Summary
Gömülü hücreler ve yüzey içeren modüller olarak adlandırılan silindirik kollajen jeller, mikro-dokuların oluşturulması endotel hücreleri ile kaplanmıştır.
Abstract
Bu protokol, modüller olarak adlandırılan mikro-dokuların bir tür fabrikasyon açıklamaktadır. Modülü yaklaşım, üniforma, ölçeklenebilir ve vaskülarize doku üretir. Modülleri kollajen yanı sıra diğer gelable veya çapraz bağlanabilir malzemeler yapılabilir. Onlar imalat üzerine çapı yaklaşık 2 mm uzunluğunda ve 0.7 mm ama gömülü hücreleri veya modülleri endotel hücreleri ile kaplıdır boyutu küçültmek. Modüllerin ayrı ayrı gömülü hücreler oksijen ve diğer besinleri difüzyon sınırı içinde ama modülleri perfusable olan büyük dokular oluşturmak için birlikte paketlenmiş olabilir bu kadar küçük. Bu dokular, farklı hücre türleri, karmaşık dokuları oluşturmak için birlikte paketlenmiştir önce gömülü veya modülleri kaplı olabilir çünkü inşaat modüler. Modülleri yapmak için üç temel adım vardır: (1) kollajen nötralize ve bu hücreleri gömerek, tüp içinde (2) jelleşme kolajen ve endotel hücreleri ile modülleri ve (3) kaplama modülleri kesme.
Protocol
1) Boru hazırlanması
- Polietilen borular 2 ila 3 m uzunluğunda (0,76 mm ID x 1.22 mm OD) kesin.
- Hortumun bir ucunu 20 G1 İğneyi.
- Dönüştürücüler kendini kapatmalı (7 1 / 2 "x 13") Bobin boru ve yer. Hortumun iki ucu çanta kaplanmadan sonunda yerleştirilir ve yerde gaz sterilizasyon bandı ile bantlanmış olmalıdır.
- Mühür çanta ve gaz sterilize edin.
2) Nötralizasyon Kollajen
Not: 1 ml kollajen, yaklaşık 2 metre polietilen boru doldurur.
- 15 ml konik bir tüp içine boru istenilen uzunlukta için gerekli kollajen gerekli miktarda koyun ve buz üzerinde tutmak.
- 128 uL 10x α-MEM başına mL tüp ve art arda çözüm pipetleme karıştırın kollajen. Not: (1) çözüm asitlendirilmiş kollajen α-MEM sarı karışık açmalısınız ve (2) karıştırma kabarcıkları en aza indirmeye çalışın.
- Kollajen 7.4 pH kadar 0.8 M sodyum bikarbonat ekleyerek kollajen nötralize. PH eklemek sodyum bikarbonat genel bir tahmin için sarı kollajen çözümü açık pembe renk olana kadar. Not: Bu genellikle kollajen her ml başına 30 ila 60 mcL alır.
- Nötralize kolajen olarak kullanmak için hazır olana kadar jel 4 tutulması değilse etkisiz hale kollajen buz üzerinde tutun ° C
3) Hücre Gömme (isteğe bağlı)
Not: hücreler, hücre tipine bağlı olarak bir konsantrasyon ml başına 20 milyon hücre ml başına 1 milyon hücre arasında gömülü olabilir. Gömmek istediğiniz hücreleri için gerekli ortamı kullanın.
- Hücrelerden ortamı çıkarın ve 5 ml PBS ile yıkayın.
- PBS çıkarın ve 3 ml tripsin-EDTA ekleyin.
- 37 °, 5 dakika boyunca tripsin-EDTA hücrelerin inkübe ° C
- 7 ml medya hücrelerin tekrar
- Hücreleri saymak.
- 15 ml konik tüp gömmek için gerekli sayıda hücre aktarın.
- Pelet 5 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri.
- Kapalı hücre pelletini medya aspire.
- Nötralize kolajen hücrelerinin yeniden süspanse edin ve buz üzerinde tutmak.
4) Jelleşme Kollajen
- Biyolojik güvenlik kabini polietilen boru içeren torba mühürlü ucunu kesti.
- Bir ucunu sterilize cımbız kullanarak boru için 3 ml şırınga 20G iğne takın. Tüp torba içinde saklayın.
- Hortumun diğer ucunu steril cımbız kullanarak konik tüp alt ucu kadar nötralize kollajen içine yerleştirin. Konik tüp buz üzerinde tutun.
- Polietilen boru içine yavaş yavaş şırınga pistonu geri çekilmeden kollajen çekin.
Not: kollajen hızlı kollajen sonra kabarcıklar oluşturacak boru içine çekilir. - Tüp yoluyla kollajen çekilmesinden sonra, boru 20G iğne çekin ve her iki ucunda çantaya geri koymak. Teyp çanta kapattı.
- 60 dakika için 37 ° C çanta inkübe edin. Kollajen hücreler içeriyorsa, her 15 dakika içinde çanta çevirin. böylece hücrelerin modülün bir tarafında razı olmayın.
5) Boru kesimi jel Kollajen İçeren
- Otoklav başlıkları ve bıçak kesme cihazı ve tüp tutmak için tepsi.
- Kesme cihazı birleştirin.
- Kesme aleti önünde steril bir tepsiye yerleştirin boru ve boru kesme cihazı yerleştirin.
- 50 ml konik boru kesme cihazı çıkışında kesme modülleri toplamak için 25 ml medya içeren bir ayarlayın.
Not: modülleri medya FBS olmadan boru ayrı olarak sadece kolajen modüller için bile FBS içeren medya kullanın. Eğer modülleri içeren hücrelerin gömülü hücreler için gerekli olan medya kullanımı. Modüller hiçbir gömülü hücreler endotel hücreleri için ortam varsa kullanın. - 2 mm uzunlukta boru kesme ve boru kesmek için kesme cihazı ayarlayın.
- 37 ° kesme modülleri inkübe ° C 50 ml konik tüp içinde 60 dk.
6) Boru Kollajen Modüllerini Çıkarma
- 10 sn için tüp modülleri içeren Vortex 50 ml konik boru.
Not: kırılmaları önlemek için yüksek hücre yoğunluğu ile gömülü modüller ayıran zaman nazik olun. - Modülleri tüpün dibine dinlendiriniz. Yaklaşık 5 dakika sürer.
- Geniş bir ağız 10 ml serolojik pipet kullanarak yerleşik modülleri 15 ml konik tüp transferi.
- 6,1-6,3 adımları iki kez tekrarlayın.
- Olmayan bir doku kültürü tedavi plaka endotel hücreleri ya da transfer modülleri ile kat modülleri için 7. adıma gidin.
7) Kaplama endotel hücreleri ile modülleri
- Th için medya 5 ml, 15 ml konik tüp dibine modülleri Settlee gömülü hücreler.
- Endotel hücreleri medya çıkarın ve 5 ml PBS ile yıkayın.
- PBS çıkarın ve 3 ml tripsin-EDTA ekleyin.
- 37 °, 5 dakika boyunca tripsin-EDTA hücrelerin inkübe ° C
- 7 ml medya hücrelerin tekrar
- Hücreleri saymak. Konik tüpün dibinde paketlenmiş modülleri mL başına 5x10 6 endotel hücreleri ihtiyacınız var.
- Pelet 300 xg'de 5 dakika ve 5 ml endotel hücre medya tekrar süspansiyon hücreleri.
- Modülleri endotel hücreleri içeren medyanın 5 ml ekleyin.
Not: Bu, biz, her iki hücre tipinin sağkalım ve işlevi için çalışmak bulduk iki medya türleri 50:50 oranı verir. Kullanmadan önce, iki hücre tiplerinin fenotipleri uygun bakım sağlamak için formüle edilmiş bir ko-kültür ortamında test edin. - Endotel hücreleri ile hem statik ve dinamik modülleri inkübe edin.
- Tersine çevirerek statik inkübasyon karışımı endotel hücreleri ile modülleri ve 37 ° dik tüp seti ° C de 15 dakika. Tekrarlayın.
- 37 ° tüp hafifçe sallanan tarafından dinamik tohum endotel hücreleri ° C de 60 dakika.
- Statik inkübasyon iki kez tekrarlayın.
- Olmayan doku kültürü tedavi plaka modülleri yerleştirin ve 37 ° gece inkübe ° C
- Taze medya ile yeni bir non-doku kültürü tedavi plaka ertesi gün yerine modülleri (50:50 karışımı kullanmadan ko-kültür sistemi) unattached endotel hücreleri çıkarmak için.
- Modülleri yüzeyinin% 100 kapağı kadar endotel hücreleri ile kaplı modüllerin inkübe edin. Bu genellikle 7 gün sürer.
8) Temsilcisi Sonuçlar:
Ilk tüp çıkarılır modülleri silindirik bakacağız. Modülleri gömülü hücreleri içeren ve / veya endotel hücreleri ile kaplı hacim olarak% 50 kadar sözleşme ve oval bir şekil (Şekil 1) geliştirmek. Modülleri de ışık mikroskobu (Şekil 1) bakıldığında daha yoğun ve daha opak hale gelecektir. Ayrıca endotel hücreleri, modülleri yüzeyinde konfluent zaman VE-Cadherin immünofloresan boyama (Şekil 2) tarafından görülebilir sıkı bağlantıları bir oluşum var. Kütle transferi analizi modülleri, yetersiz oksijen taşıma, (örneğin büyük çaplı modülleri, D = 1.4, büyük dokular genellikle sorunlu nedeniyle nekrotik çekirdek gelişmekte olmadan yüksek hücre yoğunluğu (8x10 7 hücre / cm 3) destekleme yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir mm) (Şekil 3).
Şekil 1: Modül imalat ve daralma. Modül daralma tohumlama daha küçük modül çapı ve uzunluğu (p <0,001) (A) sonuçları HUVEC-C (endotelyal hücre hattı) takip eden üç gün boyunca oluştu. Gömülü HepG2 hücreleri düzgün uydurmalarla zamanda modülleri içinde dağıtılmış ve (B) yüksek canlılığını korudu. [Hücreleri yeşil Live ölü hücreleri kırmızı], [2010 Corstorphine adapte]
Şekil 2: bir modül yüzeyi kaplı AT RAEC 10 gün sonra sıkı hücre kavşak VE Cadherin immunofluorescent boyama. Ölçek çubuğu = 50 mm.
Şekil 3: Masson tipik modülleri trikrom boyama (0.76 mm başlangıç çapı) ve büyük modüller (1.4 mm başlangıç çapı), oksijen difüzyon sınırlamaları etkisi göstermektedir . Imalat aşağıdaki yedi gün, ölü hücrelerden çok sayıda canlı hücreler sadece ince bir jant (~ 200μm kalın) bırakarak, büyük modülleri (sağ alt panel) çekirdek içinde kurmuştu. Tersine, küçük modülleri canlı hücreler bir üniforma ve yüksek dağıtım korudu. [Modülleri, HepG2 hücreleri ile gömülü ve endotel hücreleri ile kaplı.] [Corstorphine 2010 tarihinden itibaren Çekildiği]
Şekil 4: (A) poloxamine HMEC-1 numaralı seribaşı kollajen modülleri. Poloxamine-kollajen modülleri, silindir şeklinde korumak ve sınırlı hücre eki özellikleri kollajen sadece modülleri göre ekim 1 Gün sonra. Ölçeği bar = 200 mm. PLGA tabanlı biyobozunur mikroküreler içeren bir kollajen modülü (B) Işık mikroskop görüntüsü. Ölçeği bar = 500 mm.
Şekil 5: in vitro tayinlerde örnekleri. (A) Anjiyogenez tahlil: kapiller benzeri oluşumlar endotel hücreleri ile seribaşı modül yağ elde edilen kök hücreleri ile kolayca tespit edilir ve inkübasyon 5 gün sonra sayısal olabilir. (B) s modülleri canlı / ölü testinin mikroskopisi görüntülericanlı hücreler için yerleştirme yazılımı yeşil ve ölü hücreleri için kırmızı.
Şekil 6: Kollajen gömülü mezenkimal kök hücreleri ve endotel hücreleri bir yüzey tabakası içeren modüller. Modüller mikroakışkan odasında 7 gün kayma gerilmesi (~ 0.64 dyn / cm 2) maruz kalan ve temas noktalarında füzyon göstermeye başlar. Endotel hücreleri vWF (kahverengi) ile boyandı ve mezenkimal kök hücre çekirdekleri mavi (H & E) görünür. Ölçek çubuğu = 100μm.
Şekil 7: Yağ elde edilen kök hücreler (ASC) ve İnsan mikrovasküler endotel hücreleri ile kaplı içeren kollajen modülleri yüzlerce (HMEC) ASC / HMEC yağ rejenerasyon uygulamalar için in vivo etkileşim çalışmasında fare cilt altına yerleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz farklı hücre tipleri 1-11 gömülü modüllerini kullanarak birçok farklı mikro-dokulara fabrikasyon var. Biz başarıyla birincil kardiyomiyositlerde, adacıklar, yağ kök hücreler ve mezenkimal stromal hücrelerinin yanı sıra HepG2, NIH 3T3 ve klon 9 karaciğer hücreleri de dahil olmak üzere çok sayıda hücre hatları gömülü. Biz, sıçan aort endotel hücreleri, insan umbilikal ven endotel hücreleri ve insan mikrovasküler endotel hücreleri de dahil olmak üzere endotel hücreleri çeşitli modülleri kaplı. Modüller aynı zamanda kolajen ve poloxamine polimer veya ilaç salınımlı mikroküreler (Şekil 4) içeren bir karışımı ile üretilmiştir. Çok sayıda in vitro tayinlerde immünofloresan, western blot, anjiyogenez, Alamar mavi proliferasyon ve canlı / ölü testleri (Şekil 5) de dahil olmak üzere modülleri ile uyumlu olacak şekilde gösterilmiştir. Ayrıca mikroakışkan odaları (Şekil 6) kullanılan ve fare ve sıçanlar (Şekil 7), farklı hücre türleri arasındaki ve mikro-dokular konak cevabı tarafından remodeled etkileşim çalışması içine implante edilmiştir. Modüller pek çok uygulama var ve bir ev sahibi tarafından mikroakışkan odasında mikro dokuların remodeling 3D doku kültür hücreleri üzerinde etkisi çalışmada, 3D yapısındaki farklı hücre etkileşimi ve mikro-dokuların vivo remodeling kullanılabilir yanıtı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Finansman Ulusal Sağlık Enstitüsü (EB 001.013), Fen Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri tarafından sağlanmıştır. Biz onun uzmanlık için Dr. AP McGuigan'ın teşekkür ve modüllerin geliştirilmesi yardımcı.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intramedic tubing PE60 | BD Biosciences | 427416 | Different diameter of tubing can be used to change the diameter of the modules |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200-072 | |
| Purcol acidificed collagen, 3 mg/mL | Cedarlane Labs | 5005-B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 20G needle | BD Biosciences | 305175 | Diameter of the needle needs to be similar to the diameter of the tubing |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309585 | |
| 15 mL tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2” x 13” | Cardinal Health | 92713 | |
| 10 ml Wide Tip serological pipet | BD Biosciences | 357504 | |
| 10 ml serological pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml serological pipet | BD Biosciences | 357543 |
References
- Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules. , (2010).
- Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2010).
- Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats. Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).
- Leung, B. M., Sefton, M. V. A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells. Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).
- McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected]. Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct. J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering. Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design criteria for a modular tissue-engineered construct. Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules. Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).
- Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells. Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).
