Summary
इस वीडियो में, Nijole Jasinskiene ट्रांसजेनिक एडीज aegypti मच्छरों, जो डेंगू बुखार के लिए वैक्टर हैं उत्पन्न करने के लिए नियोजित कार्यप्रणाली को दर्शाता है. microinjection सुई को सही ढंग से तैयार करने, भ्रूण dessicating, और microinjection प्रदर्शन के लिए तकनीक का प्रदर्शन कर रहे हैं.
Abstract
इस वीडियो में, Nijole Jasinskiene ट्रांसजेनिक एडीज aegypti मच्छरों, जो डेंगू बुखार के लिए वैक्टर हैं उत्पन्न करने के लिए नियोजित कार्यप्रणाली को दर्शाता है. microinjection सुई को सही ढंग से तैयार करने, भ्रूण dessicating, और microinjection प्रदर्शन के लिए तकनीक का प्रदर्शन कर रहे हैं.
Protocol
Microinjection के अग्रिम में तैयार
- रक्त फ़ीड मच्छरों: सोमवार से शुक्रवार को पिछले गुरुवार को फ़ीड महिलाओं को इंजेक्शन के लिए.
- कांच 3 प्रोग्राम या 2 (सामग्री देखें) का उपयोग कर सुई तैयार करो.
- भ्रूण के लिए ट्यूब बिछाने ड्रोसोफिला संस्कृति शीशी है. नीचे में गीले कपास इसे कवर फिल्टर कागज के एक गीला डिस्क के साथ, ऊन.
- एक छोर पर डबल साइड टेप चिपका द्वारा प्लास्टिक कवर पर्ची तैयार करें. पर्ची छाँटो टेप करने के लिए कवर इतना है कि यह कवर पर्ची के किनारे पर समाप्त होता है.
- Desiccation के लिए तेल तैयार (सामग्री देखें)
- नीचे में एक गीला कपास, ऊन, इंजेक्शन के बाद भ्रूण को रखने के लिए फिल्टर पेपर (80mm वाटमान) के एक गीला डिस्क के साथ कवर के साथ 150 मिलीलीटर की प्लास्टिक बीकर.
मजबूर बिछाने के सेट अप
- एक Aspirator के उपयोग के साथ 6-10 रक्त खिलाया महिलाओं लीजिए और उन्हें गीला कपास और फिल्टर पेपर के साथ ड्रोसोफिला संस्कृति शीशी को हस्तांतरण.
- मच्छरों वापस अंधेरे में insectory स्थितियों में, रखो और 1 और 15min के लिए अण्डे की अनुमति.
- वयस्कों के पिंजरे में उड़ान भरने के लिए और भ्रूण के साथ फिल्टर पेपर डिस्क को हटाने.
- अप करने के लिए अंडे लाइन, तो विदारक गुंजाइश के तहत. ठीक संदंश सं 5 या एक ठीक तूलिका का प्रयोग, darkish ग्रे भ्रूण के लिए ग्रे लेने और 3mm वाटमान पानी से लथपथ कागज के वर्ग पर लाइन में व्यवस्था. सभी भ्रूण एक ही ओरिएंटेशन में होना है, के रूप में इंजेक्शन के पीछे ध्रुव पर हो गया है चाहिए. भ्रूण के पूर्वकाल अंत थोड़ा पीछे की तुलना में व्यापक है. यह करने के लिए सूखी फिल्टर पेपर दबाने (गीला बातें टेप करने के लिए छड़ी नहीं होगा) द्वारा भ्रूण के साथ फिल्टर पेपर सूखी. अंडे स्थानांतरण, टेप डबल पक्षीय युक्त स्लाइड पलटना और धीरे अंडे के खिलाफ दबाएँ. अंडे के पीछे के अंत करने के लिए डबल पक्षीय टेप के किनारे करने के लिए बहुत करीब है.
- 1 मिनट के बारे में भ्रूण कुम्हलाना. कमरे के तापमान पर. वे थोड़ा हिलकोरे शुरू के रूप में वे सूखी.
- हेलोकार्बन तेल के साथ desiccated भ्रूण आगे desiccation को रोकने के कवर.
भ्रूण की Microinjection
- अच्छा इंजेक्शन का सबसे महत्वपूर्ण पहलू सुई की गुणवत्ता है (सामग्री देखें).
- डीएनए microloader का उपयोग करके इंजेक्शन समाधान के साथ एक सुई भरें. Μl 1 से 2: बहुत थोड़ा इंजेक्शन समाधान की जरूरत है.
- सुई Transjector, जो इंजेक्शन (मनु) समय और दबाव (600) नियंत्रण और backpressure (250) करने के लिए कनेक्ट. Microinjection x 10 बढ़ाई और micromanipulator पर एक से बढ़ चरण (Leica) के साथ एक खुर्दबीन का उपयोग किया जाता है. यदि आवश्यक हो, एक उठाया खुर्दबीन मंच 4-5 खुर्दबीन स्लाइड stacking द्वारा तैयार किया जा सकता है. कवर उठाया मंच पर पर्ची ले जाने भ्रूण रखें. भ्रूण क्षैतिज इंजेक्षन endochorion के फाड़ रोकने; पीछे पोल में प्रवेश किया जाना चाहिए. इंजेक्शन के लिए, मैं सुई स्थिर रखने के लिए और माइक्रोस्कोप के चरण ले जाने के.
- 0.2-0.5 nl के समाधान है, भ्रूण की मात्रा का लगभग 1-5% करने के लिए इसी इंजेक्षन. इंजेक्शन के दबाव और समय का समायोजन करके इंजेक्शन की मात्रा पर नियंत्रण रखो. थोड़ा झुका, desiccated भ्रूण उनके turgid उपस्थिति निम्नलिखित इंजेक्शन हासिल करना चाहिए.
- ठीक संदंश या एक ठीक ब्रश का उपयोग कर कवर पर्ची से भ्रूण उठाओ, और गीला कपास और गीले फिल्टर पेपर के साथ एक प्लास्टिक बीकर में उन्हें जगह. टिशू पेपर के साथ बीकर कवर. रिम आसपास इलास्टिक बैंड के साथ जगह में रखें और 4 दिनों के लिए insectary शर्तों के लौटने.
इंजेक्शन के बाद
- चार दिन के बाद, ध्यान से जगह भ्रूण कागज, भोजन की एक छोटी राशि के साथ बड़े प्लास्टिक के बॉक्स में पानी पर नीचे भ्रूण की ओर. भ्रूण एक बहुत ही लंबी अवधि से अधिक पक्षियों के बच्चे: जब तक कम से कम 4-5 सप्ताह के बाद इंजेक्शन संस्कृति से बाहर नहीं फेंक.
नोट्स
इंजेक्शन के लिए डीएनए
इंजेक्शन के लिए डीएनए प्लाज्मिड समाधान EndoFree प्लाज्मिड किट का उपयोग कर पृथक किया गया. निर्माण और हेल्पर सही एकाग्रता में प्लाज्मिड मिश्रण एक साथ, izopropanol के साथ उपजी. गोली 70% इथेनॉल के साथ इंजेक्शन बफर में resuspending से पहले धोया था. इससे पहले इंजेक्शन, स्वच्छ Millex - जीवी स्तंभ का उपयोग डीएनए.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Injection solution | Buffer | 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8 | ||
| Construct plasmid | DNA | 0.5 mg/ml. | ||
| Helper plasmid | DNA | 0.3 mg/ml | ||
| EndoFree Plasmid kit | Kit | Qiagen | ||
| Millex-GV column | SLGV RO4 NL | To clean DNA. | ||
| Glass puller | Instrument | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100.Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50 |
| Quartz puller | Instrument | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141 |
| Injection glass needles | Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument). | |||
| Aedes aegypti | Animal | Male and female mosquitos, to obtain embryos. | ||
| Drosophila culture vial | For mosquito egg-laying. | |||
| Halocarbon oil | Reagent | Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1) | ||
| Forceps No5 | Tool | |||
| Fine paintbrush | Kolinsky Sable | No. 0000 | ||
| Whatman paper | Tool | |||
| Microloader | Tool | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Transjector | Tool | Eppendorf | ||
| Microscope | Leica Microsystems | With moving stage and micromanipulator. | ||
| 3MM Whatman paper | ||||
| double sided tape |
