Summary
Abbiamo sviluppato un protocollo semplice e riproducibile per l'accesso risposta stomatica di batteri vivi. Questo metodo riduce ferimento e la manipolazione della foglia rispetto all'utilizzo di bucce epidermica riferito in precedenza.
Abstract
Stomi sono aperture naturali nell'epidermide impianto responsabile per lo scambio di gas tra l'interno delle piante e dell'ambiente. Esse sono formate da una coppia di cellule di guardia, che sono in grado di chiudere il poro stomi in risposta ad una serie di fattori esterni, incluso l'intensità della luce, concentrazione di anidride carbonica, e umidità relativa (RH). Il poro stomi è anche la via principale per l'ingresso degli agenti patogeni in foglie, un passo cruciale per lo sviluppo della malattia. Recenti studi hanno rivelato che la chiusura del poro è efficace nel ridurre lo sviluppo batterico malattia in piante di Arabidopsis, parte integrante della pianta immunità innata. In precedenza, abbiamo utilizzato le bucce epidermica per valutare la risposta degli stomi per vivere batteri (Melotto et al 2006.), Ma mantenendo condizioni ambientali favorevoli per entrambe le bucce impianto epidermiche e le cellule batteriche è stato impegnativo. Epidermide foglia può essere mantenuto vivo e sano con MES di buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) per gli esperimenti elettrofisiologici di cellule di guardia. Tuttavia, questo buffer non è appropriato per ottenere la sospensione batterica. D'altra parte, le cellule batteriche possono essere tenuti in vita in acqua, che non è proprio per mantenere le bucce epidermico per un lungo periodo di tempo. Quando un galleggia sull'acqua buccia epidermica, le cellule della buccia che sono esposti ad asciugare all'aria entro 4 ore limitando i tempi per condurre l'esperimento. Un metodo ideale per valutare l'effetto di uno stimolo particolare sulle cellule di guardia dovrebbe presentare la minima interferenza alla fisiologia degli stomi e per l'ambiente naturale della pianta il più possibile. Noi, quindi, sviluppato un nuovo metodo per valutare la risposta degli stomi di vivere i batteri in cui ferendo foglia e la manipolazione è notevolmente ridotto al fine di fornire un saggio facilmente riproducibili e affidabili stomatica. Il protocollo si basa sulla colorazione delle foglie intatte con ioduro di propidio (PI), di incubazione di colorazione foglia con sospensione batterica, e l'osservazione delle foglie sotto microscopio confocale a scansione laser. Infine, questo metodo consente l'osservazione dello stesso campione di foglia di vivere per lunghi periodi di tempo a stretto contatto con le condizioni che simulano le condizioni naturali in cui sono attaccate le piante da agenti patogeni.
Protocol
1. Le piante che crescono e batteri Preparazione
- Per iniziare questa procedura seminare Arabidopsis su un 01:01:01 v: v: v miscela di substrato (Redi-terra spina e mescolare piantina, Sun Gro), vermiculite fine e perlite.
- Far crescere le piantine in una camera di crescita (22 ° C, 12 ore di luce di 100 micromol / mm 2 / sec giorno e 65 ± 5% di umidità) e di acqua se necessario. Le piante sono pronte per l'uso in 4-6 settimane, quando sono giovani foglie completamente espanse prima della bullonatura.
- Due giorni prima di iniziare l'esperimento preparare la cultura batterio. Streak Pseudomonas syringae da stock glicerolo su medio LB modificato (10 g / L triptone, 5 g / L estratto di lievito, 5 g / L NaCl pH 7,0, e 1,5% agar) e incubare per 24 ore a 28 ° C. Utilizzare la cultura freschi per preparare l'inoculo e iniziano sempre piastre di coltura dalle scorte glicerolo come batteri diventa meno virulenti dopo sub-coltura.
- Utilizzare i batteri che crescono sulla piastra per iniziare una coltura liquida 10 ml di P. syringae in una beuta da ml 50. Incubare la cultura notte a 28 ° C con forte agitazione fino a raggiungere densità ottica o OD a 600 nm tra 0,8 e 1.
- Misurare la densità ottica a 600 e raccogliere le cellule per centrifugazione a 1360 xg per 10 minuti. Risospendere le cellule in acqua distillata in modo che il diametro finale è di 0,2. Questo corrisponde a OD 10 8 unità formanti colonia (CFU) / ml. Con i batteri pronti, procedere per preparare le foglie ed eseguire il test.
2. Foglia di colorazione e di incubazione con i batteri
- Al fine di macchiare le prime foglie preparare 20 ioduro di propidio mM o la soluzione PI in acqua. 10 ml di soluzione è sufficiente a macchiare 3 foglie piccole alla volta.
- Recuperare le piante dalla camera di crescita e con una pinza staccare 3 giovani, completamente ampliata foglie. Immergere le foglie intere nella soluzione PI per 5 minuti. Quindi rimuovere le foglie e sciacquarli brevemente con acqua distillata.
- Posto accanto una foglia con la superficie inferiore rivolta verso il basso su un vetrino da microscopio. Tagliare la foglia con una lama di rasoio affilato in quattro pezzi esclusa la vena a metà in modo che la foglia adagiata sulla diapositiva.
- Ad incubare i batteri con le foglie, aggiungere 300 ml di sospensione batterica con i pezzi di foglia nella diapositiva. Assicurarsi che la superficie inferiore della foglia è in contatto con l'inoculo.
- Incubare i campioni nelle stesse condizioni ambientali che sono state adibite alla coltura delle piante. Al momento per osservare al microscopio le foglie, il trasferimento dei pezzi foglia di una nuova diapositiva con minore superficie rivolta verso l'alto. Si noti che scivolano copertura non viene utilizzata durante il montaggio le diapositive. Il campione stessa foglia può essere ripreso più volte durante l'incubazione e un corso di tempo può essere impostato in funzione degli obiettivi della ricerca.
3. Microscopia, di misura e analisi dei dati
- Ecco un microscopio confocale a scansione laser (LSM 510 Meta, Carl Zeiss Inc.) è utilizzato per esaminare le foglie. Osservare la superficie inferiore delle foglie per rilevare la fluorescenza di PI (eccitazione 453 nm, emissione di 543 e 620 nm).
- Utilizzando i campioni stessa foglia di catturare immagini di stomi nel tempo. Salvare le immagini per misurare la larghezza della apertura stomatica.
- Misura larghezza stomatica apertura di almeno 60 stomi per ogni trattamento ad ogni punto ora con l'immagine del browser LSM.
- Calcolare l'errore medio e standard per la larghezza di apertura stomatica. Significatività statistica dei risultati può essere calcolato usando 2-code, Studente appaiati saggio t-test.
4. Immagini rappresentante della risposta stomatica di incubazione con i batteri
- Ecco una tipica immagine microscopica (usando un obiettivo 20x) di una superficie fogliare di Arabidopsis con microscopio confocale a scansione laser in vista in campo chiaro (Figura 1).
- Macchie di ioduro di propidio la parete cellulare delle cellule vitali aumentare la visibilità delle cellule di guardia, oltre a consentire l'identificazione di cellule non danneggiate per la raccolta dei dati (Figura 2). Una serie di aperture dei pori stomatica può essere visto in questi micrografie, da stomi completamente chiuso al largo stomi aperti.
- Stomi completamente chiuso sono identificati con la forma delle cellule di guardia (Figura 3). La larghezza di apertura è considerato 0 micron.
- Per stomi aperti (Figura 4) la larghezza apertura mostrata è misurato utilizzando una linea retta tracciata attraverso la più ampia superficie del poro stomatica.
- Questi risultati sperimentali sono tipici di questo test stomi. Arabidopis le foglie sono state incubate al buio con tre diversi ceppi di Pseudomonas syringae. Solo il batterio Pst DC3000 è in grado di aprire scuro chiuso stomi, misurata dalla larghezza di apertura selezionati in modo casuale 60 stomi per ceppo batterico (Figura 5).
Figura 1. Micrografia della superficie di una foglia di Arabidopsis. Un campo di vista della superficie fogliare con microscopio confocale a scansione laser (LSCM) utilizzando il 20x obiettivo. Si noti che l'apertura degli stomi non è così evidente rispetto alla vista aiutato dalla colorazione fluorescente ioduro di propidio (Figura 2).
Figura 2. Micrografia della superficie di un propidio ioduro macchiato di foglia di Arabidopsis. Un campo di vista della superficie fogliare con microscopio confocale a scansione laser (LSCM) utilizzando il 20x obiettivo. Nota una gamma di apertura dei pori stomatica. Frecce gialle sono puntati a chiudere completamente stomi e frecce verdi sono puntati a largo stomi aperti.
Figura 3. Completamente stomi chiudere identificato dalla forma e l'apertura tra le cellule di guardia. La larghezza di apertura è considerato 0 micron.
Figura 4. Stomi aperti che mostrano l'ampiezza apertura in micron. Misure sono state prese utilizzando il browser LSCM sulla base di una linea retta tracciata attraverso la più ampia superficie del poro stomatica.
Figura 5. Apertura degli stomi delle foglie di Arabidopsis incubate con tre ceppi di Pseudomonas syringae pv pomodoro:.. DC3118, DB29, DC3000 e piante sono stati tenuti al buio durante il periodo di sperimentazione. I risultati sono mostrati come media (n = 50-70) ± errore standard. Significatività statistica è stata rilevata con due code di Student t-test. L'esperimento è stato ripetuto tre volte con risultati simili.
Discussion
Abbiamo presentato una procedura semplice da misurare apertura degli stomi nei tessuti foglia intatta che permette una valutazione della risposta stomatica facile per diversi trattamenti.
Anche se abbiamo presentato i risultati utilizzando il sistema modello Arabidopsis / Pseudomonas syringae, il saggio foglia intatta stomi possono essere potenzialmente eseguita con tutta la pianta-batterio combinazione. Il protocollo può essere facilmente modificato per soddisfare esigenze di crescita di altre piante e batteri patogeni. Il principio generale e la procedura rimane la stessa. Inoltre, questo metodo può essere utile ai ricercatori che desiderano studiare in uscita funzionale delle cellule di guardia non solo di vivere microbi, ma anche ad altri stimoli e agli agenti chimici in condizioni che consentono di mantenere l'ambiente naturale della foglia.
Foglia intera può essere difficile per l'immagine grazie al suo spessore e la topografia irregolare. Questo problema può essere alleviato rimuovendo la vena metà della foglia in modo che adagiata sul vetrino e usando la microscopia confocale. Tuttavia, altri tipi di microscopio a fluorescenza può essere utilizzato per ottenere immagini ad alta risoluzione della superficie fogliare.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione da parte del National Institute of Health e l'Università del Texas ad Arlington istituito fondi a MM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-1 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 0127-01-7 | |
| Sodium Chloride | VWR international | 7647-14-5 | |
| Agar | Bio Express | J637-2500G | |
| Plant growth chamber | |||
| Shaker incubator | |||
| Laser scanning confocal microscope |
References
- Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis Book. Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. , American Society of Plant Biologists. Rockville, MD. (2002).
- Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato. Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126, 969-980 (2006).
