Summary
Vi har utvecklat en enkel och reproducerbar-protokollet för att få tillgång stomatakonduktans svar på levande bakterier. Denna metod minimerar såra och manipulation av bladet jämfört med användningen av epidermala peeling tidigare rapporterats.
Abstract
Klyvöppningar är naturliga i anläggningen från öppningar epidermis svarar för gasutbyte mellan växt interiör och miljö. De bildas av ett par vakt celler, som kan stänga stomatakonduktans pore som svar på ett antal externa faktorer, inklusive ljusstyrka, koldioxid koncentration och relativ fuktighet (RH). Den stomatakonduktans por är också den viktigaste vägen för patogenen inträde i blad, ett avgörande steg för sjukdomsutvecklingen. Nyligen genomförda studier har avslöjat att stängningen av por är effektivt för att minimera bakteriell sjukdom utveckling i Arabidopsis växter, en del av anläggningen medfödd immunitet. Tidigare har vi använt epidermal peeling för att bedöma stomatakonduktans svar på levande bakterier (Melotto et al 2006.), Men att upprätthålla gynnsamma miljöförhållanden för både växt epidermal peeling och bakterieceller har varit utmanande. Leaf epidermis kan hållas vid liv och friska med MES buffert (10 mM KCl, 25 mm MES-KOH, pH 6,15) för elektrofysiologiska experiment vakt celler. Detta är dock bufferten inte är lämpligt för att erhålla bakteriesuspension. Å andra sidan kan bakterieceller hållas vid liv i vatten som inte är korrekt att upprätthålla epidermal peeling för lång tid. När en epidermal skal flyter på vatten, de celler i skal som utsätts för lufttorka inom 4 timmar begränsa tidpunkten för att genomföra experimentet. En idealisk metod för att bedöma effekten av en viss stimulans på sin vakt celler bör presentera minimala störningar för stomatakonduktans fysiologi och den naturliga miljön av anläggningen så mycket som möjligt. Vi därför utvecklat en ny metod för att bedöma stomatakonduktans svar på levande bakterier i vilka blad såra och manipulation är mycket minimeras syftar till att ge ett enkelt reproducerbar och pålitlig stomatakonduktans analys. Protokollet är baserat på färgning av intakta blad med propidiumjodid (PI), inkubation av färgning blad med bakteriesuspension, och observation av löv i laserskanning konfokalmikroskop. Slutligen ger denna metod för observation av samma bor bladet prov under lång tid med hjälp av villkor som nära efterliknar de naturliga förhållanden under vilka växter angrips av patogener.
Protocol
1. Växande Växter och förbereda Bakterier
- Till att börja proceduren sår Arabidopsis frön på en 01:01:01 v: v: v blandning av odlingssubstrat (Redi vardagsnära kontakten och plantor mix, Sun GRO), fin vermikulit och perlit.
- Odla växter i en tillväxt kammare (22 ° C, 12 timmar 100 mikromol / mm 2 / s dagliga ljus och 65 ± 5% luftfuktighet) och vatten som behövs. Anläggningarna är färdiga att använda i 4-6 veckor när de har ungt helt utvecklat löv innan bultning.
- Två dagar innan försöket förbereda bakterie kulturen. Streak Pseudomonas syringae från glycerol lager på modifierade LB medium (10 g / L trypton, 5 g / L jästextrakt, 5 g / L NaCl pH 7,0, och 1,5% agar) och inkubera i 24 timmar vid 28 ° C. Använd färska kultur för att förbereda inokulatet och alltid börja odlingsplattor från glycerol lager som bakterier blir mindre virulenta efter sub-odling.
- Använd bakterier som växte på plattan för att starta en 10 ml vätska kultur av P. syringae i en 50 ml E-kolv. Inkubera kultur över natten vid 28 ° C med kraftig omskakning tills den når optisk täthet eller OD vid 600 nm mellan 0,8 och 1.
- Mät OD vid 600 och skörda cellerna genom centrifugering vid 1360 xgi 10 minuter. Resuspendera cellerna i destillerat vatten så att den slutliga OD är 0,2. Detta OD motsvarar 10 8 kolonibildande enheter (CFU) / ml. Med bakterier klar, fortsätt att förbereda bladen och utföra analysen.
2. Leaf färgning och Inkubation med bakterier
- För att färga bladen bered först 20 jodid mikroM propidium eller PI lösning i vatten. 10 ml lösning är tillräcklig för att färga tre små blad i taget.
- Hämta växter från tillväxt kammaren och med pincett bort 3 unga, fullt expanderat blad. Sänk ned hela blad i PI-lösning i 5 minuter. Ta sedan bort bladen och skölj dem snabbt med destillerat vatten.
- Nästa ställe ett löv med undersidan nedåt på ett objektglas. Skär blad med en vass rakblad i fyra bitar exklusive mitten ven så att bladet ligger platt på bilden.
- Till Inkubera bakterier med bladen, lägga 300 mikroliter av bakteriesuspensionen under bladet bitarna på bilden. Se till att den nedre ytan av bladet är i kontakt med inokulat.
- Inkubera prov under samma miljöförhållanden som användes för att odla växter. På tiden att observera lämnar under mikroskop, överföring bladet bitar till en ny bild med lägre ytan uppåt. Observera att locket glider inte används vid montering av bilder. Samma blad prov kan avbildas flera gånger under inkubationstid och en tid kurs kan ställas in enligt forskningsmål.
3. Mikroskopi, mätning och dataanalys
- Här en laserskanning konfokalmikroskop (LSM 510 Meta, Carl Zeiss Inc.) används för att undersöka bladen. Följ den nedre ytan av bladen för att upptäcka fluorescens PI (excitation 453 nm, utsläpp 543 och 620 nm).
- Med samma blad prover ta bilder av klyvöppningar över tiden. Spara bilderna för att mäta bredden på stomatakonduktans bländare.
- Mät stomatakonduktans bländare bredd av minst 60 klyvöppningar för varje behandling vid varje tidpunkt med hjälp av webbläsaren LSM bild.
- Beräkna medelvärde och standardfel för stomatakonduktans bländare bredd. Statistisk signifikans för resultat kan beräknas med 2-tailed, parade kloka Students t-test.
4. Representant Bilder av stomatal Svar på Inkubering med bakterier
- Här är en typisk mikroskopisk bild (med en 20x mål) av en Arabidopsis blad ytan under laserskanning konfokalmikroskop i ljusa fält vyn (Figur 1).
- Propidiumjodid fläckar cellväggen livskraftiga celler att öka synligheten av vakten celler förutom för identifiering av skadade celler för datainsamling (Figur 2). En rad stomatakonduktans pore öppningar kan ses i dessa micrographs, från helt slutna klyvöppningar för att öppna klyvöppningar.
- Helt slutna klyvöppningar identifieras med formen på vakt celler (Figur 3). Bländaren bredd anses vara 0 ìm.
- För öppna klyvöppningarna (Figur 4) bländaren bredden som visas mäts med hjälp av en rät linje dragen över den bredaste delen av stomatakonduktans por.
- Detta är typiska experimentella resultaten av denna stomatakonduktans analys. Arabidopis löv inkuberades i mörkret med tre olika stammar av Pseudomonas syringae. Endast bakterien Pst DC3000 kunde öppna mörk stängda klyvöppningar, mätt som bländaren bredden på slumpmässigt utvalda 60 klyvöppningar per bakteriestam (Figur 5).
Figur 1. Mikroskop av ytan på en Arabidopsis blad. Ett synfält av bladet ytan under laserskanning konfokalmikroskop (LSCM) med 20x objektiv. Observera att stomatakonduktans bländaren inte är lika uppenbart när man jämför med fluorescerande uppfattning med hjälp av propidiumjodid färgning (Figur 2).
Figur 2. Mikroskop av ytan på en propidiumjodid färgade Arabidopsis blad. Ett synfält av bladet ytan under laserskanning konfokalmikroskop (LSCM) med 20x objektiv. Observera en rad stomatakonduktans pore öppning. Gula pilar pekas att helt stänga klyvöppningarna och gröna pilarna pekade vidöppna klyvöppningar.
Figur 3. Helt nära klyvöppningar identifierats av form och öppningen mellan vakten cellerna. Bländaren bredd anses vara 0 ìm.
Figur 4. Öppna klyvöppningar visar bländare bredd i ìm. Mätningar gjordes med hjälp av LSCM webbläsare baserad på en rät linje dragen över den bredaste delen av stomatakonduktans por.
Figur 5. Stomatal bländaröppning Arabidopsis löv inkuberas med tre stammar av Pseudomonas syringae pv tomat..: DC3118, DB29 och DC3000 växter förvaras i mörker under experiment tiden. Resultaten visas som medelvärdet (n = 50-70) ± medelfel. Statistisk signifikans upptäcktes med tvåsidiga Students t-test. Försöket upprepades tre gånger med liknande resultat.
Discussion
Vi har presenterat en rättfram procedur för att mäta stomatakonduktans bländare i intakta bladvävnad möjliggör en enkel bedömning av stomatakonduktans svar på olika behandlingar.
Även om vi har presenterat resultat med hjälp av Arabidopsis modellsystem / Pseudomonas syringae kan intakt blad stomatakonduktans analys vara potentiellt utföras med någon växt-bakterie kombination. Protokollet kan lätt modifieras för att passa tillväxt kraven i andra växter och bakterier. Den övergripande principen och förfarandet förblir desamma. Dessutom kan denna metod vara till nytta för forskare som vill studera funktionell effekt på vakt celler inte bara att leva mikrober, men även till andra stimuli och kemiska under förhållanden som behåller bladen naturliga miljö.
Hela blad kan vara svåra att bilden på grund av dess tjocklek och ojämn topografi. Detta problem kan lindras genom att ta bort mitten ven av bladet så att den ligger plant på bilden och använder konfokalmikroskopi. Däremot kan andra typer av fluorescensmikroskop användas för att få högupplösta bilder av bladet ytan.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av ett bidrag från National Institute of Health och The University of Texas i Arlington inrättat medel till MM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-1 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 0127-01-7 | |
| Sodium Chloride | VWR international | 7647-14-5 | |
| Agar | Bio Express | J637-2500G | |
| Plant growth chamber | |||
| Shaker incubator | |||
| Laser scanning confocal microscope |
References
- Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis Book. Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. , American Society of Plant Biologists. Rockville, MD. (2002).
- Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato. Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126, 969-980 (2006).
