Summary
सूक्ष्म ऊतकों बेलनाकार कोलेजन जैल, मॉड्यूल कहा जाता है, कि एम्बेडेड कोशिकाओं और सतह जो होते हैं का उपयोग कर के निर्माण endothelial कोशिकाओं के साथ लेपित है.
Abstract
इस प्रोटोकॉल मॉड्यूल बुलाया सूक्ष्म ऊतकों की एक प्रकार के निर्माण का वर्णन करता है. मॉड्यूल दृष्टिकोण वर्दी, स्केलेबल और vascularized ऊतकों उत्पन्न करता है. मॉड्यूल कोलेजन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य gelable या crosslinkable सामग्री का बनाया जा सकता है. वे निर्माण पर व्यास में लंबाई में लगभग 2 मिमी और 0.7 मिमी हैं, लेकिन एम्बेडेड कोशिकाओं या जब मॉड्यूल endothelial कोशिकाओं के साथ लेपित हैं के साथ आकार में छोटा है. व्यक्तिगत मॉड्यूल काफी छोटे हैं कि एम्बेडेड कोशिकाओं को ऑक्सीजन और अन्य पोषक तत्वों के प्रसार सीमा के भीतर हैं, लेकिन मॉड्यूल के साथ पैक किया जा सकता है बड़ा ऊतकों कि perfusable हैं फार्म. इन ऊतकों के निर्माण में मॉड्यूलर हैं क्योंकि विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में एम्बेडेड जा सकता है या मॉड्यूल लेपित पर इससे पहले कि वे एक साथ पैक कर रहे हैं करने के लिए जटिल ऊतकों फार्म हैं. वहाँ तीन मुख्य मॉड्यूल बनाने के कदम उठाए हैं: (1) कोलेजन को निष्क्रिय करने और कोशिकाओं में एम्बेड, (2) ट्यूब में कोलेजन बीच बढ़िया तालमेल और endothelial कोशिकाओं के साथ और (3) कोटिंग मॉड्यूल मॉड्यूल काटने.
Protocol
1) टयूबिंग की तैयारी
- कट polyethylene टयूबिंग की 2 से 3 मीटर लंबाई (0.76 मिमी आईडी x 1.22 मिमी आयुध डिपो).
- टयूबिंग की एक अंत में एक 20 G1 सुई धागा.
- तार और एक कन्वर्टर्स आत्म सील पाउच (7 1 / 2 "x 13") में टयूबिंग जगह. टयूबिंग की दो सिरों बैग के unsealed अंत में रखा जाना चाहिए और गैस नसबंदी टेप के साथ जगह में टेप.
- सील बैग और गैस बाँझ.
कोलेजन का 2) निराकरण
नोट: कोलेजन की एक मिलीलीटर पॉलीथीन टयूबिंग के बारे में 2 मीटर भरता है.
- कोलेजन के लिए आवश्यक राशि टयूबिंग की एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में वांछित लंबाई के लिए आवश्यक प्लेस और बर्फ पर रख.
- 128 की उल जोड़ें 10x α-सदस्य प्रति एमएल ट्यूब और समाधान pipetting द्वारा बार - बार मिश्रण के लिए कोलेजन की. नोट: (1) समाधान पीले α-सदस्य के रूप में मिलाया जाता है acidified कोलेजन में बारी और (2) बुलबुले कम से कम जब मिश्रण की कोशिश करनी चाहिए.
- 0.8 एम सोडियम बिकारबोनिट जोड़ने जब तक कोलेजन 7.4 का एक pH है कोलेजन बेअसर. पीएच जोड़ने के सोडियम बिकारबोनिट का एक सामान्य अनुमान के लिए जब तक पीले कोलेजन समाधान एक हल्के गुलाबी रंग बदल जाता है. नोट: यह आमतौर पर कोलेजन के प्रत्येक एमएल प्रति 30 से 60 μL लेता है.
- बर्फ पर neutralized कोलेजन रखें निष्प्रभावी कोलेजन के रूप में उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक जेल नहीं तो 4 में रखा जाएगा डिग्री सेल्सियस
3) कोशिकाओं के एम्बेडिंग (वैकल्पिक)
नोट: सेल के प्रकार पर निर्भर करता है कोशिकाओं एमएल प्रति 20 मिलियन कोशिकाओं को 1 मिलियन प्रति एमएल कोशिकाओं के बीच की एकाग्रता में एम्बेड किया जा सकता है. कोशिकाओं है कि आप एम्बेड करना चाहते हैं के लिए आवश्यक माध्यम का उपयोग करें.
- कोशिकाओं से मीडिया निकालें और 5 एमएल पीबीएस के साथ धोने.
- पीबीएस निकालें और 3 trypsin EDTA एमएल जोड़ने.
- 5 मिनट के लिए 37 पर trypsin - EDTA में कोशिकाओं को सेते डिग्री सेल्सियस
- 7 एमएल मीडिया में कोशिकाओं Resuspend.
- कोशिकाओं की गणना.
- कक्षों की अपेक्षित संख्या 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को एम्बेड करने के लिए स्थानांतरण.
- गोली 5 मिनट के लिए 300 XG कोशिकाओं.
- मीडिया सेल गोली बंद Aspirate.
- Resuspend निष्प्रभावी कोलेजन में कोशिकाओं और बर्फ पर रख.
4) कोलेजन के gelling
- एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में बंद टयूबिंग युक्त पॉलीथीन बैग सील अंत में कटौती.
- 3 मिलीलीटर सिरिंज 20G सुई निष्फल चिमटी का उपयोग कर टयूबिंग की एक अंत में संलग्न. बैग में टयूबिंग रखें.
- निष्प्रभावी कोलेजन में टयूबिंग के दूसरे छोर सम्मिलित तक टिप शंक्वाकार निष्फल चिमटी का उपयोग कर ट्यूब के नीचे है. बर्फ पर शंक्वाकार ट्यूब रखें.
- पॉलीथीन टयूबिंग में धीरे सिरिंज सवार retracting द्वारा कोलेजन खींचो.
नोट: यदि कोलेजन टयूबिंग में खींच लिया है तो जल्दी बुलबुले कोलेजन में फार्म जाएगा. - टयूबिंग के माध्यम से कोलेजन खींच के बाद, टयूबिंग के बाहर 20G सुई खींचने के लिए और दोनों सिरों बैग में वापस डाल दिया. टेप बैग बंद.
- 37 डिग्री सेल्सियस 60 मिनट के लिए पर बैग सेते हैं. यदि कोलेजन सेल शामिल हैं तो हर 15 मिनट पर बैग फ्लिप. इतना है कि कोशिकाओं मॉड्यूल के एक तरफ करने के लिए व्यवस्थित नहीं है.
5) टयूबिंग की काटना gelled कोलेजन युक्त
- आटोक्लेव हेडर और ब्लेड काटने डिवाइस और टयूबिंग पकड़ ट्रे के लिए.
- काटने डिवाइस इकट्ठा.
- उपकरण काटने के सामने एक बाँझ ट्रे में रखें टयूबिंग और काटने डिवाइस में टयूबिंग लोड.
- 50 एमएल शंक्वाकार काटने डिवाइस के आउटलेट पर मीडिया के 25 एमएल युक्त कटौती मॉड्यूल इकट्ठा ट्यूब सेट.
नोट: का प्रयोग करें FBS भी कोलेजन केवल मॉड्यूल के लिए मॉड्यूल के रूप में मीडिया में FBS बिना टयूबिंग से अलग नहीं युक्त मीडिया. यदि मॉड्यूल होते कोशिकाओं एम्बेडेड कोशिकाओं के लिए आवश्यक मीडिया का उपयोग करें. अगर वहाँ मॉड्यूल में कोई एम्बेडेड कोशिकाओं endothelial कोशिकाओं के लिए मीडिया का उपयोग करें. - काटने डिवाइस को सेट करने के लिए टयूबिंग की 2 मिमी लंबाई में कटौती और टयूबिंग कटौती.
- सेते 37 पर मॉड्यूल कटौती ° सी 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 60 मिनट के लिए.
6) टयूबिंग से कोलेजन मॉड्यूल हटाना
- भंवर 50 एमएल शंक्वाकार टयूबिंग में 10 सेकंड के लिए मॉड्यूल से युक्त ट्यूब.
नोट: जब टूटना से बचने के लिए उच्च घनत्व सेल के साथ एम्बेडेड मॉड्यूल को अलग कोमल. - चलो मॉड्यूल ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित. के बारे में 5 मिनट लेता है.
- एक चौड़े मुंह 10 एमएल सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब बसे मॉड्यूल हस्तांतरण.
- कदम 6,1 6,3 दो बार दोहराएँ.
- Endothelial कोशिकाओं एक गैर ऊतक संस्कृति इलाज थाली या हस्तांतरण मॉड्यूल के साथ कोट मॉड्यूल के लिए 7 कदम जाओ.
Endothelial कोशिकाओं के साथ) 7 मॉड्यूल कोटिंग
- एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के नीचे में 5 वीं के लिए मीडिया के एमएल के साथ मॉड्यूल का Settleई कोशिकाओं एम्बेडेड.
- Endothelial कोशिकाओं से मीडिया निकालें और 5 एमएल पीबीएस के साथ धोने.
- पीबीएस निकालें और 3 trypsin EDTA एमएल जोड़ने.
- 5 मिनट के लिए 37 पर trypsin - EDTA में कोशिकाओं को सेते डिग्री सेल्सियस
- 7 एमएल मीडिया में कोशिकाओं Resuspend.
- कोशिकाओं की गणना. 5x10 6 शंक्वाकार ट्यूब के नीचे पैक मॉड्यूल एमएल प्रति endothelial कोशिकाओं की आवश्यकता है.
- गोली 5 और 5 एमएल endothelial सेल मीडिया में resuspend मिनट के लिए 300 XG कोशिकाओं.
- मॉड्यूल के लिए endothelial कोशिकाओं से युक्त मीडिया के 5 एमएल जोड़ें.
नोट: यह दो मीडिया प्रकार जो हम दोनों प्रकार की कोशिकाओं के अस्तित्व और समारोह के लिए काम मिल गया है 50:50 के अनुपात देता है. उपयोग एक सह संस्कृति करने के लिए इसे का उपयोग करने से पहले दो कक्षों प्रकार के phenotypes के उचित रखरखाव सुनिश्चित करने के लिए तैयार मध्यम टेस्ट. - दोनों स्थैतिक और गतिशील endothelial कोशिकाओं के साथ मॉड्यूल सेते हैं.
- उलटा द्वारा ऊष्मायन स्थिर endothelial कोशिकाओं के साथ मिश्रण मॉड्यूल और ट्यूब 37 पर सीधे सेट ° सी 15 मिनट के लिए के लिए. दोहराएँ.
- गतिशील बीज धीरे से 37 पर ट्यूब कमाल endothelial कोशिकाओं ° सी 60 मिनट के लिए.
- स्थिर ऊष्मायन दो बार दोहराएँ.
- एक गैर टिशू कल्चर का इलाज थाली में मॉड्यूल प्लेस और 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस
- अगले दिन जगह ताजा मीडिया के साथ एक नई संस्कृति गैर ऊतक इलाज थाली में मॉड्यूल (50:50 मिश्रण यदि का उपयोग कर प्रणाली सह संस्कृति) स्वाधीन endothelial कोशिकाओं को हटाने.
- मॉड्यूल है कि endothelial कोशिकाओं के साथ लेपित हैं, जब तक वे मॉड्यूल की सतह के 100% को कवर सेते हैं. यह आमतौर पर के बारे में 7 दिन लगते हैं.
8) प्रतिनिधि परिणाम:
मॉड्यूल बेलनाकार देखो, जब वे पहली बार ट्यूब से हटा रहे हैं. यदि मॉड्यूल एम्बेडेड कोशिकाओं और / होते हैं या endothelial कोशिकाओं के साथ लेपित वे मात्रा में 50% करने के लिए अनुबंध और एक अंडाकार आकार (चित्रा 1) विकसित कर सकते हैं. मॉड्यूल भी denser और अधिक अपारदर्शी जब प्रकाश माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1) द्वारा देखा हो जाएगा. इसके अलावा जब endothelial कोशिकाओं मॉड्यूल की सतह पर मिला हुआ है जो VE-cadherin immunofluorescence धुंधला (चित्रा 2) के द्वारा देखा जा सकता है है तंग जंक्शनों के गठन है. बड़े पैमाने पर स्थानांतरण विश्लेषण प्रदर्शन किया है कि मॉड्यूल एक परिगलित अपर्याप्त ऑक्सीजन परिवहन है, जो अक्सर बड़े ऊतकों में समस्याग्रस्त है (जैसे बड़े व्यास के मॉड्यूल, डी 1.4 = कारण कोर के विकास के बिना उच्च सेल घनत्व (8x10 7 कोशिकाओं / 3 सेमी) का समर्थन करने में सक्षम हैं मिमी) (चित्रा 3).
चित्रा 1: मॉड्यूल निर्माण और संकुचन. मॉड्यूल संकुचन HUVEC सी (endothelial सेल लाइन) के बाद तीन दिनों के दौरान हुई बोने परिणाम काफी छोटे मॉड्यूल व्यास और लंबाई (पी <0.001) (ए). निर्माण के समय में थे मॉड्यूल के भीतर एंबेडेड HepG2 कोशिकाओं समान वितरित और उच्च व्यवहार्यता (बी) को बनाए रखा. [कोशिकाओं हरी लाइव, मृत कोशिकाओं लाल] [Corstorphine 2010 से अनुकूलित]
चित्रा 2: VE-cadherin चुनाव आयोग RAEC 10 दिनों के बाद तंग सेल जंक्शनों जहां एक मॉड्यूल की सतह पर लेपित के immunofluorescent धुंधला हो जाना . स्केल बार = 50 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 3: Masson विशिष्ट मॉड्यूल के trichrome धुंधला (0.76 मिमी प्रारंभिक व्यास) और बड़े मॉड्यूल (1.4 मिमी प्रारंभिक व्यास) ऑक्सीजन प्रसार सीमाओं के प्रभाव को प्रदर्शित करता है . निर्माण निम्नलिखित सात दिन, मृत कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में बड़े मॉड्यूल (निचले सही पैनल) के कोर के भीतर का गठन किया था, केवल व्यवहार्य कोशिकाओं की एक पतली रिम (~ मोटी 200μm) छोड़ने. इसके विपरीत, छोटे मॉड्यूल जीवित कोशिकाओं के एक समान और उच्च वितरण बनाए रखा. [मॉड्यूल HepG2 कोशिकाओं के साथ एम्बेडेड और endothelial कोशिकाओं के साथ लेपित है.] [Corstorphine 2010 से लिया]
चित्रा 4: (ए) poloxamine HMEC-1 पर वरीयता प्राप्त - कोलेजन मॉड्यूल. बोने poloxamine - कोलेजन मॉड्यूल उनके बेलनाकार आकार बनाए रखने के लिए और कोलेजन केवल मॉड्यूल की तुलना में सीमित सेल लगाव गुण के दिन 1 के बाद. स्केल बार = 200 सुक्ष्ममापी. (बी) एक कोलेजन युक्त मॉड्यूल PLGA-आधारित है biodegradable microspheres की लाइट माइक्रोस्कोप छवि. स्केल बार = 500 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 5: में उदाहरण के इन विट्रो assays. (ए) Angiogenesis परख: endothelial कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त मॉड्यूल पर संरचनाओं केशिका तरह आसानी से हो सकता है और पता लगाया जा सकता वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के साथ ऊष्मायन के 5 दिनों के बाद मात्रा निर्धारित की. (बी) मॉड्यूल जहां पर रहते हैं / मृत परख के confocal माइक्रोस्कोपी छवियोंजीवित कोशिकाओं के लिए हरी taining है और मृत कोशिकाओं के लिए लाल है.
चित्रा 6: कोलेजन मॉड्यूल एम्बेडेड mesenchymal स्टेम कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं की सतह परत युक्त. मॉड्यूल एक microfluidic कक्ष में 7 दिनों के लिए कतरनी तनाव (~ 0.64 dyn के / 2 सेमी) से अवगत कराया गया और संपर्क के अंक में संलयन दिखाने के लिए शुरू. Endothelial कोशिकाओं vWF (भूरे रंग का) के साथ दाग रहे हैं और mesenchymal स्टेम सेल नाभिक नीले (एच एंड ई) दिखाई देते हैं. स्केल बार = 100μm.
चित्रा 7: कोलेजन वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (ए एस सी) और मानव Microvascular endothelial कोशिकाओं के साथ लेपित युक्त मॉड्यूल के सैकड़ों (HMEC) माउस / ए एस सी HMEC वसा उत्थान के अनुप्रयोगों के लिए vivo में बातचीत का अध्ययन त्वचा के नीचे प्रत्यारोपित कर रहे हैं.
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Discussion
हम कई अलग अलग सेल 1-11 प्रकार के साथ एम्बेडेड मॉड्यूल का उपयोग कर माइक्रो ऊतकों गढ़े है. हम सफलतापूर्वक प्राथमिक cardiomyocytes, islets, वसा स्टेम कोशिकाओं और mesenchymal stromal कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से HepG2, एनआईएच 3T3 और क्लोन 9 जिगर की कोशिकाओं सहित कई सेल लाइनों एम्बेडेड है. हम चूहे महाधमनी endothelial कोशिकाओं मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं और मानव microvascular endothelial कोशिकाओं सहित endothelial कोशिकाओं के कई प्रकार के साथ मॉड्यूल लेपित है. मॉड्यूल भी कोलेजन और एक poloxamine बहुलक या युक्त दवा eluting microspheres (चित्रा 4) के एक मिश्रण के साथ उत्पादन किया गया है है. इन विट्रो assays में कई immunofluorescence, पश्चिमी धब्बा, angiogenesis, alamar नीले प्रसार और रहते हैं / मृत assays (चित्रा 5) सहित मॉड्यूल के साथ संगत होना करने के लिए दिखाया गया है. उन्होंने यह भी microfluidic कक्षों (चित्रा 6) में इस्तेमाल किया गया है और चूहों और चूहों (चित्रा 7) में प्रत्यारोपित करने के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच और कैसे सूक्ष्म ऊतकों मेजबान प्रतिक्रिया से remodeled हैं बातचीत अध्ययन. मॉड्यूल कई आवेदन किया है और कोशिकाओं पर 3 डी टिशू कल्चर के प्रभाव का अध्ययन, एक 3D रचना में विभिन्न कोशिकाओं की बातचीत, एक microfluidic कक्ष में सूक्ष्म ऊतकों की remodeling के लिए एक मेजबान और सूक्ष्म ऊतकों के vivo remodeling में इस्तेमाल किया जा सकता है प्रतिक्रिया.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
अनुदान राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (001,013 EB), प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान द्वारा प्रदान किया गया. हम उसकी विशेषज्ञता के लिए धन्यवाद डा. एपी McGuigan और मॉड्यूल के विकास में मदद की.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic tubing PE60 | BD Biosciences | 427416 | Different diameter of tubing can be used to change the diameter of the modules |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200-072 | |
| Purcol acidificed collagen, 3 mg/mL | Cedarlane Labs | 5005-B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 20G needle | BD Biosciences | 305175 | Diameter of the needle needs to be similar to the diameter of the tubing |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 15 mL tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2” x 13” | Cardinal Health | 92713 | |
| 10 ml Wide Tip serological pipet | BD Biosciences | 357504 | |
| 10 ml serological pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml serological pipet | BD Biosciences | 357543 |
References
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- Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2010).
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- McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected]. Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).
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