Mikroinjektion av A. aegypti Embryon Skaffa Transgena myggor

Summary

I denna video visar Nijole Jasinskiene de metoder som använts för att generera transgena Aedes aegypti myggor, som är vektorer för denguefeber. De tekniker för korrekt förbereda mikroinjektion nålar, uttorkning embryon och utföra mikroinjektion demonstreras.

Abstract

I denna video visar Nijole Jasinskiene de metoder som använts för att generera transgena Aedes aegypti myggor, som är vektorer för denguefeber. De tekniker för korrekt förbereda mikroinjektion nålar, uttorkning embryon och utföra mikroinjektion demonstreras.

Protocol

Preparat i förväg mikroinjektion

1. Blod foder myggor: för injektion från måndag till fredag ​​mata honorna på föregående torsdag.
2. Förbered glaset nålar använder programmet 3 eller 2 (se material).
3. Att lägga rör för embryon är Drosophila kultur flaskan. Blöt bomull i botten, med en våt disk av filtrerpapper som täcker det.
4. Förbered plasthölje slinka genom att sticka dubbelsidig tejp på ena änden. Trimma tejp för att täcka glida så att den slutar vid kanten av locket halka.
5. Förbered olja för uttorkning (se Material)
6. 150 ml plastbägare med en våt bomullstuss i botten, täckt med en våt skiva av filtrerpapper (80mm Whatman) för att hålla embryon efter injektion.

Sätt upp av tvångsarbete om

1. Samla 6-10 blod matas honor med hjälp av en aspirator och överföra dem till Drosophila kultur flaskan med våt bomull och filterpapper.
2. Sätt myggorna tillbaka i insectory villkor i mörkret, och låt den lägga ägg på 1h och 15min.
3. Låt vuxna flyga in i buren och ta bort filtret papper disken med embryon.
4. Att rada upp ägg, göra det under dissekera omfattning. Använda fin pincett nr 5 eller ett fint pensel, välj grå till MÖRKLAGD-grå embryon och ordna i rad på torget i 3MM Whatman papper indränkt med vatten. Alla embryon måste vara i samma riktning, som injektion måste vara vid den bakre stolpen. Den främre änden av embryot är något bredare än den bakre. Torka filtret papper med embryon genom att trycka på torrt filterpapper till det (blöta saker kommer inte fastnar på band). För att överföra äggen, invertera bilden med den dubbelhäftande tejpen och tryck försiktigt mot ägg. Den bakre änden av äggen måste vara mycket nära kanten av dubbelhäftande tejp.
5. Uttorka embryona ca 1 min. vid rumstemperatur. De börjar grop något som de torkar.
6. Täck uttorkad embryon med Halocarbon olja för att förhindra ytterligare uttorkning.

Mikroinjektion av embryona

1. Den viktigaste aspekten av god injektion är kvaliteten på nålen (se material).
2. Fyll en nål med DNA-lösning som skall injiceras med hjälp av en microloader. Mycket lite injektionslösningen behövs: 1 till 2 ìl.
3. Anslut nålen till Transjector, som styr injektion tid (Manu) och tryck (600), och av mottrycket (250). Mikroinjektion utförs med ett mikroskop med en rörlig fas (Leica) vid x 10 förstoring och mikromanipulator. Vid behov kan en upphöjd mikroskop skede förbereda genom att stapla 4-5 objektglas. Placera locket glida bär embryon på upp scenen. Injicera embryon horisontellt för att förhindra att riva av endochorion, penetrationen bör ligga på den bakre stolpen. För injektion, håller jag nålen stationära och flytta skede av mikroskop.
4. Injicera 0,2-0,5 nl av lösning, vilket motsvarar cirka 1-5% av embryot volym. Styr injektionsvolym genom att justera insprutningstryck och tid. Den något böjd, uttorkad embryon bör återfå sin svulstiga injektion utseende följande.
5. Välj embryon från locket glida med fin pincett eller en fin pensel, och placera dem i en plastbägare med våta bomull och vått filtrerpapper. Täck bägaren med silkespapper. Håll på plats med ett gummiband runt kanten och återvända till insectary förutsättningar för 4 dagar.

Efter injektion

1. Fyra dagar efter du försiktigt placera embryo papper, embryo och ner på vattnet i stora plastlåda med en liten mängd mat. Embryon kläcks under en mycket lång period: Kasta inte ut den kultur tills minst 4-5 veckor efter injektion.

Anteckningar

DNA för injektion

Plasmid-DNA injektionsvätska var isolerad med EndoFree plasmiden kit. Konstruera och Helper plasmid blanda i rätt koncentration, fälls ut med izopropanol. Pelleten tvättades med 70% etanol innan resuspending i injektion buffert. Före injektionen rengör DNA med Millex-GV kolumn.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1x Injection solution	Buffer			5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Construct plasmid	DNA			0.5 mg/ml.
Helper plasmid	DNA			0.3 mg/ml
EndoFree Plasmid kit	Kit	Qiagen
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	To clean DNA.
Glass puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-87	Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100.Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50
Quartz puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-2000	Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
Injection glass needles				Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument).
Aedes aegypti	Animal			Male and female mosquitos, to obtain embryos.
Drosophila culture vial				For mosquito egg-laying.
Halocarbon oil	Reagent			Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1)
Forceps No5	Tool
Fine paintbrush		Kolinsky Sable	No. 0000
Whatman paper	Tool
Microloader	Tool	Eppendorf	5242 956.003
Transjector	Tool	Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		With moving stage and micromanipulator.
3MM Whatman paper
double sided tape