Summary
Questo video mostra come per indurre ipofisite autoimmune in topi SJL e come valutare la sua gravità per via istopatologica.
Abstract
Ipofisite autoimmune può essere riprodotto sperimentalmente mediante l'iniezione di proteine pituitaria mescolato con un adiuvante in topi suscettibili 1. Modelli murini ci permettono di studiare come le malattie si svolgono, spesso fornendo una buona replica degli stessi processi che si verificano negli esseri umani. Per alcune malattie autoimmuni, come il diabete di tipo 1A, ci sono modelli (il topo NOD) che sviluppano spontaneamente una malattia simile alla controparte umana. Per molte altre malattie autoimmuni, invece, il modello deve essere indotta sperimentalmente. Un approccio comune su questo punto è quello di iniettare il mouse con un antigene dominante deriva dal organo oggetto di studio. Per esempio, i ricercatori interessati alla tiroidite autoimmune iniettare topi con tireoglobulina 2, e coloro che sono interessati miastenia gravis loro iniettare con il recettore dell'acetilcolina 3. Se l'autoantigene per una particolare malattia autoimmune non è noto, gli investigatori iniettare un estratto grezzo di proteine dal organo bersaglio della reazione autoimmune. Per ipofisite autoimmune, l'autoantigene patogeni (s) devono ancora essere identificati 4, e quindi una preparazione in proteine gregge pituitaria è utilizzato. In questo articolo video che dimostrano come indurre ipofisite autoimmune sperimentale nei topi SJL.
Protocol
Protocollo sperimentale
Una volta che il immunogeno pituitaria è pronto (vedi articolo correlato), è iniettata per via sottocutanea in topi SJL (I Laboratori Jackson, fotografia di 000.686). Una seconda iniezione identico si ripete 7 giorni dopo. I topi sono poi utilizzati per raccogliere in vivo e post mortem risultati.
Fase 1. L'iniezione sottocutanea di immunogeno pituitaria in topi SJL
I topi sono prima anestetizzati iniettando 0,5 ml di 20 mg / ml di 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin, TCI America, T-1420) per via intraperitoneale. I topi sono poi iniettata per via sottocutanea con 100 microlitri della emulsione pituitaria che, come indicato nella compagno JOVE articolo 2181, contiene 1 mg di estratto di ipofisi e 0,25 mg di adiuvante completo di Freund. L'emulsione viene iniettato nella regione dorsale sinistra zampa posteriore ((50 mL) e la regione inguinale destra (50 mL). L'emulsione pituitaria viene iniettato di nuovo il giorno 7 nei siti opposto (50 ml nella regione dorsale destra zampa posteriore e 50 microlitri nella regione inguinale sinistra). topi sono monitorati giornalmente per i primi 3 giorni e poi ogni settimana fino al giorno del sacrificio, che in genere 28 giorni dopo la prima immunizzazione.
Fase 2. Raccolta dei risultati in vivo: test del sangue
Il tessuto più comunemente usato per valutare i risultati sperimentali, mentre i topi sono ancora in vita è il sangue. Il sangue è di routine redatto 14 giorni dopo la prima immunizzazione per misurare i livelli sierici di anticorpi anti-ipofisi o altri indicatori come citochine e chemochine.
Il sangue viene raccolto da topi vivi come segue. I topi sono tenute saldamente per la collottola del collo e la parte posteriore del mascellare si trova. Una volta che la parte posteriore della mandibola si trova, 4 lancette mm utilizzato per forare il fascio vascolare sottomandibolare. Dopo il sangue viene raccolto, la pressione sul posto sulla zona con un batuffolo di cotone imbevuto di alcol per evitare un ematoma. Sangue raccolto viene centrifugato a 2.000 g per 20 minuti, e conservati a -80 ° C fino al momento.
Fase 3. Raccolta di post-mortem risultati: ipofisari istopatologia
I topi sono generalmente sacrificati 28 giorni dopo la prima immunizzazione. La funzione cardinale necessarie per stabilire la diagnosi di EAH è l'infiltrazione della ghiandola pituitaria da ematopoietiche cellule mononucleate.
I topi sono eutanasia mettendoli in una camera di plastica sigillata che viene perfuso con CO 2. I topi sono tenuti in camera per un totale di 8 minuti. Dopo l'eutanasia, la ghiandola pituitaria è raccolto come descritto nell'articolo compagno. Una ghiandola pituitaria malato appare gonfio e più saldamente aderente al mater circostante dura. Pinze taglienti sono utilizzati per allentare le meningi che circondano la ghiandola pituitaria. Una volta che l'ipofisi si muove liberamente sul sfenoide, un capo della ghiandola pituitaria è afferrato con una pinza e la ghiandola pituitaria è alzato attentamente. La ghiandola viene poi posto in una provetta contenente 5 fissativo Beckstead è. La ghiandola pituitaria è fisso durante la notte, avvolto in carta per lenti, e posto in una cassetta. Le ghiandole vengono poi elaborati utilizzando il seguente protocollo:
| Numero stazione | Reagente | Tempo in minuti | Temperatura (Celsius) |
| 1 | 70% di alcol | 5 | 25 |
| 2 | 70% di alcol | 15 | 25 |
| 3 | 95% di alcol | 15 | 25 |
| 4 | 95% di alcol | 15 | 25 |
| 5 | 100% di alcol | 15 | 25 |
| 6 | 100% di alcol | 7,5 | 25 |
| 7 | 100% di alcol | 7,5 | 25 |
| 8 | xilene | 20 | 25 |
| 9 | xilene | 20 | 25 |
| 10 | xilene | 25 | |
| 11 | paraffina | 30 | 58 |
| 12 | paraffina | 5 | 58 |
| 13 | paraffina | 5 | 58 |
Dopo l'elaborazione, ipofisi sono inclusi in paraffina e di almeno 5 sezioni non consecutivi (5-micron di spessore) sono tagliati da ogni ghiandola. Dopo sezionamento, le ghiandole sono colorate con ematossilina ed eosina, e analizzati per quantificare l'infiltrazione mononucleare. La sezione con l'infiltrazione più grave è stato selezionato per il punteggio. La gravità è segnato sulla base di una valutazione soggettiva del grado di sostituzione anteriore dell'ipofisi o distruzione da parte delle cellule immunitarie: grado 0, nessuna malattia, di grado 1, 2% -20% coinvolgimento, grado 2, 20% -30%, grado 3, 30% -50%, di grado 4, il 50% -90%; grado 5, superiore al 90%. Tutte le sezioni sono segnati da due individui accecati alla fonte delle sezioni.
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Discussion
Quattro tecniche sono stati segnalati per indurre ipofisite negli animali da esperimento. La tecnica descritta in questo articolo, che è l'iniezione di proteine pituitaria miscelati con adiuvante di Freund s, è il più antico, risalente al 1967 6, ed è stata migliorata più di recente 1. Altre tecniche sono l'iniezione di glicoproteine solubili virus della rosolia nel 1992 7, l'iniezione stereotassica di un adenovirus direttamente nella ghiandola pituitaria nel 2002 8, e il trapianto di ghiandola pituitaria da un ceppo di ratto sotto la capsula renale di un altro ceppo di ratto in 2010 9 . Il vantaggio principale di approccio adiuvante del Freund s è che è meno invasiva, più coerente e, soprattutto, più accurato nell'indurre una malattia che ricorda da vicino la controparte umana. La tecnica descritta in questo articolo il video produce un modello riproducibile di ipofisite, che può essere utilizzata dagli investigatori per migliorare la nostra comprensione di questa malattia affascinante.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere DK080351 a PC, e da una generosa donazione della famiglia Terry e Kristine Gore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SJL mice (The Jackson Laboratories) | stock 000686 | ||
| 2,2,2-Tribrom–thanol (Avertin) | TCI America | T-1420 | |
| Beckstead’s fixative |
References
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. , (2008).
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