Summary
임베디드 세포와 어떤 표면을 포함하는 모듈 불리는 원통형 콜라겐 젤을 사용하여 마이크로 조직의 생성은 내피 세포로 코팅됩니다.
Abstract
이 프로토콜은 모듈이라는 마이크로 조직의 유형의 제조에 대해 설명합니다. 모듈 접근 방식은 유니폼, 확장성과 vascularized 조직을 생성합니다. 모듈은 콜라겐뿐만 아니라 다른 gelable 또는 crosslinkable 재료 만들 수 있습니다. 그들은 제조시 직경 길이 약 2mm와 0.7 mm 있지만 임베디드 세포 또는 경우 모듈이 내피 세포로 코팅 아르와 크기로 축소. 개별 모듈은 임베디드 세포가 산소와 다른 영양소의 확산 제한 내에 있지만 모듈 perfusable 아르 더 큰 조직을 형성하기 위해 함께 포장 수있는 정도로 작은 수 있습니다. 그들이 복잡한 조직을 형성하기 위해 함께 모여되기 전에 다른 셀 형식에 포함된 또는 모듈에 코팅된 수 있기 때문에 이러한 조직 건설에 모듈입니다. 모듈을 만들기 위해 세 가지 주요 단계가 있습니다 : (1) 콜라겐을 중화하고 그 안에 세포를 포함, 튜브 (2) 겔화 콜라겐과 내피 세포와 모듈과 (3) 코팅 모듈을 절단.
Protocol
관 1) 준비
- 폴리에틸렌 튜브 2 ~ 3 미터 길이 (0.76 mm ID를 X 1.22 mm OD)를 자르고.
- 튜브의 한쪽 끝을로 20 G1 바늘에 실을 꿰다.
- 변환기 자체 밀봉 주머니 (7 1 / 2 "X 13")에 코일 튜빙 장소. 튜빙의 두 끝을은 가방의 unsealed 끝에 위치 및 가스 살균 테이프와 장소에서 녹화한다.
- 인감 가방 및 가스 소독.
콜라겐 2) 중화
참고 : 콜라겐 1 ML는 폴리에틸렌 튜빙의 약 2 미터 채워집니다.
- 15 ML 원뿔 관에 튜브를 원하는 길이에 필요한 콜라겐의 필요한 양을 놓고 얼음 계속.
- 128 UL 추가 10X α - 멤 당 ML 튜브와 반복 솔루션을 pipetting으로 혼합하는 콜라겐니다. 참고 : (1) 솔루션은 산성의 콜라겐에 α - 멤 같은 노란색이 혼합된 것입니다 설정해야하며 (2) 혼합시 거품을 최소화하려고합니다.
- 콜라겐은 7.4의 산도를 가지고 때까지 0.8 M 나트륨 중탄산염을 추가하여 콜라겐을 중화. 산도의 추가 나트륨 중탄산염에 대한 일반적인 추정을위한 노란색 콜라겐 솔루션은 밝은 핑크색 색상을 발견되기 전까진. 참고 : 일반적으로 콜라겐의 각 ML 당 30-60 μL 걸립니다.
- 무력화 콜라겐으로 사용할 준비까지 겔 4 보관하면되지 않습니다 얼음에 무력화 콜라겐 계속 ° C.
셀 3) 삽입 (옵션)
참고 : 세포 종류에 따라 세포가 ML 당 20,000,000 세포 ML 당 백만 세포 사이의 농도에서 임베디드 수 있습니다. 당신이 포함하고자하는 세포에 필요한 매체를 사용하십시오.
- 세포에서 미디어를 제거하고 PBS로 5 ML 씻으십시오.
- PBS를 제거 및 3 ML 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가합니다.
- 37 5 분 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에있는 세포를 품어 ° C.
- 7 ML 매체에 세포를 Resuspend.
- 세포를 세어보세요.
- 15 ML 원뿔 관을 삽입에 대한 세포의 필요한 번호를 전송합니다.
- 5 분 300 XG에 펠렛은 세포.
- 세포 펠렛에서 미디어를 대기음.
- 무력화 콜라겐의 세포를 Resuspend 얼음 계속.
콜라겐 4) 겔링
- 생물 학적 안전 캐비넷에서 폴리에틸렌 튜브가 들어있는 가방의 밀봉 끝을 잘라.
- 멸균 핀셋을 사용하여 튜브의 한쪽 끝을에서 20G 바늘로 3 ML의 주사기를 연결합니다. 가방에 튜빙을 유지.
- 끝이 살균 핀셋을 사용하여 원뿔 관의 하단에까지 무력화 콜라겐에 튜브의 다른 쪽 끝을 삽입합니다. 원뿔 튜브 얼음에 보관하십시오.
- retracting 천천히 주사기의 플런저에 의해 폴리에틸렌 튜브에 콜라겐을 당겨.
참고 : 콜라겐이 빠르게 다음 거품이 콜라겐의 형성에 튜브에 뽑아 경우. - 튜빙을 통해 콜라겐을 당기는 후, 튜브 밖으로 20G 바늘을 끌어와 가방에 다시 양쪽을 넣어. 테이프 가방 종료.
- ° C 60 분 37 가방을 품다. 콜라겐은 세포가 포함되어있는 경우 다음 각 15 분 이상의 가방을 플립. 그래서 세포는 모듈의 한쪽으로 해결하지 않습니다.
5) 튜브의 절단은 Gelled 콜라겐을 포함
- 절단 장치와 튜브를 잡아 트레이에 대한 압력솥 헤더와 블레이드.
- 절단 장치를 조립.
- 플레이스 장치를 절단 앞에 살균 트레이에 튜브 및 절단 장치에 튜빙을로드합니다.
- 컷 모듈을 수집하는 절단 장치의 콘센트에서 미디어의 25 ML을 포함한 50 ML 원뿔 튜브를 설정합니다.
참고 : 모듈이 언론에 FBS없이 튜브에서 분리하지 않는 콜라겐 전용 모듈도 FBS를 포함하는 사용 미디어. 모듈이 포함되어 있으면 세포가 포함된 세포에 필요한 미디어를 사용합니다. 있다면 모듈에 포함된 세포가 내피 세포에 대한 미디어를 사용하지 않습니다. - 튜빙의 2mm 길이를 잘라 튜브를 잘라 절단 장치를 설정합니다.
- 37 모듈을 잘라 품어 ° 50 ML 원뿔 튜브 60 분 C.
6) 튜브에서 콜라겐 모듈 제거
- 10 초에 대한 튜브의 모듈을 포함하는 소용돌이 50 ML 원뿔 관.
참고 : 파손을 피하기 위해 높은 세포 밀도와 임베디드 모듈을 분리 때 부드럽게한다. - 모듈 튜브의 바닥에 정착하자. 약 5 분 정도 소요됩니다.
- 넓은 입 10 ML serological 피펫을 사용하면 15 ML 원뿔 관에 정착한 모듈을 전송합니다.
- 단계를 6.1-6.3 두 번 반복합니다.
- 아닌 조직 문화 처리 강판에 내피 세포 또는 전송 모듈과 코트 모듈 7 단계로 이동합니다.
내피 세포와 함께 7) 코팅 모듈을
- 일 미디어의 5 ML과 15 ML 원뿔 튜브의 바닥에 모듈을 정착E는 세포를 내장.
- 내피 세포에서 미디어를 제거하고 PBS로 5 ML 씻으십시오.
- PBS를 제거 및 3 ML 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가합니다.
- 37 5 분 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에있는 세포를 품어 ° C.
- 7 ML 매체에 세포를 Resuspend.
- 세포를 세어보세요. 원뿔 관의 하단에있는 포장 모듈 ML 당 5x10 6 내피 세포가 필요 해요.
- 5 ML 내피 세포 미디어에서 5 분 및 resuspend 300 XG에 펠렛은 세포.
- 모듈에 내피 세포가 들어있는 미디어의 5 ML을 추가합니다.
참고 : 이것은 우리가 두 세포 유형의 생존과 기능에 대한 작업 찾은 두 미디어 유형의 50:50 비율을 제공합니다. 사용 그것을 사용하기 전에 두 세포 유형의 phenotypes의 적절한 유지 보수를 위해 공식화 공동 문화 매체를 테스트합니다. - 모두 정적 및 동적으로 내피 세포와 모듈을 품어.
- 정적 배양 믹스 역전의 내피 세포와 모듈과 37 수직 튜브를 설정할 ° 15 분 C하십시오. 반복합니다.
- 부드럽게 37 튜브를 락을하여 동적으로 씨앗이 내피 세포 ° 60 분 C.
- 두 정적 부화를 반복합니다.
- 아닌 조직 문화가 처리 강판의 모듈을 놓고 37 밤새 품어 ° C.
- 새로운 미디어와 새로운 비 조직 문화 처리 강판의 다음날 장소의 모듈 (50:50 혼합하는 경우 사용하는 공동 문화 시스템) 무소속의 내피 세포를 제거하려면 다음과 같이하십시오.
- 그들은 모듈의 표면의 100 %를 커버까지 내피 세포와 입혀져 있습니다 모듈을 품어. 이것은 일반적으로 약 7 일이 소요됩니다.
8) 대표 검색 결과 :
그들이 처음 튜브에서 제거하는 경우 모듈은 원통 모양 것입니다. 모듈이 포함된 셀 및 /를 포함 또는 내피 세포로 코팅하는 경우 그들은 볼륨 50 %까지 계약하고 타원형 모양 (그림 1)을 개발할 수 있습니다. 모듈은 또한 가벼운 현미경 (그림 1)에서 볼 때 밀도가 더 불투명하게 될 것입니다. 또한 내피 세포가 모듈의 표면에 합류하는 경우 VE - Cadherin의 immunofluorescence 얼룩 (그림 2)에서보실 수 있습니다 꽉 분기점의 형성이 있습니다. 대량 전송 분석 모듈 (대형 직경의 예 : 모듈, D = 1.4 대규모 조직에서 흔히 문제는 불충 분한 산소 수송에 의한 괴사성 핵심을 개발하지 않고 높은 세포 밀도를 (8x10 7 세포 / cm 3) 지원 할 수있다 증명했다 mm) (그림 3).
그림 1 : 모듈 제조 및 수축. 모듈 수축이 시딩 상당히 작은 모듈 직경 및 길이 (P <0.001) (A)를 결과 HUVEC - C (내피 세포 라인)을 다음과 같은 세 가지 일 동안 발생했습니다. 임베디드 HepG2 세포가 균일하게 제조시 모듈 내에 배포 및 높은 생존 능력 (B)를 유지했다. [세포가 녹색 라이브, 죽은 세포 레드] [코스토핀 2010에서 적응]
그림 2 : 모듈의 표면에 코팅 십일 RAEC 후 EC 꽉 세포 분기점의 VE - Cadherin immunofluorescent 얼룩. 스케일 바 = 50 μm의.
그림 3 : 메이슨의 전형적인 모듈의 trichrome 염색법 (0.76 mm 초기 직경) 및 대형 모듈 (1.4 mm 초기 직경)는 산소 확산 제한의 효과를 보여줍니다. 제조 아래 세븐 일, 죽은 세포의 큰 숫자가 가능한 세포의 단지 얇은 테두리를 (~ 200μm 두께) 떠나, 대형 모듈 (오른쪽 아래 패널)의 핵심 내에서 형성했다. 반대로 작은 모듈은 라이브 세포의 균일한 높은 분포를 유지. [모듈 HepG2 세포와 임베디드 및 내피 세포와 코팅.] [코스토핀 2010에서 가져온]
그림 4 : poloxamine에 (A) HMEC - 1 씨앗 - 콜라겐 모듈. poloxamine - 콜라겐 모듈은 자신의 원통형 모양을 유지하고 제한된 세포 부착 속성 콜라겐에만 모듈에 비해있다 시딩의 1 일 후. 스케일 바 = 200 μm의. PLGA 기반 생분해성 microspheres를 포함하는 콜라겐 모듈의 (B) 라이트 현미경 이미지. 스케일 바 = 500 μm의.
그림 5 : 시험 관내 assays에의 예. (A) Angiogenesis 분석 : 모세와 같은 형태 내피 세포와 씨앗 모듈에 쉽게 지방 - 유래 줄기 세포로 감지하고 배양 5 일 후에 계량하실 수 있습니다. (B)의 모듈에 대한 라이브 / 죽은 분석의 공촛점 현미경 이미지라이브 세포에 대한 taining 것은 녹색과 죽은 세포를 위해 빨간색입니다.
그림 6 : 임베디드 mesenchymal 줄기 세포와 내피 세포의 표면 레이어를 포함하는 콜라겐 모듈. 모듈은 microfluidic 챔버에서 7 일 동안 전단 응력 (~ 0.64 dyn / cm 2) 노출 및 연락처 지점에서 융합을 표시하기 시작했다. 내피 세포 vWF (갈색)와 스테인드 및 mesenchymal 줄기 세포의 핵은 청색 (H & E) 표시됩니다. 스케일 바 = 100μm.
그림 7 : 지방 - 유래 줄기 세포 (ASC)와 인간 Microvascular 내피 세포와 코팅을 포함하는 콜라겐 모듈의 수백은 (HMEC) 지방의 재생 어플 리케이션을위한 생체내에 ASC / HMEC 상호 작용을 연구하기 위해 마우스 칩을 피부 밑에 심어입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
우리는 서로 다른 세포 유형 1-11와 임베디드 모듈을 사용하여 여러 가지 마이크로 조직을 가공했습니다. 우리는 성공적으로 기본 cardiomyocytes, 아일 레츠, 지방 줄기 세포 및 mesenchymal stromal 세포뿐만 아니라, HepG2, NIH 3T3 및 복제 구 간 세포를 포함한 여러 세포 라인을 내장했습니다. 우리는 쥐 대동맥 내피 세포, 인간 제대 정맥 내피 세포 및 인간의 microvascular 내피 세포를 포함한 내피 세포의 여러 종류의 모듈을 코팅합니다. 모듈은 또한 콜라겐과 poloxamine 고분자 또는 약물 eluting microspheres를 (그림 4)이있는의 혼합물로 제작되었습니다. 시험 관내 assays 여러가 immunofluorescence 서양 얼룩, angiogenesis, 알라마 파란색 증식 및 라이브 / 죽은 assays (그림 5)를 포함한 모듈과 호환되도록 표시되었습니다. 그들은 또한 microfluidic 챔버 (그림 6)에서 사용하고 다른 세포 유형 간의 방법과 마이크로 조직은 호스트 응답으로 리모델링하는 상호 작용을 연구하기 위해 마우스 및 쥐 (그림 7)에 이식되었습니다. 모듈은 여러 응용 프로그램을하고 호스트 microfluidic 챔버에서 마이크로 조직의 리모델링 세포에 대한 3D 조직 문화의 영향 연구, 3D 형태에서 다른 세포의 상호 작용과 마이크로 조직의 생체내 개조에 사용할 수 있습니다 응답.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
기금은 보건 국립 연구소 (EB 001013), 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 및 건강 연구 캐나다 연구소에 의해 제공되었다. 우리는 그녀의 전문 박사 AP 맥기건 감사와 모듈의 개발에 도움이됩니다.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic tubing PE60 | BD Biosciences | 427416 | Different diameter of tubing can be used to change the diameter of the modules |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200-072 | |
| Purcol acidificed collagen, 3 mg/mL | Cedarlane Labs | 5005-B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 20G needle | BD Biosciences | 305175 | Diameter of the needle needs to be similar to the diameter of the tubing |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 15 mL tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2” x 13” | Cardinal Health | 92713 | |
| 10 ml Wide Tip serological pipet | BD Biosciences | 357504 | |
| 10 ml serological pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml serological pipet | BD Biosciences | 357543 |
References
- Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules. , (2010).
- Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2010).
- Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats. Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).
- Leung, B. M., Sefton, M. V. A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells. Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).
- McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected]. Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct. J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering. Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design criteria for a modular tissue-engineered construct. Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules. Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).
- Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells. Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).
