Summary
Cette vidéo montre comment provoquer hypophysite auto-immunes chez la souris SJL et comment évaluer sa gravité par histopathologie.
Abstract
Hypophysite auto-immunes peuvent être reproduits expérimentalement par l'injection de protéines pituitaires mélangé à un adjuvant dans des souris sensibles 1. Des modèles murins nous permettra d'étudier comment les maladies se dérouler, offrant souvent une bonne réplique des mêmes processus survenant chez les humains. Pour certaines maladies auto-immunes, comme le diabète de type 1A, il existe des modèles (la souris NOD) qui développent spontanément une maladie similaire à l'homologue humain. Pour beaucoup d'autres maladies auto-immunes, cependant, le modèle doit être induite expérimentalement. Une approche commune à cet égard consiste à injecter de la souris avec un antigène dominant dérivé de l'organe étudié. Par exemple, les enquêteurs s'intéressent à injecter de thyroïdite auto-immune des souris avec de la thyroglobuline 2, et ceux qui s'intéressent à la myasthénie les injecter avec le récepteur 3 acétylcholine. Si l'autoantigène pour une maladie auto-immune particulière n'est pas connu, les enquêteurs injecter un extrait protéique brut de l'organe ciblé par la réaction auto-immune. Pour hypophysite auto-immunes, l'autoantigène pathogène (s) restent à identifier 4, et donc une préparation de protéine brute pituitaire est utilisé. Dans cet article, nous montrons comment la vidéo pour induire expérimentale auto-immune dans hypophysite souris SJL.
Protocol
Protocole expérimental
Une fois que l'immunogène hypophyse est préparé (voir article connexe), il est injecté par voie sous cutanée dans des souris SJL (Les Jackson Laboratories, stock 000686). Une seconde injection identique est répété 7 jours plus tard. Les souris sont ensuite utilisées pour recueillir in vivo et post mortem des résultats.
Etape 1. Injection sous-cutanée d'immunogène hypophysaire chez la souris SJL
Sont d'abord anesthésiés souris par l'injection de 0,5 ml de 20 mg / ml de 2,2,2-tribromoéthanol (Avertin, TCI America, T-1420) par voie intrapéritonéale. Les souris sont ensuite injectés par voie sous cutanée avec 100 pi de l'émulsion hypophyse qui, comme indiqué dans le compagnon JoVE 2181 article, contient 1 mg d'extrait pituitaire et 0,25 mg d'adjuvant complet de Freund. L'émulsion est injectée dans la région dorsale de la jambe gauche derrière ((50 pi) et la région inguinale droite (50 pi). L'émulsion hypophyse est injecté à nouveau sur 7 jours dans les sites opposée (50 pi dans la région de la jambe droite de derrière et dorsale 50 ul de la région inguinale gauche). Les souris sont surveillés tous les jours pour les 3 premiers jours, puis chaque semaine jusqu'à ce que le jour du sacrifice, qui est généralement 28 jours après la première immunisation.
Etape 2. Collecte des résultats en vivo: tests sanguins
Le tissu le plus couramment utilisé pour évaluer les résultats expérimentaux alors que les souris sont encore vivants est le sang. Le sang est systématiquement établi 14 jours après la première immunisation pour mesurer les taux sériques d'anticorps hypophyse ou d'autres marqueurs comme les cytokines et chimiokines.
Le sang est recueilli à partir des souris vivantes comme suit. Les souris sont solidement maintenu par la peau du cou et le dos de la mâchoire est situé. Une fois l'arrière de la mâchoire est situé, 4 lancettes mm sont utilisées pour percer le bundle submandibulaires vasculaire. Après le sang est recueilli, la pression sur l'endroit sur la surface à l'aide d'un tampon imbibé d'alcool pour éviter un hématome. Sang recueilli est centrifugé à 2000 g pendant 20 minutes, et conservés à -80 ° C jusqu'à leur utilisation.
Étape 3. Collecte des résultats post-mortem: l'hypophyse histopathologie
Les souris sont généralement sacrifiés 28 jours après la première immunisation. La fonction cardinale nécessaires pour établir le diagnostic de l'EAH est l'infiltration de la glande pituitaire par les cellules mononucléées hématopoïétiques.
Les souris sont euthanasiées en les plaçant dans une chambre de plastique scellé qui est perfusée avec du CO 2. Les souris sont conservés dans la chambre pour un total de 8 minutes. Après l'euthanasie, la glande pituitaire est recueilli comme décrit dans l'article compagnon. Une glande pituitaire malades apparaît enflée et plus fermement adhérente à la dure entourant mère. Pince de Sharp sont utilisés pour assouplir les méninges autour de la glande pituitaire. Une fois l'hypophyse se déplace librement sur l'os sphénoïde, un bout de la glande pituitaire est saisi avec une pince et la glande pituitaire est soigneusement levées. La glande est ensuite placé dans un microtube contenant 5 fixateur de Beckstead. La glande pituitaire est fixe pendant la nuit, enveloppés dans du papier lentille, et placé dans une cassette. Les glandes sont ensuite traitées selon le protocole suivant:
| Numéro de la station | Réactifs | Temps en minutes | De température (Celsius) |
| 1 | 70% d'alcool | 5 | 25 |
| 2 | 70% d'alcool | 15 | 25 |
| 3 | 95% d'alcool | 15 | 25 |
| 4 | 95% d'alcool | 15 | 25 |
| 5 | D'alcool à 100% | 15 | 25 |
| 6 | D'alcool à 100% | 7.5 | 25 |
| 7 | D'alcool à 100% | 7.5 | 25 |
| 8 | xylène | 20 | 25 |
| 9 | xylène | 20 | 25 |
| 10 | xylène | 25 | |
| 11 | paraffine | 30 | 58 |
| 12 | paraffine | 5 | 58 |
| 13 | paraffine | 5 | 58 |
Après le traitement, l'hypophyse sont inclus dans la paraffine et au moins 5 sections non consécutifs (5-um d'épaisseur) sont découpées dans chaque glande. Après sectionnement, les glandes sont colorées à l'hématoxyline et l'éosine, et analysées afin de quantifier l'infiltration de mononucléaires. La section avec l'infiltration la plus sévère est sélectionné pour la notation. La gravité est marqué basée sur une estimation subjective de la mesure de remplacement hypophyse antérieure ou la destruction par les cellules immunitaires: grade 0, aucune maladie, grade 1, 2% -20% la participation; de grade 2, 20% -30%, grade 3, 30% -50%; grade 4, 50% -90%; grade 5, plus de 90%. Toutes les sections sont marqués par deux individus aveuglés à la source des sections.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Quatre techniques ont été signalés à induire hypophysite animaux de laboratoire. La technique décrite dans cet article, qui est l'injection de protéines pituitaires mélangé avec un adjuvant de Freund s, est la plus ancienne, datant de 1967 6, et a été amélioré, plus récemment, 1. D'autres techniques sont l'injection de glycoprotéines solubles virus de la rubéole en 1992 7, l'injection stéréotaxique d'un adénovirus directement dans la glande pituitaire en 2002 8, et la transplantation de glandes pituitaires d'une souche de rat sous la capsule rénale d'une autre souche de rat en 2010 9 . Le principal avantage de l'approche de l'adjuvant de Freund s est qu'elle est moins invasive, plus cohérente et, surtout, plus précis dans l'induction d'une maladie qui ressemble de près à l'homologue humain. La technique décrite dans cet article la vidéo donne un modèle reproductible de hypophysite, qui peut être utilisé par les enquêteurs afin d'améliorer notre compréhension de cette maladie fascinante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par NIH DK080351 au PC, et par un généreux don de la course Terry et Kristine Gore famille.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SJL mice (The Jackson Laboratories) | stock 000686 | ||
| 2,2,2-Tribrom–thanol (Avertin) | TCI America | T-1420 | |
| Beckstead’s fixative |
References
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. , (2008).
- Twarog, F. J., Rose, N. R. The production of thyroid autoantibodies in mice. J Immunol. 101, 242-2450 (1968).
- Patrick, J., Lindstrom, J. Autoimmune response to acetylcholine receptor. Science. 180, 871-872 (1973).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
- Beckstead, J. H. A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum. J Histochem Cytochem. 43, 345-345 (1995).
- Levine, S. Allergic adenophypophysitis: new experimental disease of the pituitary gland. Science. 158, 1190-1191 (1967).
- Yoon, J. W., Choi, D. S., Liang, H. C., Baek, H. S., Ko, I. Y., Jun, H. S., Gillam, S. Induction of an organ-specific autoimmune disease, lymphocytic hypophysitis, in hamsters by recombinant rubella virus glycoprotein and prevention of disease by neonatal thymectomy. Journal of Virology. 66, 1210-1214 (1992).
- Davis, J. R., McMahon, R. F., Lowenstein, P. R., Castro, M. G., Lincoln, G. A., McNeilly, A. S. Adenovirus-mediated gene transfer in the ovine pituitary gland is associated with hypophysitis. J Endocrinol. 173, 265-271 (2002).
- Rotondo, F., Quintanar-Stephano, A., Asa, S. L., Lombardero, M., Berczi, I., Scheithauer, B. W., Horvath, E., Kovacs, K. Adenohypophysitis in rat pituitary allografts. Int J Exp Pathol. , (2010).
