Summary
Este vídeo mostra como induzir hipofisite auto-imunes em camundongos SJL e como avaliar sua gravidade pela histopatologia.
Abstract
Hipofisite auto-imune pode ser reproduzida experimentalmente pela injeção de proteínas pituitária misturado com adjuvante em camundongos suscetíveis 1. Modelos de ratos nos permitem estudar a forma como se desenrolam as doenças, muitas vezes fornecendo uma boa réplica dos mesmos processos que ocorrem nos seres humanos. Para algumas doenças auto-imunes, como diabetes tipo 1A, existem modelos (o mouse NOD) que, espontaneamente, desenvolver uma doença semelhante à contraparte humana. Para muitas outras doenças auto-imunes, no entanto, o modelo precisa ser induzida experimentalmente. Uma abordagem comum a este respeito é injetar o mouse com um antígeno dominante derivado do órgão em estudo. Por exemplo, os investigadores interessados em tireoidite auto-imune injetar camundongos com tireoglobulina 2, e os interessados em miastenia gravis injetá-las com o receptor de acetilcolina 3. Se o autoantígeno para uma determinada doença auto-imune não é conhecido, os investigadores injetar um extrato de proteína bruta do órgão alvo da reação auto-imune. Para hipofisite auto-imunes, a auto-antígeno patogênicos (s) continuam a ser identificados 4, e, assim, uma preparação de proteína bruta pituitária é usado. Neste artigo de vídeo demonstramos como induzir hipofisite auto-imune experimental em camundongos SJL.
Protocol
Protocolo Experimental
Uma vez que o imunógeno pituitária está preparada (ver artigo companheiro), é administrado por via subcutânea em camundongos SJL (The Jackson Laboratories, estoque 000.686). Uma segunda injeção idêntico é repetido sete dias depois. Ratos são então usados para coletar in vivo e post-mortem resultados.
Etapa 1. A injecção subcutânea de imunógeno em camundongos SJL pituitária
Ratos são os primeiros anestesiados pela injeção de 0,5 ml de 20 mg / ml 2,2,2 tribromoetanol (Avertin, TCI América, T-1420) por via intraperitoneal. Camundongos são injetados por via subcutânea com 100 l da emulsão pituitária que, conforme indicado no companheiro JOVE 2181 artigo, contém 1 mg de extrato de pituitária e 0,25 mg de adjuvante de Freund completo. A emulsão é injetado na região dorsal posterior da perna esquerda ((50 mL) e na região inguinal direita (50 mL). A emulsão pituitária é injetado novamente no dia 7 para os sites oposto (50 ul na região dorsal perna direita traseiras e 50 ul na região inguinal esquerda). Camundongos são monitorados diariamente durante os primeiros 3 dias e depois semanalmente até o dia do sacrifício, que normalmente é 28 dias após a primeira imunização.
Etapa 2. Coleção de resultados no vivo: ensaios de Sangue
O tecido mais utilizado para avaliar os resultados experimentais, enquanto os ratos ainda estão vivos é sangue. O sangue é rotineiramente elaborado 14 dias após a primeira imunização para medir os níveis séricos de anticorpos pituitária ou outros marcadores como as citocinas e quimiocinas.
O sangue é coletado de ratos vivem como se segue. Ratos são realizadas de forma segura pela nuca do pescoço e parte de trás do maxilar está localizado. Uma vez que a parte de trás do maxilar está localizado, 4 mm são lancetas usadas para perfurar o feixe vascular submandibular. Após coletar o sangue, a pressão sobre o lugar sobre a área usando um algodão embebido em álcool para evitar um hematoma. Sangue coletado é centrifugado a 2.000 g por 20 minutos, e armazenadas a -80 ° C até sua utilização.
Etapa 3. Coleção de post-mortem resultados: Pituitária histopatologia
Ratos são tipicamente sacrificado 28 dias após a primeira imunização. A característica fundamental necessário para estabelecer o diagnóstico de HAE é a infiltração da glândula pituitária por hematopoiéticas células mononucleares.
Os ratos são sacrificados, colocando-os em uma câmara de plástico selado que é perfundido com CO 2. Camundongos são mantidos na câmara para um total de 8 minutos. Após a eutanásia, a glândula pituitária é coletado como descrito no artigo do companheiro. A glândula pituitária doente aparece inchada e mais firmemente aderente à dura-máter ao redor. Pinças afiadas são usadas para soltar as meninges ao redor da hipófise. Uma vez que o move livremente pituitária no osso esfenóide, uma extremidade da glândula pituitária é apreendido com uma pinça e da glândula pituitária é cuidadosamente levantada. A glândula é então colocada em um tubo de microcentrífuga contendo 5 fixador de Beckstead. A glândula pituitária é fixo durante a noite, embrulhado em papel de lente, e colocado em uma fita cassete. As glândulas são então processadas utilizando o protocolo a seguir:
| Número da Estação | Reagente | Tempo em minutos | Temperatura (Celsius) |
| 1 | Álcool a 70% | 5 | 25 |
| 2 | Álcool a 70% | 15 | 25 |
| 3 | Álcool a 95% | 15 | 25 |
| 4 | Álcool a 95% | 15 | 25 |
| 5 | Álcool 100% | 15 | 25 |
| 6 | Álcool 100% | 7,5 | 25 |
| 7 | Álcool 100% | 7,5 | 25 |
| 8 | xileno | 20 | 25 |
| 9 | xileno | 20 | 25 |
| 10 | xileno | 25 | |
| 11 | parafina | 30 | 58 |
| 12 | parafina | 5 | 58 |
| 13 | parafina | 5 | 58 |
Após o processamento, as glândulas pituitárias são embebidos em parafina, e pelo menos cinco seções não consecutivas (5 m de espessura) são cortadas a partir de cada glândula. Após a secção, as glândulas são corados com hematoxilina e eosina, e analisadas para quantificar a infiltração mononuclear. A seção com a infiltração mais grave é selecionado para marcar. A gravidade é marcado por base uma estimativa subjetiva do grau de substituição hipófise anterior ou destruição por células do sistema imunológico: grau 0, nenhuma doença; grau 1, 2% -20% envolvimento; grau 2, 20% -30%; grau 3, 30% -50%; grau 4, 50% -90%; grau 5, mais de 90%. Todas as seções são marcados por dois indivíduos cegos para a fonte das seções.
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Discussion
Quatro técnicas têm sido relatadas para induzir hipofisite em animais experimentais. A técnica descrita neste artigo, que é a injeção de proteínas pituitária misturado com adjuvante Freund s, é o mais antigo, que remonta a 1967 6, e foi melhorado mais recentemente 1. Outras técnicas são a injeção de glicoproteínas do vírus da rubéola solúveis em 1992 7, a injeção estereotáxica de um adenovírus diretamente na glândula pituitária, em 2002 8, eo transplante de glândulas pituitárias de uma cepa de ratos sob a cápsula renal de outra cepa de ratos em 2010 9 . A principal vantagem da abordagem do adjuvante Freund s é que é menos invasiva, mais consistente e, acima de tudo, mais preciso na indução de uma doença que se assemelha a contraparte humana. A técnica descrita neste artigo de vídeo produz um modelo reprodutível de hipofisite, que pode ser usado por investigadores para melhorar a nossa compreensão desta doença fascinante.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder DK080351 para PC, e por uma oferta generosa do Terry e família Kristine Gore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SJL mice (The Jackson Laboratories) | stock 000686 | ||
| 2,2,2-Tribrom–thanol (Avertin) | TCI America | T-1420 | |
| Beckstead’s fixative |
References
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