Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Стратегии по изучению Нейропротекция от холодной предварительной подготовки

Published: September 2, 2010 doi: 10.3791/2192
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurology, The University of Chicago Medical Center

Summary

Мы стремимся определить нейронных иммунной сигнализации ответственность за холодной предварительной подготовки в качестве средства определения новых целей для развития терапии для защиты мозга до травмы начала. Мы представляем стратегии для такой работы, которые требуют биологических систем, экспериментальных манипуляций плюс технические возможности, которые очень воспроизводимые и чувствительными.

Protocol

Стерильные и асептические методы имеют решающее значение для подготовки, поддержания и использования срез культуры в течение длительного периода. Кроме того, обоснованием для нашего использования срез культуры лишь после 18 дней в пробирке основана на доказательства, свидетельствующие о возбуждающих и тормозящих синаптической передачи становится наиболее зрелым, и глии (астроцитов и микроглии) становятся покоя и в соответствии с их коллегами в естественных условиях (рис. 1 ).

1. Подготовка и обеспечение гиппокампа культур фрагмент

  1. В тот же день культивирования равновесие стерильной вставки в 1,1 мл питательной среды, состоящей из 50 мл базальной среды Eagle, 25 Сбалансированная мл Эрла раствор соли, 23 мл лошадиной сыворотки, 0,5 мл Glutamax (200 мм акций), 0,1 мл гентамицина (10 мг / мл акций), 0,4 мл Fungizone (250 мкг / мл), 1,45 мл D-глюкозы (45%, 42 мм общая).
  2. Имейте также шесть лотков в инкубаторе при температуре 36 ° С, 5% углекислого газа и 95% влажности.
  3. Для максимальной стерильности, культивирования идеально сделано в HEPA фильтром положительные комнатной культуре давления с воздуха также очищенная с помощью автономных ультрафиолетовым светом воздуха чистки поклонников, и во время ношения чистый халат и стерильные перчатки, натянутой на рукавах халата .
  4. Подготовка срез культуры в BSL-1 ламинарного вытяжной шкаф, который включает все необходимые материалы (например, McIlwain ткани измельчитель, связанных вставками тефлон, бритвенные лезвия нарезки, рассечение холодная (3-4 ° С), пластины, хирургические инструменты, и рассечение чашки Петри) использование дикой природы (M8) стереомикроскопа.
  5. Разрешить охлаждения пластины (запускается из близлежащих водяной бане), чтобы достичь 3-4 ° С температуре не менее 30 мин и в то же время подвергая рассечение материалы к ультрафиолетовому свету, чтобы далее установить стерильность площадь вскрытия и инструменты.
    1. Ламинарном потоке периодически проверен на ультрафиолетовый свет имеет достаточные мощности на уровне с настольного коротковолнового света метр измерения ультрафиолета.
  6. Используйте крысят (P8-P9 и ~ 23 г / шт. Пометы от забито до 10 при рождении) под наркозом со 100% углекислого газа в коробочку животное на асептическую скамейке позади вытяжной шкаф и очищены путем погружения в 100%-ным этанолом в течение вытяжной шкаф, где все последующие шаги не выполняются.
  7. Обезглавьте щенков в одной половине 100 мм блюдо Петри и место головы во второй половине, используя свежие блюда на щенка.
  8. Рассеките из мозга и поместить его в нижней половине 60 мм чашки Петри, содержащие 10 мл стерильного холодного (3-4 ° С) сбалансированный солевой Гей это решение дополнить D-глюкозы до 6,5 мг / мл (т.е. 7,5 мл 45 % D-глюкозы на 500 мл бутылка Гей это.
  9. Рассеките из гиппокампа от каждого полушария и разместить их на диск тефлон для вертолета McIlwain. Распространение средства массовой информации от мозга ткани с помощью шпателя диафрагмы, чтобы предотвратить сокращение разделы мозга от присоединения к режущее лезвие.
  10. Раздел перпендикулярно гиппокампе, чтобы их длинные оси с использованием McIlwain измельчитель, с разделом толщины установлена ​​на уровне 350-400 мкм.
  11. Резко мыть свежесрезанных отрезает из тефлона и вставки в верхней части 60 мм чашки Петри содержащие холодной (3-4 ° С) сбалансированный солевой раствор Гей с 6,5 мг / мл D-глюкозы с помощью одно мл пипетки.
  12. Осмотрите ломтиками под стереомикроскопа для нетронутыми зубчатой ​​извилины и пирамидных слоев клеток.
  13. Аккуратно крупнейших ломтиками на вставку (по три на вставку и 12 ломтиков / щенка) и сохранить при нормальных условиях инкубации в инкубаторе чистить каждые шесть месяцев и калиброванный каждые три месяца с инфракрасного анализатора углекислого газа и термометр с точностью до одной десятой.
  14. Обновить питательной среды в культуре блюда каждые 3-4 дня в пробирке использованием BSL-2 капот и стерильной техники.
  15. Через 7 дней в пробирке, заменить средах с 1,1 мл сыворотки среде (SFM), состоящей из 97 мл Neurobasal, 2 мл B27, 0,5 мл Glutamax (200 мм), 0,1 мл аскорбиновой кислоты (0,5 М), и 0,68 мл Д- Глюкоза (45%, 42 мм общая).

2. Предварительно экране Жизненность фрагмент культур

  1. Алиготе Sytox Зеленая акция (10 мкл) и хранить при температуре -20 ° C.
  2. Развести Sytox акции до 500 нм рабочей концентрации в сыворотке крови, свободных средств массовой информации роста (т. е. 10 мкл в 100 СМИ мл). Магазин Sytox средств массовой информации при 4 ° С и использовать до одной недели.
  3. Место 1,1 мл Sytox на лунку в 6-и блюда культуры и теплой до 36 ° С на 5% углекислого газа в течение достаточного периода (то есть, о чем свидетельствует отсутствие конденсата на культуру посуда).
  4. В то же время позволяют ультрафиолетовой лампы (например, флуоресцентный источник света с FITC фильтра) питание через стабилизированный источник питания в целях обеспечения единообразного интенсивности света для нагревания до температуры не менее 20 мин.
  5. Место среза культур (18 деньс в пробирке) в Sytox-медиа в течение 10 мин, а затем обратно SFM на экран для необратимых СА1 пирамидальной травмы слоя.
  6. Посмотреть культур на асептическую поверхность инвертированный микроскоп, рассматривается в соответствии с 5-кратным увеличением.
  7. Примите культур с менее чем 30 Sytox положительных клеток в области СА1.

3. Холодный Предобусловливание

  1. Место 1,1 мл УЛП в 6-и блюда культуры. Разрешить охлаждением средств массовой информации (например, 30 ° С), чтобы уравновесить в инкубаторе (5% углекислого газа и 95% влажности), по крайней мере 20 минут перед использованием. Отсутствие конденсата на культуру блюда показывает, что достаточное время для уравновешивания произошло.
  2. Передача вставками срез культуры охлаждением СМИ (1,1 мл / лунку) лоток хранится при температуре 30 ° С и выдержать в течение 90 мин с использованием стерильной техники в BSL-2 вытяжной шкаф.
  3. Место среза культуры обратно в нормальное SFM при нормальных условиях инкубации в течение 24 часов, опять же с использованием стерильной техники через BSL-2 вытяжной шкаф.

4. Excitotoxic травмы

  1. Начните срез культуры экспериментальных prescreen использовать, выставляя на Sytox средств массовой информации в течение 20 мин.
    1. Приобретать отдельные изображения среза с кусочками поддерживается ориентация аналогична использованной для prescreen (фоновые изображения). Это делается путем размещения знака на левой и два знака вправо с маркером на "10" и "два" часа на каждую вставку. Этот маневр облегчает используя ту же сферу интересов форму для каждого языка и набор изображений.
  2. В то же время, включите источник ультрафиолетового лампы (по регулируемым питания), и ПЗС-камерой в течение минимум 20 минут, чтобы они теплой температуре.
  3. Затем, калибровки ПЗС-камеры со стандартным fluoroscein.
    1. "Очистить" CCD, выставляя на свет на 50 циклов, если автоматически калибровки ПЗС-камера используется. Мы создали программу в течение Метаморф, чтобы очистить наши Прохладный камеры оснастку для количественного травмы.
    2. Место 10 мкл fluoroscein в 90 мл PBS (10 мМ фосфатного буфера, 150 мМ NaCl в 7,3 рН) и вихрь.
    3. Внесите 10 мкл смеси fluoroscein на 100 мкм глубокие hemacytometer.
    4. Отрегулируйте полную интенсивность изображения на 1000/4096.
  4. Сбор фоновых изображений срезов культур проверить, что холодно-предварительной подготовки не привести к травмам (то есть, отказаться от культур с ≥ 250 СА1 области интересов интенсивности).
  5. Подготовка лотков со средствами массовой информации NMDA.
    1. Подготовка 10 мМ исходный раствор NMDA по крайней мере раз в неделю.
    2. Для excitotoxic травмы, развести NMDA к 20 50 мкМ в УЛП, и равновесие в нормальных условиях инкубации в течение не менее 20 мин.
  6. Использование BSL-2 капот и стерильных, место вставки в NMDA-СМИ в течение 60 минут при нормальных условиях инкубации.
  7. Промыть NMDA-офф вставки путем погружения каждой вставки в три раза в трех отдельных 60 мм блюда каждый из которых содержит 10 мл Neurobasal нагревают до 36 ° C. Не используйте более трех вставок для каждого набора из трех блюд 60 мм стирки.
  8. Вернуться культур на нормальные условия инкубации.
  9. Сбор травмы изображения 24 часов после воздействия на NMDA.
    1. Калибровка камеры с fluoroscein стандартные, как описано выше.
    2. Место культуры в средствах массовой информации Sytox течение 20 мин.
  10. Количественного Травмы:
    1. Использование программного обеспечения Метаморф, рисовать AOI вокруг СА1 регионе.
    2. Мера интенсивности выбранной области для "травмы".
    3. Копирование и вставка AOI от "травм" на "фоне" изображение.
    4. Введите значения от "вреда" и "фона" в Excel.
    5. Количественной "числитель-фон» для контроля и холодной обусловлена ​​культур.
    6. Использование статистического программного обеспечения (например, SigmaStat), запустите соответствующих статистических тестов, чтобы сравнить травмы экспериментальной группы (групп) по сравнению с контрольной группой, которая всегда должна быть включена в каждой экспериментальной перспективе.
    7. Примечание: Если травма низком уровне в однодневных после травмы изображений, вынос эксперимент на два три дня. Защита в культурах может быть замаскирован в связи с отсутствием восприимчивости к травмам (рис. 2).
    8. Примечание: вопрос о «защите» побудило нас перейти к измерению уровня травмы, а не отношения для всех сравнений (рис. 3).

5. Сотрудничество обработки, которые применяются с холодной предварительной подготовки

Важным преимуществом срез культуры является то, что состояние окружающей средыа можно точно контролировать. Это означает, что цитокин сигнализации от холодной предварительной подготовки может быть измерена, передразнил и модулированных вскрыть важнейшие аспекты узла.

  1. Рекомбинантные (например, агонисты) белков и нейтрализации (например, антител или растворимых рецепторов) белки могут быть использованы для имитации и модулировать, соответственно, цитокинов сигнализации.
  2. В целом, эти белки воссоздана и хранится в виде аликвот при температуре -20 ° C для использования в течение шести месяцев, чтобы обеспечить адекватную биологическую активность.
  3. Здесь мы описываем образцовое использование ФНО-α сигнализации отмены использованием растворимого рецептора ФНО 1 (sTNFR1).
    1. Развести sTNFR1 в 0,1% бычьего сывороточного альбумина в ФБС в запас 50 мкг / мл, аликвоту в 20-50 мкл количествах, и хранить при температуре -20 ° C.
    2. Для использования, развести sTNFR1 до 200 нг / мл ломтик СМИ культур роста нагревают до 36 ° С и место среза культур в sTNFR1-СМИ в течение 20 мин до начала холодной предварительной подготовки.
      1. Примечание: Для уменьшения дисперсии, то лучше разбавить 200 нг / мл sTNFR1 в большом объеме питательной среды (например, 1:250 разбавления от 50 мкг / мл sTNFR1 акции в 10 мл питательной среды требует 40 мкл sTNFR1) по сравнению с добавив sTNFR1 непосредственно в каждую лунку в блюдо (4,4 мкл на 1,1 мл среды).
    3. Развести sTNFR1 до 200 нг / мл в средствах массовой информации и разместить 1,1 мл в каждом вставить хорошо. Разрешить средств массовой информации, чтобы уравновесить до 30 ° С в течение по крайней мере 20 минут, прежде чем подвергать срез культур холодного предварительной подготовки в течение 90 мин, как описано выше.
    4. Место среза культур назад на 36 ° C с sTNFR1 присутствует в средствах массовой информации.
    5. 24 часов спустя, подвергать культур Sytox средств массовой информации в течение 20 мин, как описано выше и собирать фоновые изображения, чтобы убедиться, что холодно-предварительной подготовки не травмировать культур.
  4. Количественного данных, как описано выше.
  5. Обновить СМИ с компонентами каждые 3-4 дня в пробирке.

6. Немедленного и отсроченного Excitotoxic травмы после холодной предварительной подготовки

  1. Немедленное травмы с холодной предварительной подготовки.
    1. Выполните холодной предварительной подготовки, как описано выше.
      1. После холодной предварительной подготовки, вернуться к нормальной культур инкубации в течение 20 мин.
      2. Затем, выставить культур до 20-50 мкмоль NMDA травмы в течение одного часа.
      3. Промыть культур в три раза, как описано выше и вернуться к нормальной инкубации.
      4. После 24 часов, приобретать травмы фотографии, как описано выше.
  2. Отсроченные последствия воздействия холодной предварительной подготовки.
    1. Выполните холодной предварительной подготовки, как описано выше.
    2. Expose культур NMDA травмы через 24 часа, как описано выше.
    3. Продолжать приобретать травмы изображения на срок до трех дней после первого холодного предварительной подготовки для контроля защиты.

7. РНК Изоляция

Следующие процедуры экспрессии генов масштабируются для отдельного языка и срез.

  1. Передача срез культуры от питательной среды и нормальной инкубации до 3 мл RNAlater в 6-и блюда культуры для стабилизации РНК. Хранить при температуре 4 ° С на срок до трех дней, пока обрабатывается так, как описано ниже.
  2. Аккуратно поднимите срез культуры от вставка с тонкой кистью наконечник и место в 1 мл холодного (4 ° С) PBS в 1,5 мл (ДНКазы, РНКазы, и ДНК свободными) микроцентрифужных трубки.
  3. Центрифуга образцов в течение 30 сек и удалить супернатант PBS.
  4. Магазин образцы при -80 ° C.
  5. Для выделения РНК из срез культуры (~ 250 нг / шт.), Оттепель образцы на льду.
  6. Изолировать РНК с использованием комплекта Qiagen MicroRNeasy через следующие процедуры, которые описаны более подробно и адаптировано из RNeasy Micro справочник (Qiagen).
    1. Место 350 мкл буфера RLT (содержащей 10 мкл β-меркаптоэтанол на мл) в каждый микроцентрифужных трубки, содержащей один срез культуры.
    2. Однородный образцов вортексе в течение 30 сек. Измельченного в порошок ткани, если это необходимо (например, ткани гранул еще видны), используя одноразовые пестиком до полного гомогенизировали в буфер RLT.
    3. Место 350 мкл 70% этанола в смеси и лизат пипетки перемешать.
    4. Передача гомогената в колонке спина и поместить в пробирку (обе колонки спина и пробирки предоставляются Qiagen).
    5. Центрифуга образца в течение 15 сек при максимальной скорости. Сохраните колонке.
    6. Вымойте спин колонки путем добавления 350 мкл буфера RW1 плюс центрифуге в течение 15 сек при максимальной скорости. Отменить буфера.
    7. Развести 10 мкл ДНКазы я складе в 70 мкл буфера RDD уступить 80 мкл общего объема. Внесите осторожно, чтобы не смешивать вихря. Подготовка 80 мкл разбавленного фондовом ДНКазы на образец. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 мин.
    8. Добавить 350 мкл буфера RW1 попробовать колонке спина и центрифуги в течение 15 сек. Отменить сбор трубки.
    9. Использование новой трубки сбора, добавить 500 мкл буфера для ППД образца и центрифуги в течение 15 сек и отбросить буфера.
    10. Место 500 мкл 80% этанола на пробы и центрифуги в течение 2 мин. Отменить сбор трубки.
    11. Сухое спина столбцов путем центрифугирования в течение 5 минут на максимальной скорости с трубкой колпачки открыты, отбросить коллекцию трубок, и передачи спин колонки 1,5 мл пробирки поставляется комплект.
    12. Для сбора изолированной РНК, место 14 мкл РНКазы воды, свободной от центра мембраны колонке спина. Центрифуга для одного мин и собрать жидкость.
    13. Добавьте 2 мкл RNasin (разбавленной на 1 ед / мкл в буфере TE) и хранят при температуре -80 ° C. ТЕ-буфера состоит из 10 мМ Трис (трис [гидроксиметил] аминометан), 1 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль гидрата) на уровне 8,0 рН.

8. РНК количественного

  1. Примечание: RNasin не мешает анализа RiboGreen.
  2. Развести RiboGreen 1:200 в РНКазы без буфера TE следующим образом.
    1. TE (мл): 1; Ribogreen (мкл): 5;
    2. TE (мл): 4; Ribogreen (мкл): 20;
    3. TE (мл): 6; Ribogreen (мкл): 30.
  3. РНК стандарты готовят следующим образом.
    1. Дрожжи тРНК используется как РНК стандарта. тРНК сохраняется (-20 ° C) до 1 мг / мл в ТЕ буфере.
    2. Развести 1 мг / мл фондовом 1:100 в ТЕ-буфера, используя (ДНКазы, РНКазы, и ДНК свободными) 1,5 мл микроцентрифужных труб для производства 1 мкг / мл рабочего эталона.
    3. Подготовка стандартной кривой непосредственно в 96-и флуоресцентные пластины анализа путем добавления буфера TE растворителем, а затем добавить соответствующую сумму 1 мкг / мл стандарта в буфере TE уже в тарелке скважины, как показано на соседним столом. Сделать дубликат скважин для каждого стандарта следующим образом.
      1. Том ЗППП. (Мкл): 100; Vol. ТЕ (мкл): 0; РНК в колодец (нг): 100;
      2. Том ЗППП. (Мкл): 80; Vol. ТЕ (мкл): 20; РНК в хорошо (нг): 80;
      3. Том ЗППП. (Мкл): 60; Vol. ТЕ (мкл): 40; РНК в хорошо (нг): 60;
      4. Том ЗППП. (Мкл): 40; Vol. ТЕ (мкл): 60; РНК в хорошо (нг): 40;
      5. Том ЗППП. (Мкл): 20; Vol. ТЕ (мкл): 80; РНК в колодец (нг): 20;
      6. Том ЗППП. (Мкл): 0; Vol. ТЕ (мкл): 0; РНК в хорошо (нг): 0.
  4. Анализа готовят следующим образом.
    1. Добавить 99 мкл ТЕ-буфера для каждого образца скважин 96 ячейках. Наиболее эффективный способ сделать это состоит в использовании многоканальных дозаторов.
    2. Добавить 1 мкл РНК экспериментальных скважин образца.
    3. Добавить 100 мкл разбавленного RiboGreen в каждую лунку использовании многоканальных дозаторов и растирают с одним или двумя ударами пипетки.
    4. Прочитано пластину на флуоресцентных планшет-ридере при 480 нм и возбуждение 520 нм излучения.
    5. Построить стандартную кривую с использованием Microsoft Excel с измеренной интенсивности флуоресценции РНК стандартам.
    6. Рассчитать РНК концентрации в пробах использованием результате линейное уравнение с кривой стандартам.

9. SYBR Green Количественный ПЦР

  1. ПЦР процедуры лучше всего делать в чистой зоне защищены специально для работы с РНК (рис. 4).
    1. Обеззараживания территории и связанных лабораторного оборудования от возможных загрязнений ДНК и РНКазы деятельности до использования в ультрафиолетовом свете, 10% отбеливателя или РНКазы Away.
    2. Надевайте перчатки во всех процедурах.
    3. Используйте РНКазы свободной воды для всех процедур, предусмотренных в состав набора. Не используйте DEPC-(diethylpyrocarbonate) очищенной воды.
    4. Закрыть все ПЦР связанных трубы сразу же после использования для замедления аэрозольного загрязнения чужеродной ДНК.
  2. Разработка и характеризуют праймеров для целевой мРНК (ы), представляющих интерес. Эти методы подробно описаны в дополнительном Методы Халс и соавт., Журнал Neuroscience, 2008 13.
  3. кДНК получают из 30-200 нг тотальной РНК с помощью обратной транскрипции использованием iScript.
    1. Выбор начиная РНК величина определяется общее количество РНК доступны с целью проведения ПЦР-анализа на части образца (то есть, 10% -20% от общего числа).
    2. Остальные большая часть РНК сохраняется для последующего анализа.
    3. Комплект iScript использует смесь случайных гексамеров и олиго-дТ грунтовки, и изменение MMLV обратной транскриптазы в общем объеме 20 мкл.
    4. Обратная транскрипция выручки за 25 ° С в течение 30 мин, а затем на 42 ° C в течение 50 минут, и обратной транскриптазы, впоследствии денатурированного при 85 ° С в течение 5 мин.
    5. Развести кДНК в буфере TE к конечной концентрации 0,4 нг / мкл по сравнению с РНК, начиная количестве.
  4. SYBR Green ПЦР стратегия используется для усиления кДНК.
    1. ПЦР-реакции контролируется в режиме реального времени, отслеживая SYBR Green регистрации.
    2. 50 мкл реакции, содержат 3 мМ MgCl 2, 200 мкМ дНТФ, 15 пмоль каждого из прямого и обратного праймеров, 1 мкМ флуоресцеина, 1x SYBR зеленый краситель, 10 мкл (4 нг) срез культуры кДНК и 1,25 U Платиновый Taq полимеразы в реакции буфера, состоящего из 50 мМ KCl и 10 мМ Трис, рН 8,3.
    3. ПЦР проводится с использованием амплификаторе iCycler, которые могут собирать данные в реальном времени.
    4. Велоспорт параметры состоят из 15 сек денатурация (95 ° С), затем 30 сек отжига / продление (60 ° С) повторяется 45 раз.
    5. Оптические измерения проводятся во время отжига / продление шаг и Ct значения были определены с помощью программного обеспечения iCycler системы.
    6. кДНК цитокинов цели интересов и β-актина используются для построения стандартных кривых.
      1. Скопировать номер определяется молекулярная масса и масса плазмиды кДНК.
      2. Стандартные кривые числа копий / масс построены и включены в каждом анализе.
      3. Ct значения для каждой кДНК разведении используются для определения числа копий против Ct кривой.
    7. Цитокинов и β-актина уровней число копий определяется для образцов с использованием стандартных кривых.

10. Количественный ПЦР для Microarrays

Количественные в режиме реального времени КПЦР массив скрининг высокой чувствительностью и воспроизводимых средств для исследования с низким уровнем воспалительных изменений выражение посредника.

  1. RT2 Profiler ПЦР массив из SABiosciences используется для воспалительные изменения гена посредника выражения, выполните следующие действия описаны более подробно производителем.
  2. Анализ использует 0,1-1,0 мкг РНК. Мы используем местах среза (например, CA1, который обеспечивает ~ 250 нг тотальной РНК из двух объединенных пробах) или целые одного ломтика, которые содержат такое же количество от общего числа РНК.
  3. Выборка и контроль РНК обратной транскрипции с использованием кДНК аптечку первой нити (например, # C-03).
    1. Полученные кДНК смешивается с SYBR Green ПЦР на основе смеси (# PA-011) и 25 мкл aliquotted в каждую из 96 лунок пластины ПЦР массив (измерение 84 уникальных экспериментальных генов и 16 генов домашнего хозяйства).
    2. Один массив пластина готова для экспериментального образца и вторая пластинка готовится к контролю.
    3. Примечание: мастер SYBR Green смесь предоставляемые производителем термоциклер от конкретных условий.
  4. Термоциклировании делается с помощью iCycler с 40 цикла протокол, состоящий из денатурации шагом 15 секунд при температуре 95 ° С с последующим расширением шаг одного мин при 60 ° C. Оптические данные, собранные в ходе расширения шаг. Термоциклировании следуют расплава анализа кривой сканирования 55-95 ° С температура в 0,5 ° C шагом.
  5. Относительной экспрессии генов в обработанных и контрольных пластин определялась с помощью 2 - ΔΔCt метод с использованием Excel при условии, программного обеспечения и выражается как кратное увеличение или уменьшение по сравнению с контролем.
  6. Гены с два раза увеличивается или уменьшается в выражении считаются для дальнейшей оценки.
  7. Гены выявленных в результате ПЦР массив скрининга (например, с помощью # Пярн-011A для холодной предварительной подготовки) далее confirmeD Использование КПЦР.
    1. ПЦР массивов определить, какие гены регулируются в ответ на раздражители.
    2. В примере с холодной предварительной подготовки, мы определили Ил-11 гена как положительно регулируется в ответ на холод, предварительной подготовки.
    3. Следующий шаг в анализе, чтобы подтвердить, что вновь выявленных генов регулируется в срез культуры использованием КПЦР анализа описано выше.

11. Мультиплексный Микросфера проточной цитометрии протеомных Пробирной

  1. Expose срез культур холодного предварительной подготовки, как описано выше.
  2. Урожай срез культуры для общего анализа белка.
    1. Аккуратно поднимите отрезает вставки диска с помощью тонкой кистью и место в 1 мл холодного (4 ° С) PBS.
    2. Пробирки центрифужные и удалить PBS с ломтиком культур. Место на сухой лед, пока уборка закончена.
    3. Магазин трубы при температуре -80 ° C.
  3. Однородный образцы срез культуры для проведения общего анализа белка.
    1. Подготовка буфера для лизиса клеток гомогенизации.
      1. Следуя инструкциям производителя (Bio-Rad), добавить ингибиторы протеазы до 5 мл лизирующего буфера и отложите на льду.
    2. Разместить 100 мкл лизирующего буфера на срез культуры и агитировать ломтики с помощью пипетки вверх и вниз в пять раз с 100 мкл кончиком пипетки разрезать до 1 мм.
    3. Встряхните образцов на планшетном шейкере при температуре 4 ° С в течение 20 мин.
    4. Центрифуга образцов при 13 000 оборотов в минуту в течение 15 мин при 4 ° C.
    5. Передача супернатант в чистую пробирку и отложите на льду.
  4. Выполните общий анализ белка.
    1. Подготовка BSA (бычий сывороточный альбумин) белка стандартам.
      1. Развести фондовом БСА с сверхчистой воды в соответствии с инструкциями производителя.
      2. Подготовка белка стандартам начиная 0-1000 мкг / мл, разводят в буфере для лизиса.
    2. Рассчитайте объем рабочего раствора необходимо в соответствии с комплектом инструкций.
      1. Например, (восемь стандартов + 18 неизвестных образцов) х (двух повторяет) х (200 мкл рабочего раствора требуется на один образец) = 10,4 мл общего объема рабочего реагента, необходимые для загрузки на 96 лунками (например, микросфер проточной цитометрии анализа , см. ниже).
      2. При смешивании реагента с реагентом В некоторые мутность может произойти, но должны исчезнуть в ближайшее время.
    3. Нагрузка 10 мкл стандартов и образцов на микропланшетов.
    4. Нагрузка 0,2 мл рабочего реагента в скважины.
    5. Обложка планшет с уплотнительной ленты и пожать на тарелку шейкере в течение 30 сек.
    6. Инкубируйте планшет при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
    7. Прохладный микропланшет до комнатной температуры (около 10 мин), прежде чем читать дальше ридер при 595 нм.
    8. Построить стандартную кривую с использованием Microsoft Excel с измеренными абсорбции стандартов BSA.
    9. Рассчитать белка концентрации в пробах использованием результате линейное уравнение с кривой стандартам.
      1. Развести всех образцов до самых низких концентраций измеряемых с буфером лизиса и хранить при температуре -80 ° C.
  5. Выполните одно-сложных и тканей мультиплекс цитокинов (или жидкости), анализы, как указано во всех деталях в ссылках № 12 и 16.

12. Иммуногистохимия

  1. Fix культур в течение 24 часов с фиксатором ПЛП, состоящий из 10 мл 16% параформальдегида, 1,096 г лизина, 0,42 г фосфата натрия и 0,17 г натрия периодатом, заправляемого в общем объеме 80 мл с особо чистой воды (фиксатора составляет 6,2 рН).
    1. Мы считаем, что ПЛП фиксатором является нежным фиксатором, который позволяет обнаружения низкого уровня иммунной, которые иначе не были бы очевидны, используя другие фиксаторы.
    2. Культуры фиксированной в течение 24 часов, а затем перевели с тонкой кисточкой для PBS, содержащие азид натрия (100 мг / л).
  2. Яркий иммуноокрашивания области плавающей целые культуры срез осуществляется следующим образом со всеми шаги связаны с встряхивании при ~ 50 оборотов в минуту.
    1. Промыть срез культуры в 3 мл PBS три раза в течение 10 мин.
    2. Quench срез культур в 0,3% H 2 O 2.
      1. Развести 30% H 2 O 2 маточного раствора в PBS.
    3. Промыть срез культуры в PBS в три раза, 10 минут каждый.
    4. Блок срез культуры в течение одного часа при комнатной температуре в 3 мл блокирование решения в шесть-луночного планшета, состоящий из 10 мл сыворотки козьего, 0,75 мл тритона Х-100 и 89,25 мл PBS.
      1. Сыворотка для блокировки решения должны исходить от того же вида, в которых вторичные антитела, был поднят.
    5. Инкубируйте срез культуры на ночь в первичных антител разбавленный в блокировании решения при 4 ° C.
      1. Максимальный объем первичных антител решение для малого стекла Pyrex блюдо скважин должна быть 0,3 мл больших объемах, как правило, работать над краем пластины.
      2. Место блюдо в увлажненной закрытом контейнере. Мы не покрываем блюдо с приверженцем фильм с разделами может вращаться на вышележащие фильм и потерял для дальнейшей проработки.
      3. Отрегулируйте скорость встряхивания пластины шейкер для достаточно высок, чтобы циркулировать ломтики в раствор антител.
    6. Удалите ломтики из стеклянной пластины и мыть в ФБС три раза в течение 10 минут на мытье.
    7. Инкубируйте ломтики в вторичными антителами при комнатной температуре в течение одного часа при встряхивании.
      1. Используйте маленькие стекла Pyrex блюда для загрузки 0,3 мл вторичного решение антител.
    8. Вымойте три раза PBS, 10 мин на помыться.
    9. Визуализируйте окрашивания 3'-диаминобензидина (DAB).
      1. Растворите 30 мг DAB в 3 мл диметилсульфоксида.
      2. Фильтры DAB с помощью двух # 1 фильтровальной бумаги и вымыть с 54 мл PBS.
      3. Непосредственно перед употреблением, добавить 20 мкл 30% H 2 O 2.
      4. Инкубируйте культур в DAB решение в течение 5-7 мин при комнатной температуре.
      5. Примечание: DAB является канцерогеном и должны быть утилизированы должным образом. Утилизация всех DAB решения в отмеченный контейнер храниться в вытяжном шкафу, и поставить все блюда в раствор отбеливателя для отключения DAB. Все DAB решения должны быть отброшены в конечном счете через институциональные Управления безопасности.
    10. Промыть срез культуры в PBS три раза в течение 10 минут каждый.
    11. Влажная часть горы культур желатина (или силан) покрытием слайды с 100 мкл мыльница, растворенного в дистиллированной воде. Сухой ночь при комнатной температуре.
      1. Избегайте использования слайд обогреватели избыточного тепла может привести к растрескиванию в культурах крепится к слайдам.
    12. Дегидрировать скользит через серию градуированных этанола (50, 75, 95, 95, 100, 100%) в течение 30 секунд каждый.
    13. Очистить слайды с ксилолом в четыре раза за десять минут каждый.
    14. Использование стеклянной пипетки Пастера место 0,1 мл монтажа сверху на слайд и мягко покровное, чтобы избежать формирования пузырьков воздуха. Сухой ночь при комнатной температуре.
  3. Флуоресцентные иммунной окраски.
    1. Раздел срез культур до 20 мкм использованием криостата.
      1. Отрегулируйте настройки криостате до -16 ° С для внутренней температуры, до -12 ° С для температуры объекта.
      2. Нанесите небольшое количество воды на металлических патрон помощью пипетки Пастера и заморозить на сухом льду.
      3. Нанесите тонкий слой диска ткани-Tek СМИ в верхней части замороженных патрон.
      4. Разрешить патрон для замораживания и равновесие изменением температуры в камере криостата.
      5. Раздел ткани-Tek СМИ, чтобы создать плоский поверхность, подходящую для укладки срез культуры квартире.
      6. Обратите внимание на ориентацию в то время как патрон секционирования это обеспечивает последовательную угол для секционирования, которые будут препятствовать установке СМИ от падения патрон.
      7. Когда замороженные, возьмите патрон, и место в держатель. Использование шпатель металла и тонкой кончик кисти, слайд один срез культуры на шпатель и передачи ксередине плоский слой ткани-Tek СМИ на патрона.
      8. Место тонкий слой ткани-Tek СМИ в связи установлены культуры нарезать и заморозить на камеру температуре не менее 10 мин.
      9. С "отделку" кнопка активации раздела верхние слои ткани-Tek СМИ, пока срез культуры видна.
      10. Переключение с "отделкой" на "раздел", устанавливаемый при 20 мкм.
      11. Пресс-подборщики 20 мкм разделы с желатином покрытием слайды, которые при комнатной температуре и сухом слайды в одночасье.
      12. Ткань-Tek СМИ будут видны на слайдах, но растворяется в моет PBS.
    2. Иммуноокрашивание.
      1. Вымойте слайдов в PBS три раза в течение 10 минут каждый.
      2. Quench в 0,3% H 2 O 2 в течение 15 мин при комнатной температуре, встряхивая.
      3. Вымойте слайдов в PBS три раза в течение 10 минут каждый.
      4. Использование SFX сигнала усилителя, нанесите несколько капель компонентов непосредственно на разделы по слайду и инкубировать 30 минут при комнатной температуре во влажной камере.
        • Инкубация с Компонент заменяет блокировки шаг с 10% сыворотки козьего решения выполнены в ярких иммуногистохимии области.
      5. Инкубируйте слайдов в первичных антител разводят в 0,75% Тритон Х-100 в PBS в течение двух часов при температуре 37 ° C.
        • Применить первичной решение антител непосредственно к верхней части горки и инкубировать во влажной камере, чтобы предотвратить испарение.
        • Не включайте в сыворотке в любом из антител решения использовать только PBS и тритона Х-100.
      6. Вымойте слайдов в PBS три раза в течение 10 минут каждый.
      7. Инкубируйте в вторичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре и защищать слайды из света.
        • Центрифуга все флуоресцентные вторичными антителами в течение 20 минут, чтобы предотвратить любые агрегаты от попадания в раствор антител.
        • Подготовка антител разведения использованием 0,75% Тритон Х-100 в PBS.
      8. Вымойте слайдов в PBS три раза в течение 10 минут каждый.
      9. Dip слайды один раз в дистиллированной воде, чтобы смыть соль с PBS.
      10. Сухой слайды ночь при комнатной температуре, покрытый от света месте.
      11. Покровное слайды с Продли Antifade СМИ.
        • Оттепель компонентов в микроволновой печи в течение 5-10 сек и добавить примерно 1 мл на флакон Компонент B. Смешать с помощью пипетки Pastuer, соблюдая осторожность, чтобы не вводить пузырьков воздуха в раствор.
        • Центрифуга в течение 5 минут на максимальной скорости, чтобы удалить пузырьки.
        • Нанесите тонкий слой Продли СМИ к началу слайд с помощью пипетки Pastuer, осторожны, чтобы избежать создания каких-либо воздушных пузырьков.
        • Аккуратно покровным стеклом в верхней части слайда и сохнуть быстро, покрытый от света месте.
      12. Дважды этикетки флуоресцентные Иммуноокрашивание (рис. 5).
        1. Выполните флуоресцентные Иммуноокрашивание, как описано выше, за исключением разбавления первичных антител в том же растворе инкубации.
        2. Развести все вторичные антитела, в том же растворе, а затем инкубируют, как описано выше.
        3. Последовательный инкубационным периодом с использованием двух антител привело к снижению иммунной окраски.

13. Представитель Результаты

Рисунок 1
Рисунок 1. Появление гиппокампа культур нарезать и микроглии. Левое изображение стороны показан типичный зрелых (то есть, 21 день в пробирке) гиппокампа культуры ломтик пятно Neun (зеленый), чтобы проиллюстрировать cytoarchitecture основных нейронов. Пирамидных нейронов показаны в районах СА1 и СА3 и вмятинаел извилины (ГД) нейронов в левую сторону. Шкала бар составляет 250 мкм. Правой стороны изображение получено из области СА1 и показано на высшие силы, чтобы проиллюстрировать разветвленной качество покоя микроглии в зрелых культурах срез. Клетки были отмечены микроглии маркером поверхности, CD11b. Шкала бар 50 мкм.

Рисунок 2
Рисунок 2. Холодный предварительной нейропротекции в гиппокампе культур срез. Культуры инкубировали с Sytox зеленый, флуоресцентный отмечен маркером мертвые клетки. Верхняя строка показывает культуры фиктивный контроль и нижнем ряду показывает ломтиками подвергается до 28 ° С в течение 90 мин. Левая рука, предварительно просматривать изображения показывают не СА1 травмы. Относительная травмы калибровки цвета масштабе показан в левом верхнем изображении. Ближний ряд изображений показывают относительную травмы культуры ломтик 24 часов после воздействия 20 мкМ NMDA. Обратите внимание, что фиктивный контроль травм больше, чем у культур подвергается холодной предварительной подготовки (CP). Традиционно, культуры, затем подвергается 20 мкМ NMDA ночь, чтобы максимизировать CA1 нейронов уровня травмы и относительной травмы К.П. против обман, отметил как отношение травмы / максимальный ущерб. Однако воздействие максимального стимулы травма может оказаться недостаточно для преодоления нейропротекции от предварительной подготовки. Соответственно, использование отношения травмы / максимальная травма может не совсем точно отражают нейропротекции от предварительной подготовки. Это очевидно в правое изображения стороны, которые показывают, CP максимальный уровни меньше, чем у контроля обман.

Рисунок 3
Рисунок 3. Схема иллюстрирует полезность использования начального, первые измерения день для количественного травмы уровней в холодной предварительной подготовки экспериментов. Как отмечалось выше, мы обнаружили, что использование соотношения (травмы / максимальная травмы) может неясным нейропротекции от холодной предварительной подготовки. Это видно из схемы налево, где притворство травмы отображается красным цветом, и что после холодной предобусловливания в синий цвет. На следующий день после NMDA воздействия холодной предварительной показывает относительную "3" уровня травмы против мнимого ("5") контроля, в соответствии с 40% нейропротекции. Однако, если традиционный формат с помощью соотношения (например, травмы / максимальное повреждение) используется, никакой защиты Очевидно, [то есть, (5 / 10) = 50% для мнимого v. (3 / 6) = 50% для холодного предварительной подготовки ].

Рисунок 4
Рисунок 4. Typial результате КПЦР показаны. Верхняя кривая числа копий РНК против порог цикла для ПЦР-амплификации показывает управления (синий) и экспериментальные образцы (красный). Нижняя изображения приведены типичные профили усиления для четырех образцов (черный, зеленый, желтый и фиолетовый). Обратите внимание на последний порог Ct циклов (отмечены линии оранжевый) происходят на 26,0, 29,5, 31,0 и 32,5.

Рисунок 5
Рисунок 5. Дважды этикетке иммуноокрашивания используется для подтверждения КПЦР и результаты КПЦР массив срез культуры были обработаны для ИЛ-11 (красный) и Neun (зеленый, чтобы отметить нейронов). Прощупать для сотовых локусов экспрессии ИЛ-11. Обратите внимание, что некоторые пирамидных нейронов (стрелки) показывают, Ил-11 и Neun окрашивания (желтый), а несколько небольших ячеек (стрелки), предполагается, что астроциты, показывать только увеличилась Ил-11 окрашивания (красный).

Discussion

Два принципиально важных понятий важно разграничение цитокинов сигнальной системы, участвующих в холодной предварительной нейропротекции показаны на рисунках 6 и 7. Во-первых, цитокины являются чрезвычайно низкой концентрации сигнальных молекул в нормальном мозге. Тем не менее, физиологические изменения концентрации цитокинов имеют огромный потенциал для изменения структуры и функционирования мозга (т.е. фенотип) из-за их способности изменять экспрессию генов (рис. 6). Кроме того, цитокины являются высоко избыточные и плейотропных в том, что несколько цитокинов может иметь аналогичные последствия и один цитокин может иметь переменную эффектов (рис. 7). Таким образом, чтобы точно установить врожденную цитокин-основания для нейропротекции от холодной предварительной подготовки (или другие физиологические предварительной стимулы), композитный анализ связанных сигнализации переменные должны быть определены. Это достигается с помощью мультиплексной стратегии анализа. Это позволит создать цитокинов "подписи" холодной предварительной нейропротекции.

Рисунок 6
Рисунок 6. Сила мозга сигнализации цитокинов. Иллюстрации передать огромную сигнализации силу физиологических концентрациях мозга цитокинов по сравнению с концентрациями других широко признанных коллег. Концентрация представлена ​​как обратная расстоянию, начиная с одного усов кошка в качестве точки отсчета. Натрий (10 -1 М иллюстрируется зерна перца) и калия (10 -3 М иллюстрируется помидор) присутствуют в интерстициальном пространстве мозга на уровнях около 150 и 3 мм соответственно, и имеют четко признана роль в нейронные ячейки электрофизиологические функции. Кроме того, рН (т. е. ~ 10 -7 М уровни ионов водорода и проиллюстрировал, как 780 метров вдоль прибрежной полосы озера Чикаго) и кальция (т. е. ~ 10 -8 М уровни показаны как 7,8 км видно из спутниковых изображений Google вдоль прибрежной полосы озера Чикаго из Маккормик Место для Промонтори Пойнт в Гайд-парке возле университета Чикаго). Кроме того, нейротрансмиттеров выпущен к интерстициальным пространством над этим концентрациях влияют на деятельность местных область мозга. В отличие от этого, цитокины (показано расстояние от Земли до Марса) может изменить функцию мозга в концентрации более чем в десять миллионов раз меньше.

Рисунок 7
Рисунок 7. Интерактивная сигнализации врожденного пути цитокинов. Цитокины являются высоко избыточные и плейотропных в том, что несколько цитокинов может иметь аналогичные последствия и один цитокин может иметь переменную эффектов. Такое разнообразие связано с комплексом интерактивных понять, что происходит на уровне лигандов, рецепторов, а фосфопротеины. Дальнейшая сложность связана с тем, что мозг состоит из различных типов клеток, причем каждая клетка способна конкретных врожденной цитокинов, рецепторов, а также изменения, связанные с фосфопротеин. Для наглядности приводим здесь только врожденные цитокинов сигнальных путей (на основе исследований иммунной клетки) показаны. Для простоты мозга рисуется как одну ячейку (белая линия) с указанием потенциальных взаимодействий для врожденного цитокинов (IL-1α и ИЛ-1β (упоминаются здесь как ИЛ-1α / β), TNF-α, IL-6, IFN-γ и ИЛ-10), рецепторов (IL-1R1, TNFR1, IL-6/gp130, IFNγR и ИЛ-10R), и фосфопротеины (то есть, киназы ERK1 / 2, P38 (P38-МАРК) и JNK) и транскрипционных факторов (ATF-2, NFκB и STAT3). Например, TNF-α сигналы через TNFR1 к JNK, p38 МАРК-и ERK1 / 2, который вызывает экспрессию генов через ATF-2. ФНО-α также изменяет экспрессию генов непосредственно через NFκB активации. Вместе активации этих факторов транскрипции, вызывают увеличился (стрелка) и уменьшилась (тупой конец) экспрессии цитокинов и их рецепторов, как указано. Важно отметить, что эти пути показывают, что изменения в одной цитокинов (например, TNF-α), влияние производства других (например, ИЛ-1β) цитокинов. Таким образом, чтобы точно установить цитокин-основания для нейропротекции от холодной предварительной подготовки, комплексного анализа связанных переменных сигнализации должны быть определены. Это позволит установить врожденную цитокинов "подписи" холодной предварительной подготовки. (Изображение было составлено по данным ссылкой № 25.)

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась за счет грантов от Национального института неврологических расстройств и инсульта (NS-19108), Фонд Мигрень исследований, и Белый Фонда Ричард П. Kraig. Г-жа Марсия П. Kraig помощь в подготовке медиа-культуры и обслуживание срез культуры. Мы благодарим Елену за ее Гринберг замечаний и поправок, на окончательный вариант этой статьи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Preparation of Slice Cultures
Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) PICM0-3050
Basal Medium Eagle 21010
Earle s Balanced Salt Solution E2888
Horse serum 26050-088
Glutamax 35050
Gentamicin 15710-064
Fungizone 15295
D-glucose G8769
BSL-1 fume hood
McIlwain tissue chopper
Teflon disks 023-49-310-1
Spatula 14-373-25A
Curved iris scissors 14091-09
Long straight scissors 14002-14
Long forceps 13-812-40
Angled forceps 11808-02
Short forceps 13-812-38
#5 Inox forceps 11254-20
2 Iris spatulae 10094-13
150 x 15 mm Petri dishes 08-757-148
60 x 15 mm Petri dishes 08-757-100B
Wild M8 stereomicroscope
Gey s balance salt solution G9779
Blak-Ray shortwave Ultraviolet measuring meter J-225
6-well Falcon culture dishes 08-772-1B
Neurobasal 21103
B27 supplement 17504
Gem21 Neuroplex 400-160-010
Ascorbic acid A4544
CO2 Analyzer #2820
Pre-screening for Vitality of Slice Cultures
Sytox Green S7020
DMIBRE inverted microscope
Cold-Preconditioning
BSL-2 Fume Hood
Excitotoxic Injury
CoolSnap fx CCD camera
Fluoroscein F36915
MetaMorph software v. 7.5.04
100 μm deep hemacytometer
N-methyl-D-aspartate 454575
SigmaStat software v. 3.5
Co-treatments applied with Cold-Preconditioning
sTNFR1 425-R1-050
Bovine Serum Albumin A-4503
RNA Isolation
RNAlater AM7021
Micro RNEasy Kit 74004
β-mercapt–thanol 03446-100
Diposable 1.5 RNAse-free Pestle 749521-1590
RNasin N261A
Tris[hydroxymethyl]aminomethane T3069
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt hydrate #E7889
RNA Quantification
RiboGreen Assay R11491
Yeast tRNA 15401-011
1.5 mL centrifuge tubes 16155500
96-well fluorescent assay plate DK-4000
96-well fluorescent plate reader Safire II
Quantitative PCR
iScript reverse transcription kit 170-8891
SYBR Green S7563
Platinum Taq polymerase RNA Ultrasense 11732-927
iCycler thermocycler iCycler Optical Module
iCycler system software v. 3.1
Quantitative PCR for Microarrays
RNase Away #7000
RT2 First Strand Kit C-03
SYBR Green-based PCR mix Specific for iCycler PA-011
RT2 Profiler PCR Array PARN-011A
Proteomic Assay
Cell lysis kit 171-304011
Microcentrifuge Micro 7
BSA protein stock 500-0007
BCA protein assay kit 23225
Immuno 96 MicroWell plates 449824
Sealing tape 2239444
96-well plate reader 1420-mulilabel counter
Bioplex Rat TNF-α cytokine assay X0000001T
Immunostaining
16% Paraformaldehyde 43368
Lysine L-6001
Sodium phosphate S374-1
Sodium periodate S-1878
Sodium azide S-2002
Hydrogen Peroxide (30%) H1009
Goat serum CS 0920
Triton X-100 T-8787
Staining dishes 14511
Plate Shaker 3520
#1 Filter Papers (185 mm) 1001-185
3,3 -diaminobenzidine D8001
Dimethyl sulfoxide D8418
Ethanol 111000200
Xylene X3S-4
Permount mounting media SP15-100
Cryostat cm3050 S
Tissue-Tek 27050
Fine-tip paint brush 11806
PAP blocking pen 22309
SFX signal enhancer A31631
ProLong Antifade P7481

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aptowicz, C. O., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Homeostatic plasticity in hippocampal slice cultures involves changes in voltage-gated Na+ channel expression. Brain Res. 998, 155-163 (2004).
  2. Beattie, E. C. Control of synaptic strength by glial TNFalpha. Science. 295, 2282-2285 (2002).
  3. Breder, C. D., Dewitt, D., Kraig, R. P. Characterization of inducible cyclooxygenase in rat brain. J Comp Neurol. 355, 296-315 (1995).
  4. Caggiano, A. O., Breder, C. D., Kraig, R. P. Long-term elevation of cyclooxygenase-2, but not lipoxygenase, in regions synaptically distant from spreading depression. J Comp Neurol. 376, 447-462 (1996).
  5. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes. J Comp Neurol. 369, 93-108 (1996).
  6. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Prostaglandin E2 and 4-aminopyridine prevent the lipopolysaccharide-induced outwardly rectifying potassium current and interleukin-1beta production in cultured rat microglia. J Neurochem. 70, 2357-2368 (1998).
  7. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Prostaglandin E receptor subtypes in cultured rat microglia and their role in reducing lipopolysaccharide-induced interleukin-1beta production. J Neurochem. 72, 565-575 (1999).
  8. Calabrese, E. J. Drug therapies for stroke and traumatic brain injury often display U-shaped dose responses: occurrence, mechanisms, and clinical implications. Crit Rev Toxicol. 38, 557-577 (2008).
  9. Calabrese, E. J. Biological stress response terminology: Integrating the concepts of adaptive response and preconditioning stress within a hormetic dose-response framework. Toxicol Appl Pharmacol. 222, 122-128 (2007).
  10. Calabrese, E. J., Baldwin, L. A. Hormesis: the dose-response revolution. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 175-197 (2003).
  11. Hansel, N. N. Analysis of CD4+ T-cell gene expression in allergic subjects using two different microarray platforms. Allergy. 63, 366-369 (2008).
  12. Hulse, R. E., Kunkler, P. E., Fedynyshyn, J. P., Kraig, R. P. Optimization of multiplexed bead-based cytokine immunoassays for rat serum and brain tissue. J Neurosci Methods. 136, 87-98 (2004).
  13. Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-alpha. J Neurosci. 28, 12199-12211 (2008).
  14. Hulse, R. E., Winterfield, J., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Astrocytic clasmatodendrosis in hippocampal organ culture. Glia. 33, 169-179 (2001).
  15. Kraig, R. P. TNF-alpha and Microglial Hormetic Involvement in Neurological Health and Migraine. International Dose-Respose Society. , (2010).
  16. Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Kraig, R. P. Multiplexed cytokine protein expression profiles from spreading depression in hippocampal organotypic cultures. J Cereb Blood Flow Metab. 24, 829-839 (2004).
  17. Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents. J Neurosci. 25, 3952-3961 (2005).
  18. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo. J Cereb Blood Flow Metab. 17, 26-43 (1997).
  19. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures. J Neurosci. 18, 3416-3425 (1998).
  20. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. P/Q Ca2+ channel blockade stops spreading depression and related pyramidal neuronal Ca2+ rise in hippocampal organ culture. Hippocampus. 14, 356-367 (2004).
  21. Lambertsen, K. L. Microglia protect neurons against ischemia by synthesis of tumor necrosis factor. J Neurosci. 29, 1319-1330 (2009).
  22. Lee, J. K. Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response. J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).
  23. Mattson, M. P. Hormesis and disease resistance: activation of cellular stress response pathways. Hum Exp Toxicol. 27, 155-162 (2008).
  24. Ning, B. Systematic and simultaneous gene profiling of 84 drug-metabolizing genes in primary human hepatocytes. J Biomol Screen. 13, 194-201 (2008).
  25. Oppenheim, J., Feldman, M. in Cytokine Reference. Oppenheim, J. J., Feldman, M. 1, Academic. New York. (2001).
  26. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45-e45 (2001).
  27. Stellwagen, D., Beattie, E. C., Seo, J. Y., Malenka, R. C. Differential regulation of AMPA receptor and GABA receptor trafficking by tumor necrosis factor-alpha. J Neurosci. 25, 3219-3228 (2005).
  28. Stellwagen, D., Malenka, R. C. Synaptic scaling mediated by glial TNF-alpha. Nature. 440, 1054-1059 (2006).
  29. Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40, 133-139 (2002).
  30. Wilde, G. J., Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Mann, D. A., Iannotti, F. Attenuation and augmentation of ischaemia-related neuronal death by tumour necrosis factor-alpha in vitro. Eur J Neurosci. 12, 3863-3870 (2000).

Tags

Neuroscience выпуск 43 врожденный иммунитет гормезис микроглии гиппокамп часть культуры иммуногистохимии нейронные-иммунных экспрессия генов ПЦР в реальном времени
Стратегии по изучению Нейропротекция от холодной предварительной подготовки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mitchell, H. M., White, D. M.,… More

Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning. J. Vis. Exp. (43), e2192, doi:10.3791/2192 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter