Microinyección de A. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos

Summary

En este video, Nijole Jasinskiene demuestra la metodología utilizada para generar transgénicos mosquito Aedes aegypti, que son vectores de la fiebre del dengue. Las técnicas para la correcta preparación de las agujas de microinyección, desecación embriones, y la realización de la microinyección se demuestran.

Abstract

En este video, Nijole Jasinskiene demuestra la metodología utilizada para generar transgénicos mosquito Aedes aegypti, que son vectores de la fiebre del dengue. Las técnicas para la correcta preparación de las agujas de microinyección, desecación embriones, y la realización de la microinyección se demuestran.

Protocol

Preparación antes de la microinyección

1. Los mosquitos la sangre de alimentación: para la inyección de lunes a viernes en hembras se alimentan el jueves anterior.
2. Prepare las agujas de vidrio mediante el programa de 3 o 2 (ver Materiales).
3. Por la que se tubo para los embriones de Drosophila vial cultura. Algodón húmedo en la parte inferior, con un disco de papel de filtro húmedo que lo cubre.
4. Prepare cubreobjetos de plástico adhesiva de doble cara de la cinta a un extremo. Cinta de ajuste para cubrir deslizamiento de forma que termine en el borde del cubreobjetos.
5. Preparar el aceite para la desecación (ver Materiales)
6. 150 ml vaso de plástico con un algodón húmedo en la parte inferior, cubierto con un disco de papel de filtro húmedo (80 mm Whatman) para mantener los embriones después de la inyección.

Puesta en marcha de por la que se obligó

1. Recoger 60-10 hembras alimentadas con sangre con el uso de un aspirador y transferirlos a la cultura vial Drosophila con algodón húmedo y papel de filtro.
2. Puesto que los mosquitos de nuevo en condiciones insectory en la oscuridad, y permitir a poner huevos durante 1 hora y 15 minutos.
3. Permiten a los adultos vuelan en la jaula y retire el disco de papel filtro con embriones.
4. Para alinear los huevos, lo hacen bajo microscopio de disección. Con unas pinzas finas N º 5 o un pincel fino, de color gris a recoger oscuro-gris embriones y los arreglos en línea en la plaza de papel Whatman 3MM empapado de agua. Todos los embriones debe estar en la misma orientación, como la inyección tiene que estar en el polo posterior. El extremo anterior del embrión es ligeramente más ancha que la posterior. Seque el papel de filtro con embriones pulsando un papel de filtro seco para (ropa mojada no se pegue a la cinta). Para transferir los huevos, invertir la diapositiva que contiene la cinta de doble cara y presione suavemente contra los huevos. El extremo posterior de los huevos tienen que estar muy cerca de la orilla de la cinta de doble cara.
5. Desecar los embriones de 1 min. a temperatura ambiente. Empiezan a hoyuelo poco cuando se secan.
6. Cubrir los embriones desecados con aceite para evitar la desecación de halocarbonos más.

Microinyección de los embriones

1. El aspecto más importante de la inyección es la calidad de la aguja (ver Materiales).
2. Llenará una aguja con la solución de ADN que se inyecta mediante una microloader. Muy solución inyectable que se necesita poco: 1 a 2 l.
3. Conecte la aguja a la Transjector, que controla el tiempo de inyección (Manu) y presión (600), y la contrapresión (250). Microinyección se realizó con un microscopio con una etapa de movimiento (Leica) en x 10 aumentos y un micromanipulador. Si es necesario, una platina del microscopio puede ser levantado por el apilamiento preparar diapositivas 5.4 microscopio. Coloque la hoja de la cubierta lleva los embriones en etapa levantada. Inyectar embriones horizontal para evitar la ruptura de la endochorion, la penetración debe ser en el polo posterior. Para la inyección, que mantener la aguja fija y mover la platina del microscopio.
4. Inyectan 0.2-0.5 nl de solución, que corresponde a aproximadamente 1.5% del volumen del embrión. Controlar el volumen de inyección mediante el ajuste de la presión de inyección y el tiempo. El se inclinó ligeramente, los embriones desecados debe recuperar su turgencia después de la aparición de la inyección.
5. Recoger los embriones de la hoja de la cubierta con unas pinzas finas o un pincel fino, y colocarlos en un recipiente de plástico con algodón húmedo y papel de filtro húmedo. Cubrir vaso con papel de seda. Mantenga en su lugar con una banda elástica alrededor de la llanta y el retorno a las condiciones de insectario para 4 días.

Después de la inyección

1. Cuatro días después, se coloca cuidadosamente el papel del embrión, el embrión hacia abajo, sobre el agua en la caja grande de plástico con una pequeña cantidad de comida. Embriones eclosionan en un periodo muy largo: no se deshaga de la cultura por lo menos hasta 4-5 semanas después de la inyección.

Notas

ADN para la inyección

Solución de ADN plásmido para la inyección fue aislado utilizando el kit plásmido EndoFree. Construir y mezclar plásmido ayudante juntos en la concentración de la derecha, se precipitó con izopropanol. El sedimento se lavó con etanol al 70% antes de resuspender en tampón de inyección. Antes de la inyección, el ADN limpia utilizando Millex-GV columna.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1x Injection solution	Buffer			5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Construct plasmid	DNA			0.5 mg/ml.
Helper plasmid	DNA			0.3 mg/ml
EndoFree Plasmid kit	Kit	Qiagen
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	To clean DNA.
Glass puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-87	Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100.Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50
Quartz puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-2000	Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
Injection glass needles				Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument).
Aedes aegypti	Animal			Male and female mosquitos, to obtain embryos.
Drosophila culture vial				For mosquito egg-laying.
Halocarbon oil	Reagent			Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1)
Forceps No5	Tool
Fine paintbrush		Kolinsky Sable	No. 0000
Whatman paper	Tool
Microloader	Tool	Eppendorf	5242 956.003
Transjector	Tool	Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		With moving stage and micromanipulator.
3MM Whatman paper
double sided tape