Summary
Dieses Video zeigt, wie autoimmune Hypophysitis in SJL Mäusen und wie sie ihre Strenge durch Histopathologie beurteilen zu induzieren.
Abstract
Autoimmune Hypophysitis kann experimentell durch die Injektion von Hypophysen-Proteine mit einem Adjuvans in anfälligen Mäusen 1 gemischt wiedergegeben werden. Mausmodelle erlauben uns zu untersuchen, wie Krankheiten zu entfalten, bieten häufig eine gute Nachbildung der gleichen Prozesse beim Menschen auftreten. Für einige Autoimmunerkrankungen wie Typ 1A Diabetes, gibt es Modelle (der NOD-Maus), die spontan ein Krankheitsbild ähnlich wie das menschliche Gegenstück. Für viele andere Autoimmunerkrankungen, muss jedoch das Modell experimentell induziert werden. Ein gemeinsamer Ansatz in dieser Hinsicht ist die Maus mit einer dominanten Antigen aus dem Organ untersucht abgeleitet injizieren. Zum Beispiel, injizieren Forscher im Bereich der Autoimmun-Thyreoiditis interessiert Mäuse mit Thyreoglobulin 2, und derjenigen, die unter Myasthenia gravis interessiert spritzen sie mit der Acetylcholin-Rezeptor 3. Wenn das Autoantigen für einen bestimmten Autoimmunerkrankungen nicht bekannt ist, injizieren Forscher eine Proteinrohextrakt von der Orgel durch die Autoimmunreaktion ausgerichtet. Für autoimmune Hypophysitis, bleiben die pathogenen Autoantigen (s) zu identifizieren 4, und damit eine grobe Hypophyse Protein-Präparation verwendet. In diesem Video-Artikel werden wir zeigen, wie experimentelle autoimmune Hypophysitis in SJL Mäusen zu induzieren.
Protocol
Experimentelles Protokoll
Sobald die Hypophyse Immunogen bereit ist (siehe begleitende Artikel), ist es subkutan in SJL Mäusen (The Jackson Laboratories, hat 000.686) injiziert. Eine zweite, identische Injektion ist 7 Tage später wiederholt. Mäuse werden dann verwendet, um in vivo und post-mortem Ergebnisse zu sammeln.
Schritt 1. Die subkutane Injektion von Hypophysen-Immunogen in SJL Mäusen
Mäuse werden zunächst betäubt durch die Injektion von 0,5 ml 20 mg / ml 2,2,2-Tribromethanol (Avertin, TCI America, T-1420) intraperitoneal. Mäuse werden dann subkutan mit 100 ul der Hypophyse Emulsion, die, wie in der Begleiter angegeben 2181 Artikel JoVE injiziert, enthält 1 mg Hypophysenextrakt und 0,25 mg von komplettem Freund-Adjuvans. Die Emulsion wird in der linken dorsalen Hinterbein Region ((50 ul) und der rechten Leistengegend (50 ul) injiziert. Die Hypophyse Emulsion wieder an Tag 7 in den gegenüberliegenden Seiten (50 ul in der rechten dorsalen Hinterbein Region und injiziert 50 pl in der linken Leistengegend). Mäuse sind täglich für die ersten 3 Tage überwacht und dann wöchentlich bis zum Tag der Opfer, die in der Regel 28 Tage nach der ersten Immunisierung.
Schritt 2. Sammlung von in-vivo-Ergebnisse: Blood Assays
Das Gewebe am häufigsten verwendet werden, um experimentelle Ergebnisse zu bewerten, während die Mäuse noch am Leben ist Blut. Blut wird routinemäßig 14 Tage nach der ersten Immunisierung, die Serumspiegel von Hypophyse Antikörpern oder anderen Markern wie Zytokine und Chemokine zu messen gezogen.
Blut wird von lebenden Mäusen wie folgt gesammelt. Mäuse sind sicher durch die Genick gehalten und die Rückseite der Kieferknochen befindet. Sobald der Rückseite des Kieferknochens befindet, sind 4 mm Lanzetten zu durchbohren die submandibularis Leitbündel verwendet. Nach Blut gesammelt, mit Druck auf den auf dem Gelände einen Alkoholtupfer, um ein Hämatom zu vermeiden. Gesammelte Blut wird bei 2.000 g für 20 Minuten zentrifugiert und bei -80 ° C bis zur Verwendung.
Schritt 3. Sammlung von Post-mortem-Ergebnisse: Pituitary Histopathologie
Mäuse sind in der Regel 28 Tage nach der ersten Immunisierung geopfert. Der Kardinal-Funktion notwendig, um die Diagnose von EAH zu etablieren ist die Infiltration der Hypophyse durch hämatopoetische mononukleären Zellen.
Mäuse sind, indem man sie in einem verschlossenen Plastikbeutel Kammer, die mit CO 2 durchströmt wird eingeschläfert. Mäuse sind in der Kammer für insgesamt 8 Minuten gehalten. Nach Euthanasie, ist die Hypophyse gesammelt wie in der Begleitung Artikel beschrieben. Eine erkrankte Hypophyse erscheint geschwollen und mehr fest mit dem umgebenden Dura mater. Sharp Pinzette werden die Hirnhäute rund um die Hypophyse zu lösen. Sobald die Hypophyse bewegt sich frei auf dem Keilbein, einem Ende der Hypophyse wird mit einer Pinzette gefasst und der Hypophyse wird vorsichtig angehoben. Die Drüse wird dann in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit Beckstead das Fixiermittel 5 platziert. Die Hypophyse wird über Nacht, fest eingewickelt in Papier-Objektiv, und in einer Kassette. Die Drüsen werden anschließend mit dem folgenden Protokoll:
| Rufnummer | Reagens | Zeit in Minuten | Temperatur (Celsius) |
| 1 | 70% Alkohol | 5 | 25 |
| 2 | 70% Alkohol | 15 | 25 |
| 3 | 95% Alkohol | 15 | 25 |
| 4 | 95% Alkohol | 15 | 25 |
| 5 | 100% Alkohol | 15 | 25 |
| 6 | 100% Alkohol | 7,5 | 25 |
| 7 | 100% Alkohol | 7,5 | 25 |
| 8 | Xylol | 20 | 25 |
| 9 | Xylol | 20 | 25 |
| 10 | Xylol | 25 | |
| 11 | Paraffin | 30 | 58 |
| 12 | Paraffin | 5 | 58 |
| 13 | Paraffin | 5 | 58 |
Nach der Bearbeitung werden Hypophyse in Paraffin eingebettet und mindestens 5 nonconsecutive Abschnitte (5-mu m dick) werden von jeder Drüse abgeschnitten. Nach dem Anschneiden, sind die Drüsen mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und analysiert, um die mononukleäre Infiltration zu quantifizieren. Der Abschnitt mit den schwersten Infiltration ist für die Auswertung ausgewählt. Die Schwere wird auf der Grundlage einer subjektiven Einschätzung des Ausmaßes der Hypophysenvorderlappen Ersatz oder Zerstörung durch Immunzellen erzielt: Klasse 0, keine Krankheit, Grad 1, 2% -20% der Betroffenen; Grad 2, 20% -30%; Grad 3, 30% -50%; Grad 4, 50% -90%; Grad 5, mehr als 90%. Alle Abschnitte sind von zwei Personen geblendet, um die Quelle der Abschnitte erzielt.
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Discussion
Vier Techniken berichtet worden, um Hypophysitis in Versuchstieren zu induzieren. Die Technik in diesem Artikel beschrieben wird, dass die Injektion von Hypophysen-Proteine mit Freund Adjuvans vermischt wird, ist die älteste, seit 1967 6, und wurde in jüngerer Zeit 1 verbessert. Andere Techniken sind die Injektion von löslichen Rötelnvirus Glykoproteine in 1992 7, die stereotaktische Injektion eines Adenovirus direkt in der Hypophyse in 2002 8 und die Transplantation von Hypophysen von einem Rattenstamm unter die Nierenkapsel einer anderen Rattenstamm in 2010 9 . Der wesentliche Vorteil der adjuvanten Ansatz der Freund s ist, dass es weniger invasive, konsequenter und vor allem genauere bei der Induktion einer Krankheit, die eng mit dem menschlichen Pendant. Die Technik in diesem Video Artikel beschrieben ergibt sich ein reproduzierbares Modell der Hypophysitis, die von Forschern genutzt werden können, um unser Verständnis dieses faszinierenden Krankheit zu verbessern.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH DK080351 auf PC, und durch eine großzügige Schenkung des Terry und Kristine Gore Familie unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SJL mice (The Jackson Laboratories) | stock 000686 | ||
| 2,2,2-Tribrom–thanol (Avertin) | TCI America | T-1420 | |
| Beckstead’s fixative |
References
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. , (2008).
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- Patrick, J., Lindstrom, J. Autoimmune response to acetylcholine receptor. Science. 180, 871-872 (1973).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
- Beckstead, J. H. A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum. J Histochem Cytochem. 43, 345-345 (1995).
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- Davis, J. R., McMahon, R. F., Lowenstein, P. R., Castro, M. G., Lincoln, G. A., McNeilly, A. S. Adenovirus-mediated gene transfer in the ovine pituitary gland is associated with hypophysitis. J Endocrinol. 173, 265-271 (2002).
- Rotondo, F., Quintanar-Stephano, A., Asa, S. L., Lombardero, M., Berczi, I., Scheithauer, B. W., Horvath, E., Kovacs, K. Adenohypophysitis in rat pituitary allografts. Int J Exp Pathol. , (2010).
