Summary
Skapande av mikro-vävnader med hjälp av cylindriska kollagen gel, kallade moduler, som innehåller inbäddade celler och vilken yta är täckt med endotelceller.
Abstract
Detta protokoll beskriver tillverkning av en typ av mikro-vävnader kallas moduler. Modulen metoden genererar enhetliga, skalbara och vaskulariserad vävnader. Modulerna kan göras av kollagen samt andra gelable eller crosslinkable material. De är ca 2 mm lång och 0,7 mm i diameter vid tillverkning men krympa i storlek med inbyggda celler eller när modulerna är belagda med endotelceller. Modulerna är individuellt så liten att den inbyggda cellerna är inom diffusion gränsen för syre och andra näringsämnen, men moduler kan packas ihop till större vävnader som är perfusable. Dessa vävnader är modulära i konstruktion eftersom olika celltyper kan bäddas in i eller beläggning på modulerna innan de packade ihop för att bilda komplexa vävnader. Det finns tre huvudsakliga steg för att göra moduler: (1) neutralisera kollagen och bädda celler i den, (2) gelbildande kollagenet i röret och skära av moduler och (3) beläggning modulerna med endotelceller.
Protocol
1) Beredning av slang
- Klipp 2 till 3 m längder av polyeten slang (0,76 mm innerdiameter x 1,22 mm OD).
- Trä på en 20 G1 nål i ena änden av slangen.
- Coil slangen och placera i en omvandlare själv tätning påse (7 1 / 2 "x 13"). De två ändarna av slangen ska placeras i oförseglade slutet av påsen och tejpade på plats med gas sterilisering tejp.
- Påsen och gas sterilisera.
2) neutralisering av kollagen
Notera: 1 ml av kollagen fyller ca 2 m av polyeten slang.
- Placera den nödvändiga mängden kollagen som behövs för önskad längd av slang till en 15 ml koniska rör och håller på is.
- Tillsätt 128 ul 10x α-MEM per ml av kollagen till röret och blanda genom att upprepade gånger pipettera lösningen. Anm: (1) Lösningen ska bli gul som α-MEM blandas in i försurade kollagen och (2) försöka minimera bubblor vid blandning.
- Neutralisera kollagen genom att lägga till 0,8 M natriumbikarbonat tills kollagen har ett pH på 7,4. För en allmän uppskattning av pH lägga natriumbikarbonat tills den gula kollagen lösningen blir en ljust rosa färg. Observera: Det tar vanligen 30 till 60 mikroliter per varje ml av kollagen.
- Håll neutraliserade kollagen på is tills det ska användas som neutraliseras kollagen kommer gel om de inte förvaras vid 4 ° C.
3) Inbäddning av celler (tillval)
Obs: Beroende på vilken celltyp cellerna kan bäddas in i en koncentration av mellan 1 miljon celler per ml till 20 miljoner celler per ml. Använd mediet som krävs för de celler som du vill bädda in.
- Ta bort materialet från celler och tvätta med 5 ml PBS.
- Ta bort PBS och tillsätt 3 ml trypsin-EDTA.
- Inkubera cellerna i trypsin-EDTA i 5 minuter vid 37 ° C.
- Resuspendera cellerna i 7 ml medier.
- Räkna celler.
- Överför önskat antal celler för att bädda till en 15 ml konisk tub.
- Pellets cellerna vid 300 xg under 5 minuter.
- Sug medier bort cellpelleten.
- Resuspendera cellerna i neutraliseras kollagen och hålla på is.
4) gelbildande av collagen
- I ett biologiskt säkerhetsskåp avskurna den förseglade änden av påsen som innehåller polyeten slangen.
- Bifoga en 3 ml sprutan till 20G nålen i ena änden av slangen med hjälp av steriliserad pincett. Håll slangen i påsen.
- Sätt i den andra änden av slangen i den neutraliserade kollagen tills spetsen är i botten av den koniska röret med hjälp av steriliserad pincett. Håll koniska röret på is.
- Dra kollagen i polyeten slangen genom att dra tillbaka sprutkolven långsamt.
Obs: Om kollagen dras in slangen för att snabbt därefter bubblor bildas i kollagen. - Efter att dra kollagen genom slangen, dra 20G nålen ur slangen och sätta båda ändarna tillbaka i påsen. Tejpa påsen igen.
- Inkubera påsen vid 37 ° C i 60 min. Om kollagen innehåller celler sedan vänder påsen över varje 15 min. så att cellerna inte nöja sig till ena sidan av modulen.
5) Kapning av rör Innehåller geléartad Collagen
- Autoklav headers och blad för skärning enheten och fack för att hålla slangen.
- Montera skäranordning.
- Placera slangen i en steril bricka framför skäranordning och ladda slangen i skäranordningen.
- Sätt upp en 50 ml koniska rör som innehåller 25 ml av media vid utloppet av den skärande anordning för uppsamling av snittet moduler.
Obs: Använd media som innehåller FBS även för kollagen som endast moduler modulerna inte skild från slangen utan FBS i media. Om modulerna innehåller celler använda medierna som krävs för inbäddade cellerna. Om det inte finns några inbäddade celler i modulerna använda medierna för endotelceller. - Ställ in skäranordning att skära 2 mm slanglängder och skär slangen.
- Inkubera skära moduler vid 37 ° C i 60 min i 50 ml koniska rör.
6) Ta bort Kollagen moduler från Slangar
- Vortex 50 ml koniska rör som innehåller moduler i slangen i 10 sek.
Obs: Var försiktig när separera moduler inbäddade med hög celltäthet att undvika brott. - Låt modulerna sjunker till botten av röret. Tar ca 5 min.
- Med hjälp av en bred mun 10 ml serologisk pipett överföra fasta moduler till ett 15 ml koniskt rör.
- Upprepa steg från 6,1 till 6,3 gånger.
- Gå till steg 7 att bestryka moduler med endotelceller eller moduler överföring till en icke-vävnadsodling behandlad plåt.
7) Beläggning modulerna med endotelceller
- Lösa moduler i botten av en 15 ml koniska rör med 5 mL media för the inbäddade celler.
- Ta bort materialet från endotelceller och tvätta med 5 ml PBS.
- Ta bort PBS och tillsätt 3 ml trypsin-EDTA.
- Inkubera cellerna i trypsin-EDTA i 5 minuter vid 37 ° C.
- Resuspendera cellerna i 7 ml medier.
- Räkna celler. Behöver 5x10 6 endotelcellerna per mL packade moduler på botten av den koniska röret.
- Pellets cellerna vid 300 xg under 5 minuter och återsuspendera i 5 ml endotelceller medier.
- Tillsätt 5 ml av mediet med endotelceller till modulerna.
Obs: Detta ger en 50:50 förhållandet mellan två typer av media som vi har hittat för att arbeta för överlevnad och funktion av båda celltyper. Testa att använda en co-odlingsmedium formulerade för att säkerställa korrekt underhåll av fenotyper av de två cellerna typerna innan du använder den. - Inkubera moduler med endotelceller både statiskt och dynamiskt.
- För statiska inkubation blanda moduler med endotelceller genom inversion och ställa röret upprätt vid 37 ° C i 15 min. Upprepa.
- Dynamiskt frö endotelcellerna genom att skaka röret vid 37 ° C i 60 min.
- Upprepa statiska inkubation två gånger.
- Placera moduler i en icke-vävnadsodling behandlas plattan och inkubera över natten vid 37 ° C.
- Nästa dag placera moduler i en ny icke-vävnad som behandlats kultur tallrik med färska medier (50:50 mix om du använder co-kultur-system) för att avlägsna lös endotelceller.
- Inkubera moduler som är belagda med endotelceller tills de täcker 100% av ytan av modulerna. Det tar vanligtvis cirka 7 dagar.
8) representativa resultat:
Modulerna kommer att se cylindrisk när de först tas bort från röret. Om modulerna innehåller inbäddade celler och / eller är belagda med endotelceller kan de kontrakt upp till 50% i volym och utveckla en oval form (Figur 1). Modulerna kommer också att bli tätare och mer svårbegripligt när de ses genom ljusmikroskop (Figur 1). Även när endotelceller är konfluenta på ytan av modulerna finns en bildning av tight junctions som kan ses av immunofluorescens färgning av VE-cadherin (figur 2). Massöverföring analys har visat att modulerna kan stödja hög cell densitet (8x10 7 celler / cm 3) utan att utveckla en nekrotiska kärnan på grund av otillräcklig syretransport, vilket ofta är problematiskt i större vävnader (t.ex. moduler med stor diameter, D = 1,4 mm) (Figur 3).
Figur 1: Modul tillverkning och kontraktion. Modul kontraktion inträffat under de tre dagarna efter HUVEC-C (endotel linje) sådd resultat betydligt mindre modul diameter och längd (p <0,001) (A). Inbäddade HepG2 celler jämnt fördelad inom moduler vid tidpunkten för tillverkning och bibehållen hög lönsamhet (B). [Levande celler grönt, döda celler röd] [anpassas från Corstorphine 2010]
Figur 2: VE-cadherin immunofluorescerande färgning av EG tight cell junctions 10 dagar efter RAEC var belagd på ytan av en modul. Skala bar = 50 ìm.
Figur 3: Massons trikrom färgning av typiska moduler (0,76 mm ursprungliga diameter) och stora moduler (1,4 mm ursprungliga diameter) visar effekten av begränsningar syre diffusion. Sju dagar efter tillverkning, hade ett stort antal döda celler bildas i kärnan av den stora moduler (nedre högra panelen), vilket innebär att endast en tunn kant (~ 200μm tjock) livskraftiga celler. Omvänt behöll små moduler en enhetlig och hög fördelning av levande celler. [Moduler inbäddade med HepG2 celler och belagd med endotelceller.] [Taget från Corstorphine 2010]
Figur 4: (A) HMEC-1 seedade på poloxamine - kollagen moduler. Efter dag 1 i sådd den poloxamine-kollagen moduler behåller sin cylindriska form och det finns begränsad cellbindning egenskaper jämfört med kollagen bara moduler. Skala bar = 200 ìm. (B) ljusmikroskop bilden av en kollagen modul innehåller PLGA-baserade biologiskt nedbrytbara mikrosfärer. Skala bar = 500 ìm.
Figur 5: Exempel på in vitro. (A) Angiogenes analysen: kapillär-liknande formationer på modulen ympats med endotelceller lätt kan upptäckas och kvantifieras efter 5 dagars inkubation med fett-derived stamceller. (B) konfokalmikroskopi bilder av en levande / döda analys på moduler där slande av levande celler är grön och döda celler är röd.
Figur 6: Kollagen moduler som innehåller inbäddade mesenkymala stamceller och ett ytskikt av endotelceller. Moduler utsattes för skjuvspänning (~ 0,64 dyn / cm 2) under 7 dagar i ett mikroflödessystem kammare och börja visa fusion på kontaktpunkter. Endotelceller färgas med vWF (brun) och mesenkymala stamceller kärnor visas blå (H & E). Skala bar = 100μm.
Figur 7: Hundratals kollagen moduler som innehåller Adipose-stamceller (ASC) och överdragna med mänskliga endotelceller i små kärl (HMEC) är implanteras under huden på möss att studera ASC / HMEC interaktion in vivo för fett förnyelse applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har tillverkat flera olika mikro-vävnader med hjälp av moduler som ingår i olika celltyper 1-11. Vi har framgångsrikt inbäddade primära cardiomyocytes, holmar, fett stamceller och mesenkymala stromaceller samt flera cellinjer inklusive HepG2, NIH 3T3 och klona 9 leverceller. Vi har belagt moduler med flera typer av endotelceller inklusive endotel råtta aorta celler, mänskliga navelsträngen ven endotelceller och mänskliga mikrovaskulära endotelceller. Moduler har också tagits fram med en blandning av kollagen och en poloxamine polymer eller innehåller läkemedelsavgivande mikrosfärer (Figur 4). Flera in vitro-tester har visat sig vara kompatibel med moduler inklusive immunofluorescens, Western Blot, angiogenes, Alamar blå spridning och live / döda tester (Figur 5). De har också använts i mikroflödessystem kammare (Figur 6) och förs in möss och råttor (Figur 7) för att studera samspelet mellan olika celltyper och hur mikro-vävnader ombyggda av värdlandet svar. Moduler har många användningsområden och kan användas för att studera effekten av 3D vävnadsodling på celler, samspelet mellan olika celler i en 3D-konformation, omdaning av mikro-vävnader i en mikroflödessystem kammare och in vivo ombyggnad av mikro-vävnader genom en mängd svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Finansiering gavs av National Institutes of Health (EB 001.013), naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada och den kanadensiska Institutes of Health Research. Vi tackar Dr AP McGuigan för sin expertis och hjälp i utvecklingen av moduler.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic tubing PE60 | BD Biosciences | 427416 | Different diameter of tubing can be used to change the diameter of the modules |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200-072 | |
| Purcol acidificed collagen, 3 mg/mL | Cedarlane Labs | 5005-B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 20G needle | BD Biosciences | 305175 | Diameter of the needle needs to be similar to the diameter of the tubing |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 15 mL tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2” x 13” | Cardinal Health | 92713 | |
| 10 ml Wide Tip serological pipet | BD Biosciences | 357504 | |
| 10 ml serological pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml serological pipet | BD Biosciences | 357543 |
References
- Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules. , (2010).
- Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2010).
- Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats. Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).
- Leung, B. M., Sefton, M. V. A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells. Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).
- McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected]. Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct. J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering. Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design criteria for a modular tissue-engineered construct. Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules. Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).
- Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells. Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).
