Summary
이 동영상은 어떻게 조직 병리학하여 심각도를 평가하기 위해 SJL 마우스 및 면역 hypophysitis를 유도하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
면역 hypophysitis는 민감한 생쥐 한에 도움이되는 섞인 뇌하수체 단백질의 주입에 의해 실험적으로 복제하실 수 있습니다. 마우스 모델은 종종 인간에서 발생하는 동일한 프로세스의 좋은 복제를 제공하고, 우리가 질병이 전개 방법을 학습하실 수 있습니다. 유형 1A 당뇨병 같은자가 면역 질환의 경우 저절로 인간의 대응과 유사한 질병을 개발하는 모델 (NOD 마우스)가 있습니다. 많은 다른 면역 질환, 그러나, 모델은 실험적으로 유도해야합니다. 이 점에서 일반적인 접근 방법은 연구되고있는 기관에서 파생된 지배적인 항원으로 마우스를 주입하는 것입니다. 예를 들어, 면역 thyroiditis에 관심이 조사는 thyroglobulin 2 마우스를 투입하고, myasthenia gravis에 관심있는 사람은 아세틸콜린 수용체 3을 주입. 특정 면역 질환에 대한 autoantigen가 알려져 있지 않을 경우, 수사는 면역 반응의 표적 기관에서 원유 단백질 추출물을 주입. 면역 hypophysitis 들어, 병원성 autoantigen (들)은 4 식별을 유지하고, 따라서 원유 뇌하수체 단백질 준비가 사용됩니다. 이 동영상이 문서에서 우리는 SJL 생쥐의 면역 실험 hypophysitis를 유도하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
실험 프로토콜
뇌하수체 immunogen가 (동반자 문서를 참조) 준비되면, 그것은 SJL 마우스 (잭슨 연구소, 주식 000,686)으로 subcutaneously 주입니다. 두 번째 동일한 주사는 7 일 후에 반복됩니다. 생쥐는 다음 생체내 및 사후 결과에 수집하는 데 사용됩니다.
1 단계. SJL 마우스로 뇌하수체 immunogen의 피하 주입
마우스는 20 MG / ML 2,2,2 - Tribromoethanol 0.5 ML (Avertin, TCI 미국, T - 1420) intraperitoneally를 주사하여 첫번째 anesthetized 있습니다. 생쥐는 다음 2181 문서를 조브로 동반자에 표시된, 뇌하수체 유제 100 μl와 subcutaneously 주입 뇌하수체 추출하고 완전한 프로 인드의 도움이되는의 0.25 MG 1 MG를 포함하고 있습니다. 에멀전은 왼쪽 지느러미 뒷부분 다리 지역 ((50 μL)과 오른쪽 사타구니 지역 (50 μL)에 주입합니다. 뇌하수체 유제는 반대 사이트 (50 오른쪽 지느러미 뒷부분 다리 지역에서 μl과에 일 7 일에 다시 주입 왼쪽 사타구니 지역에 50 μl). 마우스는 처음 3 일 동안 매일 모니터링하고 처음으로 예방 접종 후 일반적으로 28일는 희생의 날 때까지 매주 수 있습니다.
2 단계. 생체내의 결과에의 수집 : 블러드 assays
생쥐가 살아있는 동안 가장 일반적으로 실험 결과를 평가하는 데 사용되는 조직은 혈액이다. 혈액은 일상적 십사일 뇌하수체 항체 또는 크린 시토킨 및 chemokines 같은 다른 마커의 혈청 수준을 측정하는 최초의 예방 접종 후에 그려진 것입니다.
혈액은 다음과 같이 라이브 생쥐에서 수집됩니다. 생쥐는 목의 아저씨에 의해 안전하게 개최되고 턱뼈의 뒤쪽이 있습니다. 턱뼈의 뒤쪽이있는되면, 4mm의 lancets은 은빛의 턱밑 혈관 번들을 사용하고 있습니다. 혈액을 수집 후 지역에 온 장소 압력은 혈종을 피하기 위해 알코올 면봉을 사용합니다. 수집된 혈액은 20 분 동안 2,000g에 centrifuged 및 사용 ° C까지 -80에 저장됩니다.
3 단계. 사후 결과의 수집 : 뇌하수체 조직 병리학
마우스는 일반적으로 28일 첫 예방 접종 후 희생하고 있습니다. 사나의 진단을 수립하는 데 필요한 추기경 기능은 조혈 mononuclear 세포에 의해 뇌하수체의 침투이다.
생쥐는 CO 2 perfused되는 밀폐된 플라스틱 챔버에서 그들을 배치하여 euthanized 있습니다. 마우스는 8 분 총 챔버에 보관됩니다. 안락사 후, 뇌하수체는 동반자 문서에 설명된대로 수집됩니다. 병에 걸린 뇌하수체가 부풀어 오르고 주변 두라 메이터 더 확고 자기편 나타납니다. 샤프 포셉은 뇌하수체를 둘러싼 meninges을 느슨하게하는 데 사용됩니다. 일단 쐐기 꼴의 뼈에서 자유롭게 이동 뇌하수체, 뇌하수체의 한쪽 끝을은 집게로 쥐었다이며, 뇌하수체는 신중하게 해제됩니다. 선 그러면 벡스 테드의 정착액 5 포함된 microcentrifuge 관에 배치됩니다. 뇌하수체는 야간 고정 렌즈 종이에 싼, 그리고 카세트에 배치됩니다. 이 선들은 다음 프로토콜을 사용하여 처리됩니다 :
| 역 번호 | 시약 | 분 시간 | 온도 (섭씨) |
| 1 | 70 % 알콜 | 5 | 25 |
| 2 | 70 % 알콜 | 15 | 25 |
| 3 | 95 % 알콜 | 15 | 25 |
| 4 | 95 % 알콜 | 15 | 25 |
| 5 | 100 % 알코올 | 15 | 25 |
| 6 | 100 % 알코올 | 7.5 | 25 |
| 7 | 100 % 알코올 | 7.5 | 25 |
| 8 | 크실렌 | 20 | 25 |
| 9 | 크실렌 | 20 | 25 |
| 10 | 크실렌 | 25 | |
| 11 | 파라핀 | 30 | 58 |
| 12 | 파라핀 | 5 | 58 |
| 13 | 파라핀 | 5 | 58 |
처리 후, 뇌하수체 분비는 파라핀에 포함된하고 적어도 5 nonconsecutive 섹션 (5 μm의 두께)가 각각의 선 (腺)에서 절단됩니다. sectioning 후,이 선들은 hematoxylin과 eosin 물들일 및 mononuclear 침투를 정할 분석하고 있습니다. 가장 심각한 침투있는 부분은 점수를 위해 선택됩니다. 심각도는 면역 세포에 의해 앞쪽에 뇌하수체 교체 또는 파괴의 범위의 주관적 평가에 따라 점수입니다 등급 0, 아니 질병, 1 학년, 2% -20 % 참여, 학년이, 20 % -30 %, 3 학년, 30% -50 %; 학년 4, 50 % -90 %; 5 학년, 큰 90 % 이상. 모든 섹션은 섹션의 원본 멀게 두 명으로 득점하고 있습니다.
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Discussion
네 기술은 실험 동물에 hypophysitis을 유발하는 것으로보고되었습니다. 프로 인드의 도움이되는 섞인 뇌하수체 단백질의 주입이이 문서에서 설명하는 기술은, 1967 년 6 거슬러 올라가는 가장 오래된 하나이며, 최근에는 한 개선되었습니다. 기타 기술 1992 7 용해 풍진 바이러스 glycoproteins의 분사 2002 년 8 뇌하수체에 직접 아데노 바이러스의 stereotactic 주입, 2010 9 다른 쥐의 변형의 신장 캡슐 아래의 쥐를 변형에서 뇌하수체 분비의 이식 아르 . 프로 인드의 도움이되는 접근 방법의 주요 장점은 밀접하게 인간의 대응과 유사한 질병을 유발에 더 정확하게, 덜 침략 더 일관되고, 무엇보다도있다는 것입니다. 이 비디오 문서에서 설명하는 기술은이 매혹적인 질병의 우리의 이해를 개선하기 위해 수사관에 의해 사용할 수 hypophysitis의 재현성 모델을 산출.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 PC에 NIH 부여 DK080351에 의해 그리고 테리와 크리스틴 고어 가족의 관대한 선물에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SJL mice (The Jackson Laboratories) | stock 000686 | ||
| 2,2,2-Tribrom–thanol (Avertin) | TCI America | T-1420 | |
| Beckstead’s fixative |
References
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. , (2008).
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