dans les grandes tissus (par exemple des modules de grand diamètre, D = 1,4 mm) (figure 3).
Figure 1: Module de fabrication et de contraction. Module de contraction s'est produite pendant les trois jours suivants HUVEC-C (ligne de cellules endothéliales) ensemencement des résultats de diamètre nettement plus petit module de et de la longueur (p <0,001) (A). Embarqué cellules HepG2 ont été uniformément réparties dans les modules au moment de la fabrication et conservé une viabilité élevée (B). [Live cellules vertes; les cellules mortes rouge] [adapté de Corstorphine 2010]
Figure 2: VE-cadhérine en immunofluorescence des jonctions cellulaires serrées CE 10 jours après RAEC où enduit sur la surface d'un module. Barre d'échelle = 50 microns.
Figure 3: coloration trichrome de Masson de modules typiques (0,76 mm de diamètre initial) et des modules de grande taille (1,4 mm de diamètre initial) démontrent l'effet des restrictions de diffusion d'oxygène. Sept jours après la fabrication, un grand nombre de cellules mortes avaient formé dans le noyau des modules de grande taille (panneau en bas à droite), ne laissant qu'une mince bordure (~ 200μm d'épaisseur) de cellules viables. Inversement, les petits modules conservé une distribution uniforme et élevé de cellules vivantes. [Modules intégrés aux cellules HepG2 et recouvert de cellules endothéliales.] [Tiré de Corstorphine 2010]
Figure 4: (A) HMEC-1 ensemencées sur poloxamine - Modules de collagène. Après une journée de l'ensemencement des modules poloxamine-collagène conservent leur forme cylindrique et il est limité propriétés de fixation cellulaire par rapport à des modules de collagène seulement. Barre d'échelle = 200 pm. (B) image par microscopie lumineuse d'un module de collagène contenant PLGA basée sur des microsphères biodégradables. Barre d'échelle = 500 pm.
Figure 5: Exemples d'essais in vitro. Dosage de l'angiogenèse (A): capillaire comme des formations sur le module ensemencées avec des cellules endothéliales peuvent être facilement détectés et quantifiés après 5 jours d'incubation avec des cellules souches adipeuses. (B) des images de microscopie confocale d'un dosage de vivants / morts sur les modules où le scontenant des cellules vivantes est vert et pour les cellules mortes est rouge.
Figure 6: Les modules intégrés de collagène contenant les cellules souches mésenchymateuses et une couche de surface des cellules endothéliales. Les modules ont été exposés à un stress de cisaillement (~ 0,64 dyn / cm 2) pendant 7 jours dans une chambre microfluidique et commencent à montrer de fusion à des points de contact. Les cellules endothéliales sont colorées avec le vWF (marron) et mésenchymateuses noyaux de cellules souches apparaissent en bleu (H & E). Barre d'échelle = 100 microns.
Figure 7: des centaines de modules de collagène contenant des cellules souches adipeuses (ASC) et recouvert de cellules endothéliales microvasculaires humaines (HMEC) sont implantés sous la peau de souris pour étudier ASC / HMEC interaction in vivo pour les applications de la régénération de graisse.
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Discussion
Nous avons fabriqué plusieurs tissus différents de micro-utilisant les modules intégrés aux différents types de cellules 1-11. Nous avons réussi à intégré les cardiomyocytes primaires, les îlots, les cellules souches adipeuses et les cellules stromales mésenchymateuses ainsi que plusieurs lignées cellulaires, y compris HepG2, NIH 3T3 et clone 9 cellules du foie. Nous avons recouvert les modules avec plusieurs types de cellules endothéliales aortiques de rat dont les cellules endothéliales, les cellules humaines endothéliales de veine ombilicale humaine et de cellules endothéliales microvasculaires. Les modules ont également été produits avec un mélange de collagène et d'un polymère poloxamine ou contenant des microsphères à élution médicamenteuse (figure 4). Plusieurs études in vitro ont montré pour être compatible avec les modules dont l'immunofluorescence, Western Blot, l'angiogenèse, la prolifération et bleu d'Alamar dosages vivants / morts (figure 5). Ils ont également été utilisés dans les chambres microfluidiques (figure 6) et implantées dans des souris et des rats (figure 7) pour étudier l'interaction entre les différents types de cellules et comment les tissus des micro-sont remodelés par la réponse de l'hôte. Les modules ont de nombreuses applications et peut être utilisé pour l'étude de l'effet de la culture de tissus en 3D sur les cellules, l'interaction des différentes cellules dans une conformation 3D, le remodelage de la micro-tissus dans une chambre microfluidique et dans le remodelage in vivo de micro-tissus par un hôte de réponse.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Le financement a été fourni par le National Institutes of Health (EB 001 013), en sciences naturelles et en génie du Canada et les Instituts canadiens de recherche en santé. Nous remercions le Dr AP McGuigan pour son expertise et son aide dans l'élaboration de modules.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic tubing PE60 | BD Biosciences | 427416 | Different diameter of tubing can be used to change the diameter of the modules |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200-072 | |
| Purcol acidificed collagen, 3 mg/mL | Cedarlane Labs | 5005-B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 20G needle | BD Biosciences | 305175 | Diameter of the needle needs to be similar to the diameter of the tubing |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 15 mL tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2” x 13” | Cardinal Health | 92713 | |
| 10 ml Wide Tip serological pipet | BD Biosciences | 357504 | |
| 10 ml serological pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml serological pipet | BD Biosciences | 357543 |
References
- Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules. , (2010).
- Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2010).
- Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats. Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).
- Leung, B. M., Sefton, M. V. A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells. Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).
- McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected]. Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct. J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering. Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design criteria for a modular tissue-engineered construct. Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules. Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).
- Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells. Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).
