Summary
埋め込まれた細胞とその表面を含むモジュールと呼ばれる円筒状のコラーゲンゲルを、使用して、ミクロ組織の作成は、内皮細胞で被覆されている。
Abstract
このプロトコルは、モジュールと呼ばれるミクロ組織の型の製造を説明します。モジュールのアプローチは、均一な、スケーラブルで血管が新生組織を生成します。モジュールは、コラーゲンだけでなく、他のゲル化または架橋可能な材料から成っていることができる。彼らは、製造時に直径で長さが約2mmと0.7 mmであるが、埋め込まれたセルまたは時のモジュールが内皮細胞で被覆すると大きさに縮小。個別のモジュールが組み込まれた細胞は酸素と他の栄養素の拡散の制限範囲内であるが、モジュールがperfusableな大きな組織を形成するために一緒にパックすることができるくらい小さいです。彼らは複雑な組織を形成するために一緒にパックされる前に別の種類の細胞が内に埋め込ままたはモジュール上にコーティングすることができますので、これらの組織は、建設中のモジュラーです。モジュールを作るために3つの主要なステップがあります：（1）コラーゲンを中和し、その中に細胞を包埋、管の（2）ゲル化コラーゲンをし、内皮細胞とのモジュールと（3）コーティングモジュールを切断。
Protocol
1）チューブの調製
- ポリエチレンチューブの2〜3メートルの長さをカット（0.76ミリメートル内径x 1.22ミリメートルOD）。
- チューブの一端に20 G1の針を通します。
- コンバータセルフシールパウチ（7 1 / 2"× 13"）のコイルチューブと場所。チューブの両端は、袋の未舗装の端に置かれ、ガス滅菌のテープでテーピングしてください。
- シールの袋とガスは滅菌する。
コラーゲンの2）中和
注：コラーゲンの1mlは、ポリエチレン管の約2 mを埋めます。
- 15 mlコニカルチューブにチューブの所望の長さに必要なコラーゲンの必要量を配置し、氷上に置きます。
- 繰り返しソリューションをピペッティングすることによりチューブとミックスに10倍のα- MEMあたりのmLのコラーゲンの128のULを追加します。注：（1）ソリューションは、酸性化されたコラーゲンにα- MEMのような黄色が混合されている電源を必要と（2）混合時に気泡を最小限にしようとする。
- コラーゲンは7.4のpHになるまで0.8Mの重炭酸ナトリウムを添加することによりコラーゲンを中和する。黄色のコラーゲン溶液が淡いピンクの色が消えるまで、pHの一般的な見積もりのために重炭酸ナトリウムを加える。注：これは一般的にコラーゲンの各MLあたり30〜60μLを取る。
- 中和コラーゲンとして使用する準備ができるまでゲル4で保たれていない場合になります氷上で中和コラーゲンを維持℃に
細胞の3）埋め込み（オプション）
注：細胞を溶解あたり20万個の細胞へのmL当たり100万の間の細胞の濃度で埋め込むことができる細胞の種類にもよります。あなたが埋め込むするセルに必要な培地を使用してください。
- 細胞から培地を取り除き、5mLのPBSで洗浄する。
- PBSを削除し、3 mLのトリプシン- EDTAを加える。
- 37℃で5分間のためにトリプシン- EDTAで細胞をインキュベート
- 7 mLのメディアで細胞を再懸濁します。
- 細胞を数える。
- 15 mLコニカルチューブに埋め込むための細胞の必要数を転送する。
- 5分間、300 xgでペレットは、細胞。
- 細胞ペレットから培地を吸引除去する。
- 中和コラーゲンに細胞を再懸濁し、氷上に置きます。
4）コラーゲンのゲル化は、
- 生物学的安全キャビネット内でポリエチレンチューブの入った袋の密封端をカット。
- 滅菌ピンセットを用いてチューブの一端に20G針に3 mlの注射器を取り付けます。袋にチューブを保持します。
- 先端が滅菌ピンセットを用いてコニカルチューブの一番下になるまで中和コラーゲンにチューブのもう一方の端を差し込みます。コニカルチューブを氷上で保管してください。
- シリンジのプランジャーは、徐々に後退によるポリエチレンのチューブにコラーゲンを引き出します。
注：コラーゲンはすぐにその後にチューブに引き込まれている場合、気泡がコラーゲンで形成される。 - チューブを介してコラーゲンを引っ張っした後、チューブの外20G針を引っ張ると袋に両端を戻す。テープバッグがシャットダウンします。
- ℃で60分間で37袋をインキュベートする。コラーゲンは細胞が含まれている場合は、毎15分かけて袋を裏返し。その細胞は、モジュールの片側にセトリングしていないこと。
5）チューブの切断はゲル状になったコラーゲンを含む
- 切削装置とチューブを保持するトレイ用オートクレーブヘッダとブレード。
- 切削装置を組み立てます。
- 場所は、デバイスを切断の前に滅菌トレイのチューブと切断装置にチューブをロードする。
- カットモジュールを収集する切削装置の出口でメディアの25 mLを含む50mLのコニカルチューブを設定します。
注：モジュールは、メディアのFBSのないチューブから分離しないようにコラーゲンのみのモジュールに対してもFBSを含む使用メディア。モジュールが含まれている場合は細胞が埋め込まれ、細胞に必要なメディアを使用してください。ある場合はモジュール内に組み込まれた細胞は、内皮細胞用培地を使用します。 - チューブの2mmの長さをカットしてチューブを切断する切断装置を設定します。
- 37モジュールをカット° 50 mLコニカルチューブに60分間Cをインキュベートする。
6）チューブからコラーゲンモジュールの取り外し
- 10秒のためのチューブ内のモジュールを含む渦50 mLコニカルチューブ。
注：破損を避けるために高い細胞密度で埋め込まれたモジュールを分離するときに優しく。 - モジュールは、チューブの底に沈降してみましょう。約5分かかります。
- 広口10mlの血清学的ピペットを使用すると、15 mLコニカルチューブに決済モジュールを転送する。
- ステップ6.1から6.3倍を繰り返します。
- 非組織培養処理されたプレートに内皮細胞または転送モジュールとコートのモジュールに、手順7に進みます。
7）コーティング内皮細胞とモジュール
- 番目のメディアを5 mL、15 mLコニカルチューブの底にモジュールをセトルeは、細胞を埋め込まれた。
- 内皮細胞から培地を取り除き、5mLのPBSで洗浄する。
- PBSを削除し、3 mLのトリプシン- EDTAを加える。
- 37℃で5分間のためにトリプシン- EDTAで細胞をインキュベート
- 7 mLのメディアで細胞を再懸濁します。
- 細胞を数える。コニカルチューブの底にパックされたモジュールのmL当たり5 × 10 6内皮細胞を必要とする。
- ペレットを5 mLの内皮細胞培地中で5分間再懸濁しますため、300 xgで細胞。
- モジュールに内皮細胞を含む培地を5mLを追加。
注：これは、我々は両方の細胞型の生存と機能のために働くことが判明している2つのメディアタイプの50:50比率を与える。使用にそれを使用する前に、二つの細胞タイプの表現型を適切に管理するように定式化共培養の培地をテストします。 - 静的および動的に内皮細胞でモジュールをインキュベートする。
- 静的インキュベーションミックス反転による内皮細胞とのモジュールと37℃で直立管をセット℃で15分のため。繰り返します。
- 軽く37℃チューブを揺らすことによって動的にシード内皮細胞℃で60分間。
- 二回静的インキュベーションを繰り返します。
- 非組織培養は、治療をプレートにモジュールを配置し、37℃で一晩インキュベート℃、
- 次の日の代わりに新たな非組織培養のモジュールがアタッチされていない内皮細胞を除去するために新鮮な培地（共培養系を用いた場合50:50）にプレートを処理した。
- 彼らがモジュールの表面の100％をカバーするまで、内皮細胞で被覆されているモジュールをインキュベートする。これは通常、約7日かかります。
8）代表的な結果：
彼らは最初のチューブから削除されたときのモジュールは、円筒形になります。モジュールが組み込まれた細胞および/を含むまたは内皮細胞で被覆されている場合、それらは体積で50％まで収縮し、楕円形（図1）を開発することができます。モジュールはまた、光学顕微鏡（図1）で見たときより高密度とより不透明になります。また、内皮細胞は、モジュールの表面上にコンフルエントのときにVE -カドヘリンの免疫蛍光染色（図2）で見られるタイトジャンクションの形成がある。物質移動の解析は、モジュールが不十分な酸素の輸送に起因する壊死性コアを開発することなく、高い細胞密度（8 × 10 7細胞/ cm 3の ） をサポートできることを明らかに大きな組織の中にしばしば問題とされている（大口径の例：モジュール、D = 1.4しましたMM）（図3）。
図1：モジュールの製造と収縮。 HUVEC - C（内皮細胞株）シードを後3日中に発生したモジュールの収縮はかなり小さく、モジュールの直径と長さ（P <0.001）（）の結果。埋め込まれたHepG2細胞は一様に、製造時にモジュール内で分配と高い生存率を（B）保持された。 [細胞は緑のライブ、死んだ細胞赤] [コーストフィン2010年から適応]
図2：モジュールの表面にコーティングされた10日RAEC後のECタイト細胞間結合のVE -カドヘリン免疫蛍光染色。スケールバー= 50μmの。
図3：典型的なモジュール（0.76ミリメートル初期直径）と大型モジュールのマッソントリクローム染色（1.4ミリメートル初期直径）は、酸素の拡散の制限の効果を実証。製造後7日間は、死細胞の多数は生存細胞の唯一の薄いリムを（〜200μmの厚さ）を残して、大規模なモジュール（右下のパネル）のコア内に形成していた。逆に、小規模なモジュールは、生きている細胞の均一かつ高いディストリビューションを保持。 [モジュールは、HepG2細胞を包埋し、内皮細胞で被覆された。] [コーストフィン2010年から撮影]
図4：poloxamine上（A）HMEC - 1シード-コラーゲンのモジュール。 poloxamine -コラーゲンモジュールを播種の1日後に円筒形の形状を保持し、コラーゲンのみモジュールに比べて限定された細胞の添付ファイルのプロパティがあります。スケールバー= 200μmの。 PLGAベースの生分解性ミクロスフェアを含むコラーゲンのモジュールの（B）光顕微鏡像。スケールバー= 500μmの。
図5：in vitro試験の例。 （A）血管新生アッセイ：血管内皮細胞を接種したモジュール上の毛細血管のような岩は、簡単に脂肪由来幹細胞とのインキュベーションの5日後に検出および定量することができる。 （B）のモジュール上でライブ/デッドアッセイの共焦点顕微鏡画像生きている細胞のために泰寧は緑であり、死んだ細胞のために赤いです。
図6：埋め込 まれた間葉系幹細胞と内皮細胞の表面層を含むコラーゲンモジュール。モジュールは、マイクロ流体室で7日間せん断応力（〜0.64 DYN / cm 2）のために暴露し、接触点での融合を示し始めるれた。内皮細胞は、vWFを（茶色）で染色し、間葉系幹細胞核は青色（H＆E）が表示されている。スケールバー=100μmの。
図7：脂肪由来幹細胞（ASC）およびヒト微小血管内皮細胞で被覆されたを含むコラーゲンのモジュールの何百もの（HMEC）脂肪再生アプリケーションのためのin vivoでの ASC / HMEC相互作用を研究するためにマウスの皮膚の下に注入される。
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Discussion
我々は、異なる種類の細胞1月11日に埋め込 まれたモジュールを使用していくつかの異なるミクロ組織を作製した。我々は成功し、主心筋細胞、膵島、脂肪幹細胞と間葉系幹細胞と同様にしたHepG2、NIH 3T3およびクローン9肝臓の細胞を含むいくつかの細胞株が組み込まれています。我々は、ラット大動脈内皮細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞とヒト微小血管内皮細胞を含む内皮細胞のいくつかのタイプのモジュールをコーティングしている。モジュールはまた、コラーゲンとpoloxamineポリマーまたはミクロスフェア（図4）溶出を含む薬剤の混合物で製造されてきた。 in vitroアッセイのいくつかは、免疫蛍光、ウェスタンブロット、血管新生、アラマーブル増殖とLIVE / DEADアッセイ（図5）を含むモジュールと互換性があることが示されている。彼らはまた、マイクロ流体チャンバ内で使用する（図6）と、マウスやラットに移植（図7）異なる種類の細胞間の相互作用を研究する方法と、ミクロ組織のホストの応答によって改造ですされています。モジュールは、マイクロ流体チャンバー内とホストによるマイクロ組織の生体内リモデリングにおけるミクロ組織のリモデリング、3Dコンフォメーションのさまざまな細胞の相互作用、多くのアプリケーションがあり、細胞の3次元組織培養の効果の研究に使用することができます。応答。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
資金は、国立衛生研究所（EB 001013）、カナダ自然科学工学研究評議会と保健研究のカナダの協会によって提供されていました。私たちは、彼女の専門知識のために博士はAPマクギガンに感謝し、モジュールの開発に役立つ。Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic tubing PE60 | BD Biosciences | 427416 | Different diameter of tubing can be used to change the diameter of the modules |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200-072 | |
| Purcol acidificed collagen, 3 mg/mL | Cedarlane Labs | 5005-B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 20G needle | BD Biosciences | 305175 | Diameter of the needle needs to be similar to the diameter of the tubing |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 15 mL tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2” x 13” | Cardinal Health | 92713 | |
| 10 ml Wide Tip serological pipet | BD Biosciences | 357504 | |
| 10 ml serological pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml serological pipet | BD Biosciences | 357543 |
References
- Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules. , (2010).
- Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2010).
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