Summary
本論文では、成長の異なる方法を説明します
Abstract
細菌バイオフィルムは、さまざまなヒト疾患の番号に関連付けされているが、バイオフィルムの開発は、一般的に非生物表面上で検討されている。本稿では、文化の中で増殖したヒト気道上皮細胞（CFBE細胞）の緑膿菌のバイオフィルムを形成するためのプロトコルについて説明します。最初の方法で（静的共培養バイオフィルムモデルと呼ばれる）、P.緑膿菌は、標準組織培養プレート上にコンフルエントな単層として成長CFBE細胞とともにインキュベートする。細菌が上皮細胞に非常に有毒であるが、アルギニン遅延単層の破壊のほかには、十分な長さバイオフィルムのためにCFBE細胞を形成する。第二の方法は、（フローセル共培養バイオフィルムモデルと呼ばれる）、CFBE細胞のコンフルエントな単層を支持するガラスのカバースリップに対応するために、しばしばバイオフィルムの研究で使用されるバイオフィルムのフローセルの装置、の適応を含む。この単分子膜は、P.を接種する緑膿菌と蠕動ポンプは、細胞全体に新鮮な培地を流れる。両方のシステムでは、細菌のバイオフィルムは、接種後6-8時間以内に形成する。バイオフィルムの可視化は、P.の機能を使用することで改善され緑膿菌株は、構成的に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する。静的およびフローセルの共培養バイオアッセイは、初期のPのモデル系です。 緑膿菌の嚢胞性線維症（CF）肺の感染症、およびこれらの技術は、Pの異なる側面を許可するバイオフィルム細胞毒性、バイオフィルムCFUの測定、およびバイオフィルムを染色し、可視化を含め、検討する緑膿菌のバイオフィルム形成と病原性。
Protocol
1。静的な共培養バイオフィルムモデル
- 静的な共培養バイオフィルムモデル1は、もともとΔF508- CFTR変異2,3,4用CFホモ接合と個々の開発した細胞を不死化しているCFBE41o -細胞（CFBE細胞）、使用しています。 CFBE細胞/ウェル、6ウェル組織培養プレートまたは2 10％ウシ胎児血清を添加した最小必須培地（MEM）で24ウェル組織培養プレートのX 10 5、10 6細胞の濃度で播種してください2mMのL -グルタミン、50 U / mlペニシリン、および50μg/ mlのストレプトマイシン。我々は、6ウェルプレート、24ウェルプレートにウェル当たり0.5mLの培地に1ウェルあたり1.5 mLの培地を使用してください。
- 細胞は、7〜10日のため℃、5％CO 2 -95％空気細菌を接種する前にコンフルエントな単層を形成するために37℃で成長させることがあります。培地は2〜3日ごとに変更する必要があります。これらの条件は、コンフルエントな単層とタイトジャンクションの形成につながることが示されている。
- 37℃で18時間、5 mLのLBで緑膿菌を育てる℃〜200 rpmでインキュベーターシェーカーで。これらの条件の下で、P.緑膿菌の培養は、通常、5 × 10 9 CFU / mLの密度に達する。
- 細菌接種の場合は、CFBE細胞から培地を除去し、2mMのL -グルタミン（顕微鏡の培地）を添加したフェノールレッドを含まないMEMの等量を、追加してください。コンフルエントCFBEの単層を、P.を接種するもともと播種CFBE細胞の数に対して約30:1相対の感染多重度で緑膿菌 。これは、1.5 mLのMEMで/ウェル、6ウェルプレートおよび24ウェルプレート用0.5mLのMEM /ウェルで1.2 × 10 7 CFU / mLのための2 × 10 7 CFU / mLに相当します。
- 37℃および5％CO 2 -95％空気を1時間プレートをインキュベートする。
- 1時間のインキュベーション後、上清を0.4％アルギニンを添加した新鮮な顕微鏡の培地を除去し、交換する必要があります。
- さまざまなタイムポイント（最大約8時間まで）のための℃、5％CO 2 -95％空気で37インキュベートすると、位相差顕微鏡を使用してCFBE単分子層の整合性を分析する。気道細胞が非コンフルエントな場合は、P.緑膿菌は急速に（数分以内に）細胞の側底表面にアクセスして、細胞の完全性を破壊します。 P.接種恒常的に落射蛍光または共焦点顕微鏡により可視化できる蛍光バイオフィルムmicrocoloniesでGFPの結果を表現する緑膿菌株。
- バイオフィルム内の細菌のCFUは、浮遊細菌を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）との共培養2〜3回洗浄することにより決定することができます。洗浄に続いて、0.1％が10-15分のためのPBSまたはMEMのトリトンX - 100上皮細胞を溶解し、バイオフィルムを分散させるために扱う。
- 3分間ボルテックスし、溶解液の希釈系列を用意する。プレートは、これらのLB寒天培地上に希釈し、37℃で一晩インキュベート℃、 CFUを決定するために次の日にコロニーを数える。
2。フローセルの共培養バイオフィルムモデル
- フローセルの共培養バイオフィルムモデル（フローアッセイ）は、5 CFBEセルを収容するために標準的なバイオフィルムフローセルの装置の変更を伴います。
- クリーン100mLのビーカーに、いくつかの40mm径のガラス製カバースリップを配置。 20分間、乾燥サイクルのアルミ箔とオートクレーブの2層でしっかりとカバー。
- 細胞培養のフードでの作業、滅菌60 mmの直径のプラスチックシャーレにエタノール洗浄鉗子と場所を使用してビーカーから一滅菌カバースリップをつかむ。
- 下敷きにどんなバブルを除去するため、プラスチック皿の底にカバースリップを強制的にピペットの先端にカバースリップを押して、予め温めておいた培養液3 mLを追加します。
- 種子皿あたり2 × 10 6個の細胞と前後に軽く料理を振る。皿の側面から細胞を遠心分離することを防止するために渦巻く避けてください。
- 37 ° Cと8〜10日で3 mLの新鮮な増殖培地で一日おきに細胞を養うには、5％CO 2 -95％空気インキュベーターに皿を置きます。細胞はガラスのカバースリップ上にコンフルエントな単層を形成します。
- P.を拡大37℃18時間、5 mLのLB〜200 rpmでインキュベーターシェーカー上にC言語の緑膿菌 。これらの条件の下で、P.緑膿菌の培養は、通常、5 × 10 9 CFU / mLの密度に達する。我々は、Pを使うGFP 6の構成的発現のためにpSMC21プラスミドを有する緑膿菌の菌株のPAO1。
- 滅菌した微量遠心チューブに細菌培養液1 mLを加え。 3分間6000rpmで遠心し、顕微鏡の培地1mL中に二回、細菌ペレットを洗う。
- 〜5 × 10 8 CFU / mLの濃度を達成するために4.5mLの顕微鏡の培地に洗浄し、再懸濁した細菌の0.5 mLを希釈する。
- 生きた細胞の観察リアルタイムで蠕動ポンプ（時間の延長長さの栄養物の流れを確保する）と温度コントローラに結合イメージングチャンバーを必要とします。我々は、FCS2室のコントローラを介して適切な長さに切断し、不妊のためにオートクレーブし、温度調節さ1 / 16 C -フレックスチューブと低流量マイクロ灌流ポンプに接続Bioptechs FCS2（フォットライブセル）チャンバーを使用してください。我々は、顕微鏡の横にある右にある37℃の水浴で培地の入力ソースを保持。
- フローチャンバーを組み立てます。 FCS2室はセルフロッキングベース（撮像中にステージアダプタに座っている）と灌流チューブとチャンバーのコントローラに接続されて上半分が含まれています。裏返しとステージアダプタ上に配置される前にチャンバーは逆さまに組み立てられています。灌流チューブが表示されるように逆さまにチャンバーの上半分をホールドし、灌流チューブに0.75 mm厚のゴム製のガスケットの隙間の穴を合わせます。溝側がアップしていることを確認して、ゴム製のガスケットの上室に付属してmicroaqueductスライドを積み重ね、そしてスライドの上に別のゴム製のガスケットを置きます。この第二のガスケットの厚さと内部の形状は、チャンバの容積を決定します。我々は通常、30 mmの円形の内部形状を持つ0.75 - mm厚ゴム製のガスケットで動作します。
- スライドの中央に予め温めておいた（37℃）顕微鏡の培地1mLを追加。
- 細胞培養インキュベーターから60 - mmディッシュを取得、使用済み培地を除去し、予め温めておいた顕微鏡培地3mLで細胞を1回洗浄する。このステップでは、細胞増殖培地中に存在するフェノールレッドと抗生物質の除去を確実にします。抗生物質は、P.を根絶できる一方フェノールレッドは、軽度の蛍光であり、画像処理に干渉することが緑膿菌がバイオフィルムを確立する前に。
- エタノール洗浄鉗子を使用して、皿からカバースリップを取得し、チャンバー内に配置された顕微鏡媒体のビーズの上に逆さまに下ろします。カバースリップは2番目のゴム製のガスケットに着くと気道細胞の単層は下方に直面している。
- 片方の手で組み立てられた部品を保持している、スタックの一番上にチャンバーのベースを配置し、すべてが右側上になるように、急速に上のチャンバーを回します。リングを回して所定の位置にベースをロックします。
- マイクロ灌流ポンプの低流量にインレットチューブを接続し、20mLの/ hの速度で流れを開始し、この流量は、P.の水泳のスピード能力の範囲内です。 緑膿菌 。チューブのリンクの2番目の要素顕微鏡の横にある右にある37℃の水浴中に置かれた顕微鏡の培地のフラスコにポンプ。
- チャンバーの入口および出口灌流チューブに滅菌済みのカット1 / 16 C -フレックスのチューブを取り付ける、倒立蛍光顕微鏡の顕微鏡ステージに組み込まれたチェンバーを配置し、温度コントローラを接続する。
- 1 mLの使い捨て注射器を使用して、ポンプとチャンバとの間にインラインで配置された二方弁を使用して、チャンバー内に予め用意された細菌懸濁液を注入する。私たちの特定の設定では、それはチャンバーに到達するための細菌懸濁液0.6 mLのボリュームを取ります。特定のチューブの長さに応じてこのボリュームを調整します。我々はまた、流れに逆らって泳ぐと、入力フラスコを汚染から細菌を防ぐために、ポンプと二方弁との間のフィルタのインライン使い捨て0.22μmのを配置すると便利です。
- 細菌は、気道の細胞に付着できるようにするには、2時間のためにポンプを停止します。流れは、実験の残りのための再実行および20mL / hで維持することができます。
- 単分子層への損傷の徴候を調べるために実験を通して微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡による気道細胞の整合性を監視します。同時に、GFPで標識したP.の発展に従ってください反転共焦点またはワイドフィールド蛍光顕微鏡で画像を取得することにより気道細胞の頂端表面における緑膿菌のバイオフィルム。
3。代表的な結果
我々は、P.の菌株を使用GFP 6の構成的発現を可能にするプラスミドpSMC21を含む緑膿菌 。このような理由から、CFBE単層上に成長しているGFPで標識したバイオフィルムは、落射蛍光顕微鏡で可視化することができる。また、バイオフィルムの可視化は、ラベルのないP.を染色することによって達成することができます37 ° C 1で1時間に1％calcofluor白のソリューションと緑膿菌 。
フローアッセイにおけるCFBE細胞のイメージングバイオフィルム形成のために、我々は、カスタムメイドのステージアダプタを使用しますが、いくつかの企業は、現在特別にフィットステージアダプタを提供することができます。我々は、ORCA - AGの深い冷却CCDカメラとX60の油浸対物レンズ（開口数1.40）を装備したオリンパスIX70倒立顕微鏡で動作。フィルタありヒールは40分の480 nmのバンドパス励起フィルターと30分の535 nmのバンドパス発光フィルターを装備しています。デジタル画像は、オープンラボ4.0.3ソフトウェアパッケージ（即興）で買収されたとボリュームがVolocity 3.5.1ソフトウェア（即興）を使用して復元を反復により、デコンボリューションされた。 3Dバイオフィルム構造の定量的な分析は、犯罪統計システムの画像解析ソフトウェアパッケージ7.8で達成された。
考慮したいずれの共培養モデルでは、一つのモデルのコンポーネント間の開発細胞毒性に特に注意を払う必要があります。静的およびフローセルアッセイの両方で、我々はCFBE単層は、Pの存在を耐えることがわかった変化の兆候なしに接種後、最大8時間のための緑膿菌 。上皮単層の整合性は、倒立顕微鏡1（図1A）を使用して位相差顕微鏡により、または実験5を通して微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡によって評価することができる。時間が経つにつれて、P.緑膿菌が蓄積し、完全にまたはセクション（図1B - 1C）における上皮細胞の単層に損傷を与える可能性毒素および病原性因子を生成します。細胞毒性を定量的に上皮細胞から乳酸脱水素酵素（LDH）の放出を測定するために様々なキットを用いて評価することができる。 LDHは細胞溶解または細胞死の際細胞外環境でリリース済みの安定細胞質ゾルの酵素である。
気道の単分子層の整合性が損なわれること（通常は〜8時間以下の接種のため）、P.緑膿菌のバイオフィルムは、正常に形成し、説明した共培養モデルの両方の気道細胞の先端面（図2A - 2B）で開発することができます。 3次元再構成（図2C）と定量化に続いて、バイオマスの蓄積を正確に決定することができます。我々はまた、いくつかの表現型アッセイではこれらの共培養のバイオフィルムを使用している。上記のように例えば、、バイオフィルムCFUは簡単に、上皮細胞を溶解し連続的に溶解液を希釈し、寒天プレート上で平板培養することにより決定することができます。私たちは、抗生物質治療に異なる系統の抵抗を決定する際にこの手法が有利発見した。さらに、上皮細胞に向かってバイオフィルムの毒性は、市販のLDHの検出キットを用いて測定することができます。このように、バイオフィルムの毒性の毒性因子の役割を評価することができます。これらのモデル系でもプロモーターの融合学、RT - PCR、およびマイクロアレイ解析1,5,9を含む遺伝子発現のアプリケーションの数を、サポートしています。
図1。 CFBE細胞とP.による侵害及び損傷気道の細胞単層の代表的な画像の単分子層緑膿菌のバイオフィルムの成長。（A）組織培養プレートで培養CFBE細胞のコンフルエントな単層の代表的なイメージは、位相差顕微鏡で評価した。スケールバー、120μmの。侵害CFBEの単分子層の（B）の例。単分子層は、まだ被害の明らかな目に見える兆候が表示されないにもかかわらず、P.緑膿菌は上皮細胞と側底膜に獲得するアクセスのタイトジャンクションの間に広がって見られている。バイオフィルム形成は、一般的に悪化単層のため、これらの条件下で達成されていません。スケールバー、20μmである。草に覆われたPの（C）の例緑膿菌のバイオフィルムは、24時間後の接種を観察した。成功したバイオフィルム形成を支援した後、CFBEの単層を修復できないほど壊れていると今事実上存在しないされました。細菌の平らな層として成長している残存バイオフィルムは、ガラスのカバースリップに取り付ける示されています。スケールバー、20μmである。
図2 P.緑膿菌のバイオフィルムは、静的な共培養バイオフィルムモデルとフローセルの共培養バイオフィルムモデルを用いてコンフルエントCFBE細胞の頂端表面に成長。GFPを発現するPをの（）代表画像緑膿菌のバイオフィルムは、落射蛍光顕微鏡で評価した静的な共培養バイオフィルムモデルを、使用してCFBE細胞のコンフルエントな単層上に成長。画像は、位相コントラストチャネルと蛍光チャンネルのオーバーレイです。スケールバー、35μmである。 GFP標識したP.の（B）代表画像緑膿菌のバイオフィルムは、フローセルの共培養バイオフィルムモデルを用いてCFBE細胞のコンフルエントな単層上で6時間増殖させた。気道の単分子膜の可視化を容易にするために、核はP.の接種前に30分間10μg/ mLのヘキスト33342（Molecular Probes）で染色した緑膿菌 。マージされたと疑似画像は微分干渉コントラスト（DIC）で表示され、そして対応する蛍光像が表示されます。 CFBE細胞の頂端表面に付着した緑の塊として提示するバイオフィルムは、気道の細胞に分散されています。スケールバー、20μmである。 （C）三次元形状を復元6時間前のPの典型的なキノコのような構造を示すZシリーズの画像スタックのる緑膿菌のバイオフィルムは、CFBE細胞単層を形成する。スケールバーは10μm。
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Discussion
バイオフィルムは、環境刺激に応答して形成する細菌のコミュニティです。これらの環境シグナルは、世界的な規制表面に結合することで、その結果、各細菌内の変更、集約、exopolysaccharidesの生産、及びそのような増加抗生物質耐性10のような他の表現につながる。ここ数十年にわたって、多くの証拠はバイオフィルムは、慢性感染症の病因に大きな役割を果たすという仮説をサポートしてきました。例えば、それはよく受け入れられているP.緑膿菌がバイオフィルム11を形成することにより嚢胞性線維症（CF）患者の肺の慢性感染を確立することができる。 CFは、CFTR遺伝子の変異が不適切な塩化物分泌12につながる遺伝的障害、です。 CFの患者は、典型的に気道生理学は微生物感染13に、同時に、気道の粘液栓につながると変更体験。青年期後期では、CF気道の支配的な感染性因子は Pです。抗生物質14に耐性がある慢性的なバイオフィルム感染症につながる緑膿菌 、。
このホワイトペーパーに記載されているプロトコルは、生きている肺の細胞のバイオフィルム形成を研究するためのモデル系として動作するために開発されている。細菌バイオフィルムは、多くの疾患状態に関与していると、まだ、ほとんどがそのようなガラスやプラスチックの15,16のような非生物固体表面上で研究されている。唯一の非生物表面にバイオフィルム形成と成長を研究することによって、1つは、上記のプロトコルで説明されているようなモデル系で発生する可能性の病原体と宿主の間に重要な相互作用が欠落している。具体的には、静的な共培養バイオフィルムモデルとフローセルの共培養バイオフィルムモデルは、P.の能力を活用すると相互作用し、肺の上皮表面に結合する緑膿菌 。これらのモデルを使用して、我々は抗生物質による治療への共培養のバイオフィルムの応答が一意であることと、これらのモデルは、正確に感染状態1,5を反映する可能性が高いことが示されている。この点に関し、我々は、> 25倍P.のトブラマイシンの増加への耐性が報告されている緑膿菌のバイオフィルムは、ガラス5のような非生物表面上に成長したバイオフィルムと比較して気道の細胞に成長されています。それは、これらの技術は、肺の17の初期の植民地化中に発生するイベントを反映している可能性があります。したがって、共培養モデル系は、P.によるCFの気道上皮の早期の感染を理解するための革新的なツールを表して緑膿菌 1。
組織培養システムは、一般的にホストと病原体間の相互作用を理解するために採用されている。我々は生きてヒト上皮細胞上にバイオフィルムを形成することにより、さらに一歩、これらの相互作用をとっている。将来的には、ここで説明するモデルの修正版は、潜在的に他の感染状態の異なる細菌のバイオフィルム形成を調査するために使用することができる。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、これらのモデルの開発に指導および提案のためG. Oトゥールに感謝したいと思います。この作品は、嚢胞性線維症財団（GGA、STANTO07ROとSTANTO08GAにBASにANDERS06F0）、国立衛生研究所（GGAとR01 - HL074175にBASにT32A107363）、および生物医学研究の卓越性のための研究資源センターのナショナルセンターによってサポートされていました（コブルBASへP20 - RR018787）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FCS2 (Focht Live-Cell) chamber | Bioptechs | 060319131616 | |
| FCS2 chamber controller | Bioptechs | 060319-2-0303 | |
| 40 mm glass coverslips | Bioptechs | PH 40-1313-0319 | |
| MEM | Mediatech, Inc. | #10-010-CV | |
| MEM without phenol red | Mediatech, Inc. | Mediatech, Manassass, VA |
References
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infect Immun. 76, 1423-1433 (2008).
- Bruscia, E. Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting. Gene Ther. 9, 683-685 (2002).
- Cozens, A. L. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
- Hentchel-Franks, K. Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine. Am J Respir Cell Mol Biol. 31, 140-146 (2004).
- Moreau-Marquis, S. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 25-37 (2008).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, (2005).
- Heydorn, A. Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms. Microbiology. 146 (Pt 10), 2409-2415 (2000).
- Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Anderson, G. G., Yahr, T. L., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A. The Pseudomonas aeruginosa magnesium transporter MgtE inhibits transcription of the type III secretion system. Infect Immun. 78, (2010).
- Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J Ind Microbiol. 15, 137-140 (1995).
- Hoiby, N., Frederiksen, B., Pressler, T. Eradication of early Pseudomonas aeruginosa infection. J Cyst Fibros. 4, Suppl 2. 49-54 (2005).
- Ko, Y. H., Pedersen, P. L. Cystic fibrosis: a brief look at some highlights of a decade of research focused on elucidating and correcting the molecular basis of the disease. J Bioenerg Biomembr. 33, 513-521 (2001).
- Gibson, R. L., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 168, 918-951 (2003).
- Furukawa, S., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, Unit 1B 1-Unit 1B 1 (2005).
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- Gomez, M. I., Prince, A. Opportunistic infections in lung disease: Pseudomonas infections in cystic fibrosis. Curr Opin Pharmacol. 7, 244-251 (2007).
