Summary
Wir haben eine einfache und reproduzierbare Protokoll Stomata Reaktion auf lebende Bakterien Zugang entwickelt. Diese Methode minimiert Verwundung und Manipulation des Blattes über die Nutzung von epidermalen schält Vergleich bereits berichtet.
Abstract
Stomata sind natürliche Öffnungen in der Anlage Epidermis verantwortlich für den Gasaustausch zwischen Pflanze Innen-und Umwelt. Sie sind durch ein Paar von Schließzellen, die in der Lage, die Stomata Pore in Reaktion auf eine Reihe von externen Faktoren wie Lichtintensität, Kohlendioxid-Konzentration, und die relative Luftfeuchtigkeit (RH) in der Nähe entstehen. Die Stomata Pore ist auch die Hauptroute für den Erregernachweis Eintrag in die Blätter, ein entscheidender Schritt für die Entwicklung der Krankheit. Jüngste Studien haben enthüllt, dass die Schließung der Poren wirksam minimiert bakterielle Erkrankung Entwicklung in Arabidopsis-Pflanzen ist, ein integraler Bestandteil der Anlage angeborenen Immunität. Bisher haben wir epidermalen Schalen verwendet, um Stomata Antwort zu bewerten, um Bakterien (Melotto et al 2006.) Leben, aber die Aufrechterhaltung günstiger Umweltbedingungen für beide Anlagen epidermalen Peelings und bakteriellen Zellen war eine echte Herausforderung. Blattepidermis gehalten lebendig und gesund mit MES-Puffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6,15) für elektrophysiologische Experimente von Schließzellen werden. Allerdings ist dieser Puffer nicht geeignet für den Erhalt Bakteriensuspension. Auf der anderen Seite, können bakterielle Zellen am Leben erhalten in Wasser, das ist nicht richtig, epidermal Peelings für längere Zeit aufrecht zu erhalten. Wenn eine epidermale peel schwimmt auf dem Wasser, wodurch die Zellen in der Schale, die an der Luft trocknen innerhalb von 4 Stunden ausgesetzt sind, das Timing, das Experiment durchzuführen. Eine ideale Methode zur Beurteilung der Wirkung eines bestimmten Reizes auf der Hut Zellen sollten minimal Störungen Stomata Physiologie und der natürlichen Umgebung der Pflanze so viel wie möglich zu präsentieren. Wir haben deshalb eine neue Methode entwickelt, um Stomata Antwort zu bewerten, um Bakterien, in denen Blatt Verwundung und Manipulation stark minimiert zielt darauf ab, eine leicht reproduzierbare und zuverlässige Stomata Assay bieten zu leben. Das Protokoll basiert auf Färbung der intakten Blattes mit Propidiumiodid (PI), die Inkubation Färbung Blatt mit Bakteriensuspension und Beobachtung der Blätter unter Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop. Schließlich ermöglicht dieses Verfahren für die Beobachtung der gleichen Live-Blatt Probe über längere Zeit mit Bedingungen, die genau imitieren die natürlichen Bedingungen, unter denen Pflanzen mit Krankheitserregern angegriffen werden.
Protocol
1. Wachsenden Pflanzen und Bakterien vorbereiten
- Zu Beginn dieses Verfahrens zu säen Arabidopsis Samen auf einem 1:1:1 v: v: v Mischung aus Kultursubstrat (Redi-Earth-Plug-und Pflanzgut-Mix, Sun Gro), feine Vermiculit und Perlit.
- Wachsen die Pflanzen in einer Wachstumskammer (22 ° C, 12 Stunden von 100 mmol / mm 2 / sec Tageslicht und 65 ± 5% Luftfeuchtigkeit) und Wasser als nötig. Die Pflanzen sind bereit, in 4-6 Wochen zu verwenden, wenn sie jungen, voll entfalteten Blätter vor Verschraubung haben.
- Zwei Tage vor dem Beginn der Vorbereitung des Experiments das Bakterium Kultur. Streak Pseudomonas syringae aus Glycerin Lager auf modifizierten LB-Medium (10 g / l Trypton, 5 g / L Hefeextrakt, 5 g / L NaCl pH 7,0 und 1,5% Agar) und Inkubation für 24 Stunden bei 28 ° C. Verwenden Sie frische Kultur des Inokulums vorbereiten und beginnen immer Kulturplatten aus Glycerin Aktien wie Bakterien wird weniger virulent nach Subkultivieren.
- Verwenden Bakterien, die auf der Platte wuchs zu einem 10 mL Flüssigkultur von P. starten syringae in einer 50 ml-Erlenmeyerkolben. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 28 ° C unter kräftigem Schütteln, bis es optische Dichte oder OD bei 600 nm zwischen 0,8 und 1 erreicht.
- Messen Sie die OD bei 600 und Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 1360 xg für 10 Minuten. Resuspendieren der Zellen in destilliertem Wasser, so dass die endgültige OD beträgt 0,2. Das OD entspricht 10 8 koloniebildende Einheiten (KBE) / ml. Mit den Bakterien fertig ist, fahren Sie die Blätter vorbereiten und durchführen der Test.
2. Blatt Färbung und Inkubation mit Bakterien
- Um Flecken auf den Blättern zunächst vorbereiten 20 uM Propidiumiodid oder PI-Lösung in Wasser. 10 mL der Lösung ist ausreichend, um 3 kleine Blätter zu einem Zeitpunkt, zu färben.
- Rufen Sie die Pflanzen aus der Klimakammer und mit einer Pinzette lösen 3 junge, voll entwickelte Blätter. Tauchen Sie die ganze Blätter in der PI-Lösung für 5 Minuten. Dann die Blätter entfernen und spülen Sie sie kurz mit destilliertem Wasser.
- Nächster Ort ein Blatt mit der Unterseite nach unten auf einen Objektträger. Schneiden Sie das Blatt mit einer scharfen Rasierklinge in vier Teile mit Ausnahme der Mitte Vene, so dass das Blatt legt auf der Folie flach.
- Um inkubieren die Bakterien mit den Blättern, fügen Sie 300 ul Bakteriensuspension unter die Blattstücke auf der Folie. Stellen Sie sicher, dass die untere Fläche des Blattes in Kontakt mit dem Inokulum wird.
- Inkubieren Sie die Proben unter den gleichen Umweltbedingungen, mit denen die Pflanzen wachsen konnten. Zu der Zeit, um Blätter unter dem Mikroskop beobachten, übertragen Sie die Blattstücke auf eine neue Folie mit geringer Oberfläche nach oben zeigt. Beachten Sie, dass Deckglas nicht verwendet wird bei der Montage der Folien. Das gleiche Blatt Probe kann mehrere Male während der Inkubation abgebildet werden und einen zeitlichen Verlauf kann bis nach der Forschungsziele festgelegt werden.
3. Mikroskopie, Messtechnik und Datenanalyse
- Hier wird ein Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop (LSM 510 Meta, Carl Zeiss Inc.) wird verwendet, um die Blätter zu untersuchen. Beachten Sie die untere Fläche der Blätter, um die Fluoreszenz von PI (Anregung 453 nm, Emission 543 und 620 nm) zu erkennen.
- Mit der gleichen Blattproben Aufnahmen von Spaltöffnungen im Lauf der Zeit. Speichern Sie die Bilder für die Messung der Breite der Stomata Blende.
- Messen Stomata Maschenweite von mindestens 60 Spaltöffnungen für jede Behandlung zu jedem Zeitpunkt mit LSM-Bild-Browser.
- Berechnen Sie die durchschnittliche und Standardfehler für die Stomata Maschenweite. Die statistische Signifikanz der Ergebnisse kann anhand 2-seitig, gepaart kluge Student-t-Test.
4. Repräsentative Bilder stomatäre Response to Inkubation mit Bakterien
- Hier ist eine typische mikroskopische Bild (mit einem 20x-Objektiv) eines Arabidopsis Blattoberfläche unter Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop in Hellfeld-Ansicht (Abbildung 1).
- Propidiumiodid färbt die Zellwand von lebensfähigen Zellen eine Erhöhung der Sichtbarkeit der Schließzellen neben der Identifizierung von unbeschädigten Zellen für die Datenerfassung (Abbildung 2) ermöglicht. Eine Reihe von Stomata Porenöffnungen kann in diesen Aufnahmen zu sehen ist, von ganz geschlossen Stomata weit geöffnet Spaltöffnungen.
- Komplett geschlossen Spaltöffnungen werden durch die Form der Schließzellen (Abbildung 3) identifiziert. Die Maschenweite ist als 0 um betragen.
- Für offene Stomata (Abbildung 4) die Maschenweite dargestellt wird durch die Verwendung einer geraden Linie quer über den breitesten Bereich der Stomata Pore gezogen gemessen.
- Dies sind typische experimentelle Ergebnisse dieser Stomata Assay. Arabidopis Blätter wurden im Dunkeln mit drei verschiedenen Stämmen von Pseudomonas syringae inkubiert. Nur das Bakterium Pst DC3000 konnte dunklen geschlossenen Spaltöffnungen, durch die Maschenweite von zufällig wählte 60 Spaltöffnungen pro Bakterienstamm (Abbildung 5) gemessen öffnen.
Abbildung 1. Mikroskopische Aufnahme der Oberfläche eines Arabidopsis Blatt. One Blickfeld der Blattoberfläche unter Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop (LSCM) mit dem 20x-Objektiv. Beachten Sie, dass Stomata Blende ist nicht so offensichtlich, wenn die fluoreszierende Ansicht Propidiumiodid-Färbung (Abbildung 2) gestützte verglichen.
Abbildung 2. Mikroskopische Aufnahme der Oberfläche einer Propidiumiodid-gefärbten Arabidopsis Blatt. One Blickfeld der Blattoberfläche unter Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop (LSCM) mit dem 20x-Objektiv. Beachten Sie eine Reihe von Stomata Porenöffnung. Gelbe Pfeile sind spitz, um vollständig zu schließen Spaltöffnungen und grünen Pfeile sind weit offen Spaltöffnungen hingewiesen.
Abbildung 3. Ganz in der Nähe Spaltöffnungen durch die Form und die Öffnung zwischen den Wächter-Zellen identifiziert. Die Maschenweite ist als 0 um betragen.
Abbildung 4. Offene Spaltöffnungen, welche die Maschenweite in um. Die Messungen wurden mit Hilfe der LSCM Browser auf einer geraden Linie quer über den breitesten Bereich der Stomata Pore gezogen Basis genommen.
Abbildung 5. Stomata Apertur von Arabidopsis Blättern mit drei Stämmen von Pseudomonas syringae pv tomato inkubiert:.. DC3118, DB29 und DC3000 Die Pflanzen wurden im Dunkeln während der Versuchszeit gehalten. Die Ergebnisse werden als Mittelwert dargestellt (n = 50-70) ± Standardfehler. Statistische Signifikanz wurde mit zweiseitigen Student-t-Test nachgewiesen. Das Experiment wurde dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
Discussion
Wir haben ein straight forward Verfahren Stomata Öffnung in intakten Blattgewebe ermöglicht eine einfache Beurteilung der Stomata Reaktion auf unterschiedliche Behandlungen Maßnahme.
Obwohl wir die Ergebnisse mit dem Modellsystem Arabidopsis / Pseudomonas syringae vorgestellt haben, kann der intakten Blattes Stomata Assay potenziell mit jedem Werk-Bakterium Kombination durchgeführt werden. Das Protokoll kann leicht modifiziert werden, um notwendige Wachstum von anderen Pflanzen und bakterielle Erreger angepasst werden. Das übergeordnete Prinzip und Verfahren bleiben gleich. Darüber hinaus kann diese Methode nützlich sein, um Forscher, die funktionale Leistung von Schließzellen nicht nur Mikroben leben studieren wollen, sondern auch auf andere Reize und chemische Kampfstoffe unter Bedingungen, die das Blatt die natürliche Umwelt zu erhalten.
Whole Blatt kann schwierig sein Bild aufgrund seiner Dicke und unebenen Topographie. Dieses Problem kann durch das Entfernen der Vene Mitte des Blattes so dass es flach auf den Schlitten und mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie gelindert werden. Jedoch können auch andere Arten von Fluoreszenz-Mikroskop verwendet, um Bilder mit hoher Auflösung von der Blattoberfläche zu erhalten.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health und der University of Texas at Arlington einrichten Mittel MM unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-1 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 0127-01-7 | |
| Sodium Chloride | VWR international | 7647-14-5 | |
| Agar | Bio Express | J637-2500G | |
| Plant growth chamber | |||
| Shaker incubator | |||
| Laser scanning confocal microscope |
References
- Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).
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- Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato. Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126, 969-980 (2006).
