Summary
Creación de micro-tejidos, utilizando geles de colágeno cilíndricos, llamados módulos, que contienen células incluidas y que la superficie está recubierta de células endoteliales.
Abstract
Este protocolo describe la fabricación de un tipo de micro-tejidos llamados módulos. El concepto de módulo genera tejidos uniforme, escalable y vascularizado. Los módulos pueden ser hechos de colágeno, así como otros materiales gelable o reticulables. Son aproximadamente 2 mm de longitud y 0,7 mm de diámetro en la fabricación, pero disminuye de tamaño con las células incrustado o cuando los módulos están cubiertos con las células endoteliales. Los módulos individuales son tan pequeñas que las células están incrustadas dentro del límite de la difusión de oxígeno y otros nutrientes, pero los módulos se pueden agruparse para formar los tejidos que son más grandes perfusable. Estos tejidos son modulares en la construcción debido a los diferentes tipos de células pueden ser integrados en cubierta o en los módulos antes de que se empaquetan para formar tejidos complejos. Existen tres pasos principales para hacer los módulos de: (1) neutralizar el colágeno y la incrustación de células en el mismo, (2) gelificantes el colágeno en el tubo y corte de los módulos y (3) revestimiento de los módulos con las células endoteliales.
Protocol
1) Preparación del tubo
- Cortar 2 a 3 m de longitud de tubo de polietileno (0,76 mm de diámetro x 1,22 mm OD).
- Enhebrar una aguja 20 G1 en un extremo de la tubería.
- Bobina de la tubería y el lugar en un convertidor de autocierre bolsa (7 1 / 2 "x 13"). Los dos extremos de la tubería debe ser colocado en el extremo sin sellar de la bolsa y se pega con cinta adhesiva de gas de esterilización.
- Selle la bolsa y el gas esterilizar.
2) La neutralización de colágeno
Nota: 1 ml de colágeno se llena de unos 2 m de tubería de polietileno.
- Coloque la cantidad necesaria de colágeno necesario para la longitud deseada del tubo en un tubo cónico de 15 ml y mantener en hielo.
- Añadir 128 uL de 10x α-MEM por ml de colágeno en el tubo y mezclar varias veces la solución de pipeta. Nota: (1) La solución debe a su vez el amarillo como el α-MEM se mezcla con el colágeno acidificado y (2) tratar de minimizar las burbujas de la mezcla.
- Neutralizar el colágeno mediante la adición de bicarbonato de sodio 0,8 M hasta que el colágeno tiene un pH de 7,4. Para una estimación general de que el bicarbonato de sodio pH añadir hasta que la solución de colágeno amarilla se vuelve de un color rosa claro. Nota: Por lo general toma 30 a 60 l por cada ml de colágeno.
- Mantener el colágeno neutralizado en el hielo hasta que esté listo para su uso como el colágeno se neutraliza si no gel se mantiene a 4 ° C.
3) Incorporación de las células (Opcional)
Nota: Dependiendo del tipo de células, las células pueden ser incorporados a una concentración de entre 1 millón de células por ml a 20 millones de células por ml. Utilizar el medio necesario para las células que desea incrustar.
- Eliminar los medios de comunicación de las células y lavar con 5 ml de PBS.
- Quitar PBS y añadir 3 ml de tripsina-EDTA.
- Se incuban las células en tripsina-EDTA durante 5 min a 37 ° C.
- Resuspender las células en 7 ml de medio.
- Recuento de células.
- La transferencia de la cantidad necesaria de células para incorporar a un tubo cónico de 15 ml.
- Que sedimenten las células a 300 xg durante 5 min.
- Aspirar los medios de comunicación de la pellet de células.
- Resuspender las células en el colágeno neutralizado y mantener en hielo.
4) gelificantes de colágeno
- En una cabina de seguridad biológica cortar el extremo cerrado de la bolsa que contiene el tubo de polietileno.
- Adjunte una jeringa de 3 ml a la aguja 20G en el extremo del tubo con unas pinzas esterilizadas. Mantener el tubo en la bolsa.
- Inserte el otro extremo de la tubería en el colágeno neutralizado hasta que la punta está en la parte inferior del tubo cónico con unas pinzas esterilizadas. Mantenga el tubo cónico en el hielo.
- Tire del colágeno en la tubería de polietileno de retraer el émbolo de la jeringa lentamente.
Nota: Si el colágeno se tira en el tubo de forma rápida luego las burbujas se forman en el colágeno. - Después de tirar el colágeno a través del tubo, saque la aguja 20G de la tubería y colocar los dos extremos en la bolsa. Cinta de la bolsa cerrada.
- Incubar la bolsa a 37 ° C durante 60 min. Si el colágeno contiene células después poner la bolsa sobre cada 15 minutos. de modo que las células no se depositan en un lado del módulo.
5) El corte de tubo que contiene el colágeno gelificado
- Encabezados autoclave y la hoja de la herramienta de corte y bandeja para tubos.
- Montar el dispositivo de corte.
- Tubo lugar en una bandeja estéril frente de herramienta de corte y carga del tubo en el dispositivo de corte.
- Establecer un tubo cónico de 50 ml que contienen 25 ml de los medios de comunicación a la salida del dispositivo de corte para recoger los módulos de corte.
Nota: Use los medios que contiene FBS, incluso para el colágeno de sólo los módulos que los módulos no se separan de la tubería sin FBS en los medios de comunicación. Si los módulos contienen las células utilizan los medios necesarios para que las células incrustado. Si no hay células incluidas en los módulos de utilizar los medios de comunicación de las células endoteliales. - Configurar el dispositivo para el corte 2 mm de longitud de la tubería y cortar el tubo.
- Incubar corte módulos a 37 ° C durante 60 minutos en el tubo cónico de 50 ml.
6) Extracción de módulos de colágeno de la tubería
- Vortex 50 ml tubo cónico que contiene los módulos en el tubo durante 10 segundos.
Nota: Tenga cuidado al separar los módulos integrados de alta densidad celular para evitar roturas. - Deje que los módulos se depositan en el fondo del tubo. Se tarda unos 5 minutos.
- Usando una pipeta de boca ancha 10 ml serológicas de transferencia de los módulos se establecieron en un tubo cónico de 15 ml.
- Repita los pasos 6,1 hasta 6,3 veces.
- Vaya al paso 7 de módulos capa con las células endoteliales o módulos de transferencia de una placa de cultivo de tejidos no tratados.
7) Revestimiento de los módulos con las células endoteliales
- Resolver los módulos en la parte inferior de un tubo cónico de 15 ml con 5 ml de los medios de comunicación para THe integrado células.
- Retire el medio de las células endoteliales y lavar con 5 ml de PBS.
- Quitar PBS y añadir 3 ml de tripsina-EDTA.
- Se incuban las células en tripsina-EDTA durante 5 min a 37 ° C.
- Resuspender las células en 7 ml de medio.
- Recuento de células. Necesidad de 5x10 6 células endoteliales por ml de módulos de lleno en la parte inferior del tubo cónico.
- Que sedimenten las células a 300 xg durante 5 minutos y resuspender en 5 ml de medio de las células endoteliales.
- Agregar los 5 ml de los medios de comunicación que contiene las células endoteliales de los módulos.
Nota: Esto le da una proporción de 50:50 de los dos tipos de medios que hemos encontrado para trabajar para la supervivencia y la función de ambos tipos celulares. Probar el uso de un medio de co-cultivo formulado para garantizar un mantenimiento adecuado de los fenotipos de los dos tipos de células antes de usarlo. - Incubar los módulos con las células endoteliales tanto estática como dinámica.
- Para los módulos de incubación estática se mezclan con las células endoteliales de la inversión y colocar el tubo en posición vertical a 37 ° C durante 15 min. Repetir.
- Dinámica de semillas de las células endoteliales agitando suavemente el tubo a 37 ° C durante 60 min.
- Repita dos veces incubación estática.
- Coloque los módulos en una placa de cultivo de tejidos no tratados y se incuba durante la noche a 37 ° C.
- El lugar al día siguiente de los módulos en una placa de cultivo de nuevos tejidos no tratados con medio fresco (mezcla 50:50 si se utiliza el sistema de co-cultivo) para eliminar las células endoteliales sin ataduras.
- Incubar los módulos que están cubiertas con células endoteliales hasta cubrir el 100% de la superficie de los módulos. Esto generalmente toma alrededor de 7 días.
8) Los resultados representativos:
Los módulos se verá cilíndrica la primera vez que se retiran del tubo. Si los módulos contienen células integradas y / o están cubiertas con las células endoteliales que se pueden contratar hasta un 50% en volumen y desarrollan una forma oval (Figura 1). Los módulos también se volverá más densa y más opaco cuando es visualizado mediante microscopio de luz (Figura 1). Además, cuando las células endoteliales son confluentes en la superficie de los módulos hay una formación de uniones estrechas que se puede ver por inmunofluorescencia de VE-cadherina (Figura 2). El análisis de transferencia de masa se ha demostrado que los módulos son capaces de soportar altas densidades de células (8x10 7 células / cm 3), sin el desarrollo de un núcleo necrótico debido al transporte inadecuado de oxígeno, que es a menudo problemático en las grandes tejidos (por ejemplo, módulos de gran diámetro, D = 1,4 mm) (Figura 3).
Figura 1: Módulo de fabricación y la contracción. Contracción del módulo durante los tres días siguientes a HUVEC-C (línea de células endoteliales) siembra resultados significativamente menor diámetro y la longitud del módulo (p <0,001) (A). Incorporado las células HepG2 fueron distribuidos de manera uniforme dentro de los módulos en el momento de la fabricación y mantiene una alta viabilidad (B). [En vivo las células verdes, las células muertas de red] [adaptado de Corstorphine 2010]
Figura 2: VE-cadherina tinción de inmunofluorescencia de las uniones celulares CE apretado 10 días después de RAEC en cubierta en la superficie de un módulo. Barra de escala = 50 micras.
Figura 3: tricrómico de Masson de módulos típicos (0,76 mm de diámetro inicial) y los módulos de gran tamaño (1,4 mm de diámetro inicial) demostrar el efecto de las limitaciones de la difusión de oxígeno. Siete días después de la fabricación, un gran número de células muertas se había formado en el núcleo de los módulos de gran tamaño (panel inferior derecho), dejando sólo un delgado borde (~ 200μm de espesor) de células viables. Por el contrario, los pequeños módulos mantenido una distribución uniforme y elevado de células vivas. [Módulos integrados con las células HepG2 y recubierto con las células endoteliales.] [Tomado de Corstorphine 2010]
Figura 4: (A) HMEC-1 cabeza de serie en poloxamina - módulos de colágeno. Después de un día de la siembra de los módulos de colágeno poloxamina-mantienen su forma cilíndrica y no se limita propiedades adhesión celular en comparación con los módulos de colágeno solamente. Barra de escala = 200 micras. (B) Luz imagen microscópica de un módulo de colágeno que contiene PLGA basada en microesferas biodegradables. Barra de escala = 500 micras.
Figura 5: Ejemplos de ensayos in vitro. (A) ensayo de la angiogénesis: capilar como formaciones en el módulo de sembrado con las células endoteliales puede ser fácilmente detectado y cuantificado después de 5 días de incubación con las células madre derivadas de tejido adiposo. (B) las imágenes de microscopía confocal de un ensayo en vivo / muerto en los módulos donde la sTaining, de células vivas es de color verde y de células muertas es de color rojo.
Figura 6: Módulos de colágeno que contiene incrustado células madre mesenquimales y una capa superficial de células endoteliales. Los módulos fueron expuestos a la tensión de corte (~ 0,64 dinas / cm 2) durante 7 días en una cámara de microfluidos y comenzar a mostrar la fusión en los puntos de contacto. Las células endoteliales son teñidas con vWF (marrón) y los núcleos de células madre mesenquimales aparecen de color azul (H & E). Barra de escala = 100μm.
Figura 7: Cientos de módulos que contienen colágeno derivadas de tejido adiposo-Las células madre (ASC) y recubierto con células endoteliales microvasculares (HMEC) se implantan bajo la piel de ratones para estudiar ASC / HMEC interacción in vivo para las aplicaciones de la regeneración de la grasa.
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Discussion
Hemos fabricado varias diferentes micro-tejidos con módulos integrados con diferentes tipos de células 1.11. Hemos incorporado con éxito los cardiomiocitos primarios, islotes, las células adiposas madre mesenquimales y las células del estroma, así como varias líneas celulares HepG2 incluyendo, NIH 3T3 y clonar las células del hígado 9. Hemos revestido los módulos con varios tipos de células incluyendo las células endoteliales de aorta de rata endoteliales, las células endoteliales de vena umbilical y las células endoteliales microvasculares. Los módulos también se han producido con una mezcla de colágeno y un polímero poloxamina o que contengan microesferas de liberación de fármacos (Figura 4). Diversos estudios in vitro han demostrado ser compatibles con los módulos como la inmunofluorescencia, western blot, la angiogénesis, la proliferación de alamar azul y ensayos en vivo / muerto (Figura 5). También han sido utilizados en las cámaras de microfluidos (Figura 6) y se implantan en ratones y ratas (Figura 7) para estudiar la interacción entre los diferentes tipos de células y tejidos como el micro-son remodelados por la respuesta del huésped. Los módulos tienen muchas aplicaciones y puede ser utilizado para el estudio del efecto del cultivo de tejidos en 3D en las células, la interacción de las diferentes células en una conformación en 3D, la remodelación de la micro-tejidos en una cámara de microfluidos y vivo en la remodelación de la micro-tejidos por una multitud la respuesta.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El financiamiento fue proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (EB 001 013), Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud. Agradecemos al Dr. AP McGuigan por su experiencia y ayudar en el desarrollo de los módulos.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic tubing PE60 | BD Biosciences | 427416 | Different diameter of tubing can be used to change the diameter of the modules |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200-072 | |
| Purcol acidificed collagen, 3 mg/mL | Cedarlane Labs | 5005-B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 20G needle | BD Biosciences | 305175 | Diameter of the needle needs to be similar to the diameter of the tubing |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 15 mL tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2” x 13” | Cardinal Health | 92713 | |
| 10 ml Wide Tip serological pipet | BD Biosciences | 357504 | |
| 10 ml serological pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml serological pipet | BD Biosciences | 357543 |
References
- Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules. , (2010).
- Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2010).
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- McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected]. Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).
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- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design criteria for a modular tissue-engineered construct. Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules. Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).
- Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells. Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).
