Summary
Este video muestra la forma de inducir hipofisitis autoinmune en ratones SJL y la forma de evaluar su gravedad por la histopatología.
Abstract
Hipofisitis autoinmune se puede reproducir experimentalmente mediante la inyección de proteínas de la hipófisis se mezcla con un adyuvante en ratones susceptibles 1. Los modelos de ratón nos permitirá estudiar cómo se desarrollan las enfermedades, a menudo proporciona una buena réplica de los mismos procesos que ocurren en los seres humanos. Para algunas enfermedades autoinmunes, como la diabetes tipo 1A, hay modelos (el ratón NOD), que desarrollan espontáneamente una enfermedad similar a la contraparte humana. Para muchas otras enfermedades autoinmunes, sin embargo, el modelo necesita ser inducida experimentalmente. Un enfoque común a este respecto consiste en inyectar el ratón con un antígeno dominante derivada de la del órgano estudiado. Por ejemplo, los investigadores interesados en la tiroiditis autoinmune inyectar ratones con tiroglobulina 2, y aquellos interesados en la miastenia gravis inyectarles el receptor de acetilcolina 3. Si el autoantígeno para una enfermedad autoinmune en particular no se conoce, los investigadores inyectan un extracto de proteína cruda del órgano blanco de la reacción autoinmune. Para hipofisitis autoinmune, el autoantígeno patógenos (s) aún no se han identificado 4, y por lo tanto una preparación de proteína cruda pituitaria se utiliza. En este artículo de vídeo se demuestra cómo inducir hipofisitis autoinmune experimental en ratones SJL.
Protocol
Protocolo experimental
Una vez que el inmunógeno pituitaria está preparado (véase el artículo del compañero), se inyecta por vía subcutánea en ratones SJL (de los Laboratorios Jackson, las acciones de 000.686). Una inyección de idéntica se repite 7 días después. Los ratones se utilizan para recoger en vivo y los resultados post-mortem.
Paso 1. La inyección subcutánea de inmunógeno hipófisis en ratones SJL
Los ratones son los primeros anestesiados mediante la inyección de 0,5 ml de 20 mg / ml 2,2,2-tribromoetanol (Avertin, Islas Turcas y Caicos Estados Unidos, T-1420) por vía intraperitoneal. Los ratones son inyectados por vía subcutánea con 100 l de la emulsión de la hipófisis que, como se indica en el compañero JoVe 2181 artículo, contiene 1 mg de extracto de pituitaria y 0,25 mg de adyuvante completo de Freund. La emulsión se inyecta en la región dorsal izquierda pata trasera ((50 l) y la región inguinal derecha (50 l). La emulsión de la hipófisis se inyecta de nuevo en el día 7 en los sitios opuestos (50 l en la región dorsal derecha y la pierna trasera 50 l en la región inguinal izquierda). Los ratones son monitoreados diariamente por los primeros 3 días y luego semanalmente hasta el día del sacrificio, que por lo general 28 días después de la primera inmunización.
Paso 2. Recopilación de los resultados en vivo: ensayos de sangre
El tejido más utilizado para evaluar los resultados experimentales, mientras que los ratones siguen vivos es la sangre. La sangre es habitualmente elaborado 14 días después de la primera inmunización para medir los niveles séricos de anticuerpos pituitaria u otros marcadores como citocinas y quimiocinas.
Sanguínea de ratones vivos de la siguiente manera. Los ratones se llevan a cabo de forma segura por la piel del cuello y la parte posterior de la mandíbula se encuentra. Una vez que la parte de atrás de la mandíbula se encuentra, 4 mm lancetas se utilizan para perforar el paquete vascular submandibular. Después se recoge la sangre, ejercen presión sobre los de la zona con una gasa con alcohol para evitar un hematoma. La sangre recogida se centrifuga a 2.000 g durante 20 minutos, y se almacenan a -80 ° C hasta su uso.
Paso 3. Recopilación de los resultados post-mortem: la hipófisis histopatología
Los ratones suelen ser sacrificados 28 días después de la primera inmunización. La característica principal necesarias para establecer el diagnóstico de HAE es la infiltración de la glándula pituitaria por hematopoyéticos de células mononucleares.
Los ratones son sacrificados colocándolos en una cámara de plástico sellada que es perfundido con CO 2. Los ratones se mantienen en la cámara para un total de 8 minutos. Después de la eutanasia, la glándula pituitaria se recoge como se describe en el artículo del compañero. Una glándula suprarrenal se ve hinchada y más firmemente adheridas a los alrededores de la duramadre. Pinzas de Sharp se utiliza para aflojar las meninges que rodean la glándula pituitaria. Una vez que se mueve libremente en la pituitaria del hueso esfenoides, uno de los extremos de la glándula pituitaria se sujeta con una pinza y la glándula pituitaria es levantarse con cuidado. La glándula se coloca en un tubo de microcentrífuga que contiene 5 fijador Beckstead es. La glándula pituitaria es fija durante la noche, envuelto en papel de la lente, y se coloca en un casete. Las glándulas se procesan utilizando el siguiente protocolo:
| Número de estación | Reactivo | Tiempo en minutos | Temperatura (Celsius) |
| 1 | 70% de alcohol | 5 | 25 |
| 2 | 70% de alcohol | 15 | 25 |
| 3 | 95% de alcohol | 15 | 25 |
| 4 | 95% de alcohol | 15 | 25 |
| 5 | 100% de alcohol | 15 | 25 |
| 6 | 100% de alcohol | 7.5 | 25 |
| 7 | 100% de alcohol | 7.5 | 25 |
| 8 | xileno | 20 | 25 |
| 9 | xileno | 20 | 25 |
| 10 | xileno | 25 | |
| 11 | parafina | 30 | 58 |
| 12 | parafina | 5 | 58 |
| 13 | parafina | 5 | 58 |
Después del procesamiento, la glándula pituitaria son embebidos en parafina y al menos 5 secciones no consecutivos (5 m de espesor) se cortan de cada glándula. Después del corte, las glándulas se tiñen con hematoxilina y eosina, y se analizan para cuantificar la infiltración mononuclear. La sección con la infiltración más grave se ha seleccionado para la puntuación. La gravedad se califica sobre la base de una estimación subjetiva del grado de sustitución de la pituitaria anterior o la destrucción por las células inmunes: grado 0, ausencia de enfermedad, grado 1, 2% y un 20% la participación, grado 2, 20% -30%, grado 3, 30% -50%, grado 4, 50% -90%, el 5 º grado, superior al 90%. Todas las secciones están marcados por dos individuos ciegos a la fuente de las secciones.
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Discussion
Cuatro técnicas se han reportado para inducir hipofisitis en animales de experimentación. La técnica descrita en este artículo, que es la inyección de proteínas pituitaria mezclada con adyuvante de Freund s, es la más antigua, que data de 1967 6, y se ha mejorado, más recientemente, 1. Otras técnicas son la inyección de glicoproteínas solubles virus de la rubéola en 1992 7, la inyección estereotáxica de un adenovirus directamente en la glándula pituitaria en 2002 8, y el trasplante de glándulas pituitarias de una cepa de rata bajo la cápsula renal de otra cepa de rata en 2010 9 . La principal ventaja del enfoque de adyuvante de Freund s es que es menos invasiva, más coherente y, sobre todo, más preciso en la inducción de una enfermedad que se asemeja mucho a la contraparte humana. La técnica descrita en este artículo de vídeo ofrece un modelo reproducible de hipofisitis, que puede ser utilizado por los investigadores para mejorar nuestra comprensión de esta enfermedad fascinante.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención DK080351 para PC, y por una generosa donación de la familia de Terry y Kristine Gore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SJL mice (The Jackson Laboratories) | stock 000686 | ||
| 2,2,2-Tribrom–thanol (Avertin) | TCI America | T-1420 | |
| Beckstead’s fixative |
References
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. , (2008).
- Twarog, F. J., Rose, N. R. The production of thyroid autoantibodies in mice. J Immunol. 101, 242-2450 (1968).
- Patrick, J., Lindstrom, J. Autoimmune response to acetylcholine receptor. Science. 180, 871-872 (1973).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
- Beckstead, J. H. A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum. J Histochem Cytochem. 43, 345-345 (1995).
- Levine, S. Allergic adenophypophysitis: new experimental disease of the pituitary gland. Science. 158, 1190-1191 (1967).
- Yoon, J. W., Choi, D. S., Liang, H. C., Baek, H. S., Ko, I. Y., Jun, H. S., Gillam, S. Induction of an organ-specific autoimmune disease, lymphocytic hypophysitis, in hamsters by recombinant rubella virus glycoprotein and prevention of disease by neonatal thymectomy. Journal of Virology. 66, 1210-1214 (1992).
- Davis, J. R., McMahon, R. F., Lowenstein, P. R., Castro, M. G., Lincoln, G. A., McNeilly, A. S. Adenovirus-mediated gene transfer in the ovine pituitary gland is associated with hypophysitis. J Endocrinol. 173, 265-271 (2002).
- Rotondo, F., Quintanar-Stephano, A., Asa, S. L., Lombardero, M., Berczi, I., Scheithauer, B. W., Horvath, E., Kovacs, K. Adenohypophysitis in rat pituitary allografts. Int J Exp Pathol. , (2010).
