Summary
我々は、傷害の発症前に脳を保護するための治療薬の開発のための新たなターゲットを特定する手段として、コールドプレコンディショニングを担当し神経免疫シグナルを定義しようとしています。我々は生物学的システム、実験操作に加え、再現性の高いと小文字が区別される技術的能力を必要とするような作業のための戦略を提示する。
Abstract
神経損傷は、全身麻酔と、効果的な管理が容易で安全なプレコンディショニング治療法の開発により軽減することができる関連する外科的処置の罹患率と死亡率の原因となることが多い。我々は、傷害の発症前に脳を保護するための治療薬の開発のための新たなターゲットを特定する手段として、コールドプレコンディショニングを担当し神経免疫シグナルを定義しようとしています。時間の経過に伴う変化をシグナリング低レベルのプロ炎症性メディエーターは、冷間プレコンディショニング神経保護のために不可欠です。このシグナリングは、刺激性の刺激が明らかになることを保護するための刺激に適応するための十分な時間と閾値の大きさに達することを必要と生理的なコンディショニングのホルミシスの基本的な教義と一致しています。
従って、冷間プレコンディショニング神経保護に関与する免疫シグナルの線引きは、生物学的システムと実験操作に加え、技術的能力が高い再現性と小文字を区別することが必要です。我々のアプローチは密接に成熟しており、静止大膠細胞/ミクログリアの影響を受けた多シナプスニューラルネットワークによる生体のカウンターでを反映するin vitroモデルとしての海馬のスライス培養を使用することです。彼らはフェムトモル範囲の手術であるサイトカイン、の主要な供給源であるため、このグリア状態では、ミクログリアのために特に重要です。また、スライス培養、活性化刺激を呼び起こすと適応応答を評価するために十分な時間である、数週間のためにin vitroで維持することができます。最後に、環境条件を正確にそのサイトカインがコールドプレコンディショニングのシグナリングようにスライス培養を用いて制御することができるが、測定模倣、および重要なノードの側面を分析するように変調することができます。サイトカインシグナル伝達系の解析では、高感度で再現性の多重化技術を使用する必要があります。我々は、組織全体のサイトカインの変化を評価する定量的リアルタイム定量PCRアレイのスクリーニングに続いてミクログリアの活性化のために画面にTNF -αのために定量PCRを使用してください。後者は、同時に変更を通知する複数のサイトカインのシステムを測定する最も高感度で再現性の手段です。重要な変更は、対象となる定量PCRしてから、蛋白質の検出により確認されています。我々はLuminexの技術を使用して多重化ミクロスフェアのフローサイトメトリーアッセイを用いて組織ベースのサイトカインタンパク質の変化を探る。細胞特異的サイトカイン産生は、二重ラベルの免疫組織化学で決定されます。一緒になって、提案された調査の戦略に結合この脳組織の調製および使用のスタイルは、、コールドプレコンディショニングの利点を模倣することができる新たな治療法の開発のための潜在的なターゲットを特定するための最適なアプローチかもしれない。
Protocol
滅菌と無菌テクニックは準備、メンテナンス、および長時間のスライス培養を利用する上で重要です。さらに、唯一のin vitroで 18日後のスライス培養の私達の使用のための論理的根拠は、興奮性および抑制性シナプス伝達は、最も成熟になることを示す、とグリア（アストロサイトとミクログリア）が静止し、そのin vivoでの対応で （図1と一貫性が証拠に基づいています。 ）。
1。海馬スライス培養の準備＆メンテナンス
- 培養の同じ日、50 mLの基礎培地イーグル、25mLのアールの平衡塩類溶液、23 mLのウマ血清、0.5 mLのグルタミン（200mMのストック）、0.1 mLのゲンタマイシン（10mgを/で構成される1.1 mlの増殖培地に無菌のインサートを平衡mlストック）、0.4 mLのFungizone（250μg/ mL）を、1.45 mLのD -グルコース（45％、42 mMの合計）。
- 36でインキュベーター内で6ウェルトレイおよ° C、5％二酸化炭素、湿度95％。
- 最大不妊の場合、培養は、理想的に空気をHEPAフィルタ処理された正圧培養室で行われ、また、自己完結型の紫外線空気浄化ファンを経由して精製し、そして実験室のコートの袖にわたりますきれいな白衣と滅菌手袋を着用しながら、 。
- 必要なすべての材料を（すなわち、マッキルウェーン組織チョッパー、関連テフロンインサート、カミソリスライス刃、冷たい解剖（3-4℃）プレート、手術器具、および解剖シャーレ）が含まれてBSL - 1層はドラフト内でスライス培養を準備ワイルド（M8）実体顕微鏡を使って。
- さらに解剖の面積とツールの無菌性を確立するために紫外線に解剖の資料を公開すると同時に、冷却板は、（近隣の水浴から実行）少なくとも30分は3-4℃の温度に到達することができます。
- 層流フードは定期的に紫外光が短波長の紫外光を測定するメータ付きの卓上型のレベルで十分なパワーを持って確保するためにテストされています。
- ヒュームフードの後ろに無菌ベンチで小動物のボックスに100％の二酸化炭素で麻酔し、内100％エタノールに浸漬することによって清め（P8 - P9と〜23グラム/個。出生時に10に間引かリットルから）仔ラットを使用して、後続のすべてのステップが実行されているヒュームフード、。
- 100ミリメートルペトリ皿の半分に子犬を刎ねると子犬ごとに新鮮な料理を使用して、後半に頭を置く。
- 脳を摘出し、含まれている60ミリメートルペトリ皿の下半分にそれを置いて10 mLの滅菌冷（3-4℃）6.5にD -グルコースを添加したGeyの平衡塩類溶液mg / mLの（すなわち、45の7.5 mLのGeyのの500mlボトルあたりの％は、D -グルコース。
- 各半球から海馬を摘出し、マッキルウェーンチョッパ用テフロンディスク上に配置します。離れて切断刃に付着するから、カットの脳切片を防ぐために、アイリスのスパチュラを用いて脳組織からの拡散媒体。
- 350から400μmで設定されたセクションの厚みで、マッキルウェーンチョッパを使用して、その長軸にセクション海馬に垂直に。
- 足早に新鮮なテフロンインサートのスライスをカットオフとを含む冷（3-4℃）に1 mLのピペットを用いて6.5 mg / mLのD -グルコースとGeyの平衡塩溶液。を60ミリメートルペトリ皿の上半分に洗う
- 無傷の歯状回と錐体細胞層のための実体顕微鏡下でスライスを検査する。
- ゆっくりと半年ごとにクリーニングし、赤外線炭酸ガス分析装置と小数点以下1桁まで正確な温度計を3ヶ月ごとに較正されたインキュベーター内で通常の培養条件下でのインサートの上に最大のスライスを配置する（インサートごとに3つ、12スライス/ PUP）と維持する。
- 培養皿でのリフレッシュの増殖培地BSL - 2フード及び無菌操作を用いてin vitroで 3〜4日ごとに。
- in vitroでの 7日後、0.5mLのグルタミン（200 mM）を、0.1mlのアスコルビン酸（0.5 M）、、0.68 mLのD -、97 mLのNeurobasal、2mLのB27から構成される1.1 mlの無血清培地（SFM）でメディアを交換グルコース（45％、42 mMの合計）。
2。スライス培養のプレ画面バイタリティ
- 注しSYTOXグリーンストック（10μL）と-20℃で保存
- 無血清増殖培地中の濃度（すなわち、100mlの培地に10μL）を作業500nMのためにSYTOX株式を希釈する。ストアSYTOXメディア4℃、最大で1週間にするために使用。
- 場所1.1 6ウェル培養皿にウェル当たりSYTOX mLのと36℃くらいまで温め、十分な期間を5％炭酸ガス（すなわち、培養皿上で凝縮性の欠如によって証明されるように）で。
- 一方、安定化電源から電源紫外線ランプは（すなわち、FITCフィルターと蛍光光源）、少なくとも20分間、温度に加温し、均一な光強度を確保することができます。
- 場所のスライス培養（18日間その後10分間SYTOXメディアのin vitroでの）とは、バック不可逆CA1錐体層の損傷のための画面にSFMに。
- 5倍の倍率で検査した倒立顕微鏡、の無菌表面上の文化を見る。
- CA1領域の少ないより30 SYTOX陽性細胞で培養を受け入れる。
3。冷間前処理
- 6ウェル培養皿でSFMの代わりに1.1 mlの。冷却媒体（例えば、30 ° C）は使用前に少なくとも20分間インキュベーター（5％二酸化炭素、湿度95％）で平衡させる。培養皿上で凝縮がない場合は、平衡化のための十分な時間が発生したことを示します。
- 冷却媒体（1.1 mLの/ウェル）BSL - 2はドラフト内で無菌操作を用いて90分間30℃でインキュベートで保管トレイにスライス培養インサートを移す。
- 再びBSL - 2の換気フードを経由して無菌操作を用いて、24時間、通常の培養条件下では通常のSFMに戻すスライス培養を置きます。
4。興奮毒性損傷
- 20分間SYTOXメディアに公開することにより、スライス培養実験的な使用の試写するを始める。
- 事前に選別する（背景画像）で使用されるものと同様の方向に維持スライスを使用して個々のスライス画像を取得する。これは、各挿入の時に"two""10"とでマーカーペンで右に左にマークを置き、二つのマークによって行われます。この操作は、画像の各培養セットに興味の形状の同じ領域を使用して容易に。
- 彼らは温度に温めたので、同時に、20分の最低紫外線ランプの光源（安定化電源の下）をオンにし、CCDカメラ。
- その後、フルオレセインの標準とCCDカメラキャリブレーションを行ってください。
- 自動的にキャリブレーションのCCDカメラが使用されていない限り50サイクル光にさらすことにより、"クリア"CCD。我々は、傷害の定量に使用される当社クールスナップカメラをクリアするためにMetaMorph内でプログラムを確立している。
- 90mLのPBS（10mMリン酸緩衝液、150mMのNaCl 7.3 pHで）と渦におけるフルオレセインの代わりに10μL。
- 100μmの深さ血球計算盤の上にフルオレセインの混合物のピペット10μL。
- 1000/4096に完全な画像の輝度を調整します。
- その冷間前処理（すなわち、関心の強さの≥250 CA1領域での文化を捨てる）、けがをしないか確認するためにスライス培養の背景画像を収集する。
- NMDAメディアでトレイを準備します。
- 毎週少なくともNMDAの10mMのストック溶液を調製。
- 興奮毒性損傷の場合は、SFMの20 50μMにNMDAを希釈し、少なくとも20分間、通常の培養条件に平衡化してください。
- 通常の培養条件下で60分間、NMDA -メディアにBSL - 2フード及び無菌操作、場所のインサートを使用した。
- 3つの独立した60 mmの培養ディッシュに各インサートを3回浸漬することによりインサートのNMDAを洗い流すそれぞれ含む10mlのNeurobasalは36℃に加温し、 three 60mmの洗浄皿のセットごとつ以上のインサートを使用しないでください。
- 通常の培養条件に文化を返します。
- 24時間NMDAに暴露した後の傷害の画像を収集する。
- 上記のようなフルオレセイン標準のカメラをキャリブレーション。
- 20分間SYTOXメディアの場所は、文化。
- 傷害の定量：
- MetaMorphソフトウェアを使用して、CA1領域の周りにAOIを描く。
- ために選択した領域の輝度測定"傷害を。"
- "傷害"から"背景"画像のコピー＆ペーストAOI。
- "傷害"とExcelに"背景"から値を入力します。
- 制御と冷間前処理の文化のための"分子 - 背景を"定量。
- 統計ソフトウェア（例えば、SigmaStat）を使用して、実験群（複数可）に対しては、常にそれぞれの実験の実行に含まれるべき対照群、の傷害を比較するために適切な統計的テストを実行します。
- 注意：損傷レベルは一日後の傷害の画像に低い場合は、キャリーアウト二三日後に実験。文化の保護は、傷害（図2）への感受性の不足のためにマスクされることがあります。
- 注："保護"の問題は、私たちは計測傷害のレベルと、すべての比較のためではないの比（図3）に移動するように指示。
5。コールド - 前処理と応用の共同治療
スライス培養の重要な利点は、環境条件です。sは正確に制御することができる。これは、コールドプレコンディショニングからシグナリングそのサイトカインが、測定された模倣する、との重要なノードの側面を分析するように変調することができます。意味
- 組換え（例えば、アゴニスト）タンパク質と中和（例えば、抗体または可溶性受容体）タンパク質は、それぞれ、サイトカインのシグナル伝達を模倣し、調節するために使用することができます。
- 一般的に、これらのタンパク質は、適切な生物活性を確保するために6ヶ月以内に使用するために-20℃でアリコートとして再構成し、格納されています。
- ここで、我々は、可溶性TNF受容体1（sTNFR1）を使用して、TNF -αシグナル伝達の廃止の例示的な使用を説明します。
- 濃度50μg/ mLの株式、20〜50μLの量で分注し、-20℃で保存にPBSでアルブミン0.1％ウシ血清で再構成sTNFR1
- 使用する場合は、スライス培養における希釈sTNFR1〜200 ng / mLの増殖培地は36℃、場所コールドプレコンディショニングの前に20分間sTNFR1メディアのスライス培養を温めた。
- 注：分散を低減するために、対（すなわち、50μg/ mlの増殖培地10ml中sTNFR1株式から1:250希釈40μLsTNFR1が必要です）増殖培地の大量では200 ng / mLのsTNFR1を希釈するのが最適です（1.1 mLのメディアあたり4.4μL）皿に各ウェルに直接sTNFR1を追加。
- よくメディアと各インサートの代わりに1.1 mLのsTNFR1〜200 ng / mLを希釈する。メディアは、前述のように90分間冷コンディショニングにスライス培養を公開する前に少なくとも20分間30℃に平衡させる。
- 36で元の場所のスライス培養·メディアのsTNFR1存在とC。
- 24時間後、前述のように20分間SYTOXメディアに文化を公開し、その冷間前処理演算子は、文化を傷つけていないかどうかを確認するために背景画像を収集する。
- 上記のようなデータを定量する。
- in vitroでのコンポーネントとリフレッシュメディアは3〜4日ごとに。
6。冷間前処理後の即時および遅延興奮毒性損傷
- コールド - プレコンディショニングによる即時けが。
- 上記のような冷間プレコンディショニング行います。
- コールド - プレコンディショニングした後、20分間通常のインキュベーションに文化を返します。
- その後、一時間20〜50μMNMDA損傷する文化を公開。
- 文化を上記のように三回すすぎ、通常のインキュベーションに戻ります。
- 24時間後、上記のように怪我の写真を取得する。
- 上記のような冷間プレコンディショニング行います。
- コールド - プレコンディショニングの効果を遅らせた。
- 上記のような冷間プレコンディショニング行います。
- NMDA損傷24時間後に上記のように文化を公開。
- 最初の保護を監視するために冷間前処理した後、3日間、怪我の画像を取得し続けます。
7。 RNA分離
以下の遺伝子発現の手順は、単一のスライス培養のためにスケーリングされます。
- RNAを安定させるために6ウェル培養皿に3 mLのRNAlater中に増殖培地と通常のインキュベーションからスライス培養を転送します。 4℃以下で説明するように処理されるまで三日までのC。
- ゆっくりと冷たいのを1 mLの微細先端のペイントブラシや場所で挿入をオフにスライス培養を持ち上げて（4℃）を1.5mLのPBS（DNase処理、リボヌクレアーゼ、およびDNAフリー）マイクロ遠心チューブ。
- 30秒と削除PBS清のサンプルを遠心分離します。
- -80℃ストアサンプル℃の
- 氷の上でスライスの培養（〜250 ngの/個）、融解サンプルからRNAを単離する。
- さらに詳細に説明するとRNeasyマイクロハンドブック（キアゲン社）から適応され、次の手順を経由してキアゲンMicroRNeasyキットを用いてRNAを分離します。
- つのスライスの文化を含む各マイクロ遠心チューブに350μLのBuffer RLTを（mL当たり10μLのβ-メルカプトエタノールを含む）に置きます。
- 30秒間ボルテックスによりサンプルをホモジナイズする。完全にのBuffer RLTに均質化するまで（すなわち、組織ペレットはまだ目に見える）必要が使い捨て乳棒を使用している場合は、ティッシュをひいて粉にする。
- ライセートミックスと混合するためにピペットに70％エタノールの代わりに350μL。
- コレクションチューブにスピンカラムと場所（スピンカラムとコレクションチューブの両方がQiagen社によって提供されている）にホモジネートを転送します。
- 最高速度で15秒間のサンプルを遠心。列を保持する。
- 最大速度で15秒、350μlのBuffer RW1を加えた遠心を追加することで、スピンカラムを洗浄します。バッファを破棄する。
- 80μL合計量を得るためにRDD 70μLバッファでのDNase Iストックの10μLを希釈します。ピペットで静かにボルテックスしないで混合する。サンプルあたりの希薄化後のDNase株式の80μLを準備します。 30分間室温でインキュベートする。
- 15秒間スピンカラムや遠心をサンプリングするために350μlのBuffer RW1を追加。コレクションチューブを捨てる。
- 新しいコレクションチューブを使用して、サンプルに500μlのBuffer RPEを追加し、遠心分離を15秒間とバッファーを捨てる。
- 2分間のサンプルと遠心上の80％エタノール500μLを置きます。コレクションチューブを捨てる。
- 開管のキャップで最大速度で5分間遠心分離することによってスピンカラムを乾燥させ、コレクションチューブを捨てる、とキットで供給された1.5 mlのコレクションチューブにスピンカラムを移す。
- スピンカラムメンブレンの中央に単離されたRNA、場所14μLRNaseフリー水を回収する。 1分間の遠心分離を行ない、流体を集める。
- 2 RNasinのμL（TEバッファー中で1 U /μLに希釈）、-80℃で保存を追加TEバッファーは8.0 pHでの10mM Tris（トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン）、1mMのEDTA（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩の水和物）で構成されています。
8。 RNAの定量
- 注：RNasinは、RiboGreenアッセイを妨害しない。
- RNaseフリーのTE緩衝液にRiboGreen 1:200に希釈して次のように。
- TE（ML）：1; Ribogreen（μL）：5;
- TE（ML）：4; Ribogreen（μL）：20;
- TE（ML）：6; Ribogreen（μL）：30。
- RNAの基準は次のように調製されています。
- 酵母tRNAは、RNAの標準として使用されます。 tRNAは、TEバッファー中で1 mg / mLのように（-20℃）保存されています。
- 1μg/ mlの作業標準を作成するために、（DNase処理、リボヌクレアーゼ、およびDNAフリー）1.5 mLのマイクロ遠心チューブを使用して、TE緩衝液に1 mg / mLの株式1:100に希釈する。
- 隣のテーブルに示すように、既にプレートウェルにTEバッファーに1μg/ mLの標準の適切な量を追加、TEバッファー希釈剤を最初に追加することで直接96ウェル蛍光アッセイプレートに標準曲線を準備します。次のように各規格の井戸を複製してください。
- 巻。 STDの。 （μL）：100;巻。のTE（μL）：0;井の中のRNA（NG）：100;
- 巻。 STDの。 （μL）：80;巻。のTE（μL）：20;井の中のRNA（NG）：80;
- 巻。 STDの。 （μL）：60;巻。のTE（μL）：40;井の中のRNA（NG）：60;
- 巻。 STDの。 （μL）：40;巻。のTE（μL）：60;井の中のRNA（NG）：40;
- 巻。 STDの。 （μL）：20;巻。のTE（μL）：80、井の中のRNA（NG）：20;
- 巻。 STDの。 （μL）：0;巻。のTE（μL）：0;井の中のRNA（NG）：0。
- アッセイは、次のように調製する。
- 96ウェルプレートのサンプルを各ウェルにTEバッファー99μLを加える。これを行うための最も効率的な方法は、マルチチャンネルピペッターを使用することです。
- 実験サンプルのウェルにRNAの1μLを追加。
- よくマルチチャンネルピペッターを使用して、それぞれのために希釈RiboGreen 100μLを加えると、ピペッターの1つまたは2つのストロークでひいて粉にする。
- 480nmの励起と520 nmの発光で蛍光プレートリーダーでプレートをお読みください。
- RNAの標準の測定蛍光強度を使用してMicrosoft Excelを使用して標準曲線を構築する。
- 標準曲線から生じる線形方程式を用いてサンプル中のRNAの濃度を計算する。
9。 SYBRグリーン定量PCR
- PCRの手順は、最高のRNA（図4）との仕事のために特別に用意された清潔な場所で行われます。
- アウェイ紫外線、10％の漂白剤またはRNaseを使用する前に潜在的なDNAのコンタミネーションとRNase活性の領域と関連する研究室の機器を除染。
- すべての手続き中は手袋を着用してください。
- としてキットに付属するすべての手順については、RNaseフリー水を使用してください。 DEPC -（ジエチル）処理水を使用しないでください。
- すぐに外来DNAのエアロゾル汚染を遅らせるために使用後、すべてのPCR関連のチューブを閉じます。
- 開発し、関心のmRNAのターゲット（複数可）のためにプライマーを特徴付ける。これらのメソッドはらをハルスに補足方法に記載されています。、神経科学学会、2008 13。
- cDNAはiScriptを使用して逆転写を介して30から200 ngのトータルRNAから生成されます。
- RNAの量を始めるの選択は、サンプルの部分についてRT - PCR解析（すなわち、全体の10％-20％）を行うことを目的とした利用可能なRNAの総量によって決定されます。
- RNAの残りの大部分は、将来の分析のために保存されます。
- iScriptキットは20μLの全体積にランダムヘキサマーとオリゴdTプライマーのブレンド、および変更されたMMLV逆転写酵素を利用しています。
- 25の転写の進行を逆° Cで50分、および逆転写酵素のために42℃で30分が85で5分間℃、続いて変性するために。
- RNAの量を開始し、0.4 ng /μLの相対の最終濃度になるようTE緩衝液にcDNAを希釈する。
- SYBRグリーンPCRベースの戦略は、cDNAを増幅するために使用されます。
- PCR反応は、SYBRグリーン取り込みを監視することでリアルタイムで監視されます。
- 50μLの反応は、200μMのdNTPを、15 pmolのフォワードプライマーとリバースプライマーの各々 、1μM反応におけるフルオレセイン、1 × SYBRグリーン色素、cDNAを10μL（4 ngの）スライス培養、および1.25 UのプラチナTaqポリメラーゼを3mMのMgCl 2を含んで50mMのKClおよび10mMのトリス、8.3のpHで構成されるバッファ。
- PCRは、リアルタイムでデータを収集することができますiCyclerのサーモサイクラーを使用して実行されます。
- サイクリングのパラメータは、30秒アニーリング/エクステンション（60℃）45回繰り返すことによって続いて15秒間変性（95℃）で構成されています。
- 光学的測定は、アニーリング/エクステンションステップ中に取られるとCt値は、iCyclerのシステムソフトウェアを使用して測定した。
- 関心とβ-アクチンのサイトカインのターゲットのcDNAを、標準曲線を構築するために使用されています。
- コピー数は、プラスミドcDNAの分子量と質量から決定されます。
- コピー数/質量の標準曲線は、それぞれのアッセイで構築し、含まれています。
- 各cDNAを希釈するためのCt値は、コピー数対のCt曲線を決定するために使用されています。
- サイトカインおよびβ-アクチンコピー数のレベルは、標準曲線を用いて試料について測定されています。
10。マイクロアレイのための定量PCR
定量的リアルタイム定量PCRアレイのスクリーニングは、低レベルの炎症性メディエーターの発現の変化を探るために高感度で再現性の手段です。
- SABiosciencesからRT2 ProfilerのPCRアレイは、メーカーによってさらに詳細に説明され、次の手順で、炎症性メディエーターの遺伝子発現の変化のために使用されます。
- アッセイは、0.1〜1.0μgのRNAを使用しています。我々は、地元のスライスの領域（例えば、プールされたうちの2つのサンプルから〜250 ngのトータルRNAを提供するCA1）またはトータルRNAの同じような量を含む全体、単一のスライスを使用してください。
- サンプルとコントロールRNAは逆ファーストストランドのキット（例えば、＃C - 03）を用いてcDNAに転写されています。
- 得られたcDNAは、SYBRグリーンベースのPCRミックス（＃PA - 011）とPCRアレイプレート（84ユニークな実験的な遺伝子と16のハウスキーピング遺伝子を測定する）の96ウエルの各々に小分け25μLと混合される。
- つのアレイプレートは、実験サンプルのために準備されており、第二の板は、制御用に準備されます。
- 注意：メーカーから提供されたSYBRグリーンのマスターミックスは、サーマルサイクラーに固有です。
- 熱サイクルは、95 60℃で1分間の延長のステップに続いてC℃で15秒の変性ステップで構成される40サイクルのプロトコルでiCyclerを使用して行われます光学データは、拡張ステップの間に収集されます。熱サイクルは、0.5℃刻みで55から95℃の温度範囲をスキャンして融解曲線分析が続きます。
- 処理と制御板の遺伝子の相対的な発現は、2を用いて決定した-提供されてExcelベースのソフトウェアを使用してΔΔCT法をして倍の増加またはコントロールに対して相対的に減少として表現。
- 表現の2倍の増加または減少した遺伝子は、さらに評価の対象と見なされます。
- PCRアレイのスクリーニング（例えば、冷間プレコンディショニングのために＃PARN - 011A使用）から同定された遺伝子は、さらにconfirmeですdは、定量PCRを用いた。
- PCRアレイは、刺激に応答して調節される遺伝子を特定する。
- 積極的に冷間前処理に対応して規制として、コールドプレコンディショニングの例では、我々はIL - 11遺伝子を同定した。
- 分析の次のステップは、新たに同定された遺伝子は、上記詳述した定量PCRアッセイを用いてスライス培養で制御されていることを確認することです。
11。多重化された微小球のフローサイトメトリープロテオミクスアッセイ
- 上記のような冷コンディショニングにスライス培養を公開。
- 総タンパク質のアッセイのための収穫スライス培養。
- 静かに1 mLの冷で精密チップブラシと場所を使用して、挿入をオフにスライスを持ち上げて（4℃）PBS。
- チューブを遠心し、スライス培養からPBSを取り除く。収穫が終了するまでドライアイス上に置きます。
- -80℃ストアチューブ℃の
- 総タンパク質アッセイを行うためのスライス培養サンプルをホモジナイズする。
- 均質化のための細胞溶解バッファーを準備します。
- メーカーの指示（Bio - Rad社）に続いて、溶解緩衝液5 mLにプロテアーゼ阻害剤を追加し、氷上に置きます。
- 100μLピペットの先端で5回上下にピペッティングしてスライス培養と撹拌のスライス上での溶解緩衝液の代わりに100μLを1 mmのオープンカット。
- ℃で20分間、4℃でプレートシェーカー上でサンプルを振る。
- 4℃で15分間、13,000 rpmでサンプルを遠心
- きれいなチューブに上清を移し、氷上に置きます。
- 均質化のための細胞溶解バッファーを準備します。
- 総タンパク質アッセイを実行します。
- BSA（ウシ血清アルブミン）タンパク質標準を準備。
- 製造元の指示に従って、超純水で再構成する株式BSA。
- 溶解バッファー中で希釈された0000〜1000μg/ mLとし、範囲の蛋白質の基準を準備します。
- キットの指示に従って必要な作業試薬の体積を計算します。
- たとえば、（8標準+ 18未知のサンプル）×（二人複製）×（サンプルごとに必要な200μL作業試薬）96ウェルマイクロプレート（例えば、ミクロスフェアフローサイトメトリーアッセイにロードするために必要な作業試薬の総量の= 10.4 mLの、）以下を参照してください。
- ときに混合試薬Bと試薬、いくつかの濁りが発生する可能性がありますが、すぐに消えるはずです。
- マイクロプレートに標準と試料の10μLをロードします。
- ウェルに働く試薬0.2mLをロードする。
- シールテープでマイクロプレートをカバーし、30秒間プレートシェーカー上で振とうする。
- 37マイクロプレートをインキュベート℃で30分間を。
- 595 nmの波長でのプレートリーダーで読み込む前に、室温まで冷却マイクロプレート（約10分）。
- BSAの標準の測定吸光度を使用してMicrosoft Excelを使用して標準曲線を構築する。
- 標準曲線から生じる線形方程式を用いてサンプル中のタンパク質濃度を計算する。
- -80℃で溶解バッファーとストア℃で測定された最低の濃度になるようにすべてのサンプルを希釈する
- BSA（ウシ血清アルブミン）タンパク質標準を準備。
- リファレンス＃12と16の完全な詳細で説明されているシングルプレックスと多重サイトカインの組織（または流体）アッセイを実行します。
12。免疫組織化学
- 超純水（固定剤が6.2 pHである）80 mLの全量を満たした10mlの16％パラホルムアルデヒド、1.096グラムリジン、0.42 gのリン酸ナトリウム、および0.17グラムの過ヨウ素酸ナトリウムからなるPLP固定液で24時間培養を固定してください。
- 我々は、PLP固定液は、それ以外の場合、他の固定液を用いて明らかではないと低レベルの免疫染色の検出を可能にする穏やかな固定液であることがわかります。
- 培養は24時間固定し、PBSを含むアジ化ナトリウム（100 mg / Lの）への細かいブラシで転送されます。
- 〜50 rpmで振盪に結合すべてのステップで次のように浮動スライス全体の文化の明視野免疫染色が行われます。
- 10分間、3 mLのPBSで3回にスライス培養を洗浄してください。
- H 2 O 2 0.3％スライス培養を急冷。
- PBSで30％H 2 O 2ストック溶液を希釈する。
- PBSで3回、10分ごとにスライス培養を洗浄してください。
- 10mLのヤギ血清、0.75 mLのトリトンX - 100、及び89.25 mLのPBSで構成された6ウェルプレートの3 mlブロッキング溶液中で室温で一時間のスライス培養をブロックする。
- ブロッキング溶液のための血清は、二次抗体が生まれ育った同じ種からのものである必要があります。
- 4℃でブロッキング溶液で希釈した一次抗体で一晩切片培養℃にインキュベートする。
- 小さなガラスパイレックス皿井戸のための一次抗体溶液の最大体積は0.3mLの高いボリュームは、プレートの端を上に実行する傾向があるはずです。
- 加湿密閉容器に皿を置きます。セクションを覆うフィルム上にスピンし、さらに精密検査のために失われる可能性があるので、我々は、接着フィルムで料理を網羅しているわけではありません。
- 抗体溶液でスライスを循環させるのに十分なだけ高くするプレートシェーカーのスピードを振って調整する。
- ガラス板からスライスを削除し、PBSで洗浄につき10分間3回洗浄する。
- 振とうしながら1時間室温で二次抗体でスライスをインキュベートする。
- 0.3mLの二次抗体溶液をロードするために小さなガラスパイレックスの皿を使用してください。
- PBS、洗浄あたり10分で3回洗浄する。
- 3' -ジアミノベンジジン（DAB）で染色して可視化する。
- 3 mLのジメチルスルホキシドに30 mgのDABを溶かす。
- フィルタDABは、2＃1フィルタペーパーと54 mLのPBSで洗浄を使用して。
- 使用直前に、30％H 2 O 2の20μLを加える。
- 室温で5〜7分間DAB溶液中での文化をインキュベートする。
- 注意：DABは発癌物質であり、適切に処分する必要があります。ドラフトに保存されているマークコンテナ内のすべてのDABのソリューションを処分し、DABを無効にするには漂白剤溶液中ですべての皿を置きます。すべてのDAB溶液は、最終的に制度的安全管理室を経由して破棄する必要があります。
- PBSで切片培養を10分間ずつ3回洗浄する。
- ゼラチンにウェットマウント切片培養（またはシラン）蒸留水に溶解した100μLの皿の石鹸でコートしたスライド。室温で一晩乾燥させる。
- スライドウォーマーの過度の熱を使用しないようにスライドにマウントされている文化では割れが発生することがあります。
- 30秒ごとに、段階的エタノールシリーズ（50、75、95、95、100、100％）を介してスライドを脱水する。
- ten分間ずつキシレンの4倍との明確なスライド。
- ガラスパスツールピペット、場所スライドの上に取り付けメディアの0.1 mLをゆっくりと形成する気泡を避けるためにカバースリップを使用した。室温で一晩乾燥させる。
- 蛍光免疫染色。
- 断面スライス培養クライオスタットを用いて厚さ20μmまで。
- ℃の内部温度、および-12℃のオブジェクトの温度を-16にクライオスタットの設定を調整します。
- パスツールピペットやドライアイス上で凍結を使って金属チャック上に少量の水を置きます。
- 冷凍チャックの上にティッシュテックメディアの薄いディスクの層を適用します。
- チャックがフリーズし、クリオスタットチャンバーの温度に平衡させる。
- フラットスライス培養を敷設するのに適した平らな表面を作成するセクションティッシュ- Tek製メディア。
- これはチャックを落下マウントメディアを防止することセクショニングの一貫性のある角度を提供する切片ながら、チャックの向きに注意してください。
- 凍結時に、つまみ出すとホルダーに配置してください。金属へらと精密チップペイントブラシを使用して、ヘラにつのスライスの文化をスライドさせてに移動することチャック上にティッシュ- Tek製のメディアの平坦化層の中間。
- 少なくとも10分間チャンバーの温度でマウントされているスライス培養と凍結オーバー組織- Tek社のメディアの薄層を配置。
- "トリム"ボタンを活性化、セクションティッシュ- Tek社のメディアの最上位層とスライス培養では、表示されるまで。
- 20μm以下で、プリセットの"トリム"の"セクション"からスイッチ。
- 室温、一晩乾燥したスライドであるゼラチンコートしたスライドと20μmのセクションをピックアップ。
- 組織- Tek社のメディアは、スライド上に表示がありますが、PBSの洗浄に溶解される。
- 免疫染色。
- 10分ごとに、PBSで3回スライドを洗浄します。
- H 2は揺れ、室温で15分間O 2 0.3％癒やす。
- 10分ごとに、PBSで3回スライドを洗浄します。
- SFXシグナルエンハンサーを使用して、加湿チャンバー中、室温で30分間のスライドとインキュベート上のセクションの上に直接コンポーネントの数滴を適用する。
- コンポーネントとのインキュベーションでは、明視野の免疫組織化学で行われる10％ヤギ血清溶液とブロッキングのステップを置き換えます。
- 一次抗体でインキュベートスライドを0.75％で37℃で2時間PBSでトリトンX - 100℃の希釈
- スライドの上に直接一次抗体溶液を適用し、蒸発を防ぐため、加湿チャンバー内でインキュベートする。
- PBSのみとトリトンX - 100を使用する抗体のソリューションのいずれにおいても血清含めないでください。
- 10分ごとに、PBSで3回スライドを洗浄します。
- 室温で一時間二次抗体でインキュベートし、光からスライドを保護する。
- 抗体溶液に入るから任意の凝集を防ぐために20分間、すべての蛍光二次抗体を遠心分離します。
- PBSのトリトンX - 100 0.75％使用して抗体の希釈液を調製する。
- 10分ごとに、PBSで3回スライドを洗浄します。
- ディップは、PBSから塩を洗い流すために一回蒸留水でスライド。
- 、室温で一晩乾燥したスライドには、光から離れてカバー。
- 退色メディアを延長するとカバーがスライド。
- 解凍コンポーネント5〜10秒電子レンジでとコンポーネントBのバイアルに約1 mLを加えるには、溶液中に気泡を導入することに注意しながら、Pastuerのピペットを使用して一緒に混ぜる。
- 気泡を除去するために最大速度で5分間遠心する。
- 気泡を作らないように注意してPastuerピペットを使用して、スライドの上部に褪色メディアの薄層を適用します。
- 静かに光からカバー、スライドと乾燥一晩の上にカバースリップを配置。
- 二重標識蛍光免疫染色（図5）。
- 同じインキュベーション溶液に一次抗体の両方を希釈する場合を除き、前述のように蛍光免疫染色を行います。
- 同じソリューション内のすべての二次抗体を希釈し、上述のようにインキュベートする。
- 2つの抗体を使用してシリアル潜伏期間は減少免疫染色をもたらした。
- 断面スライス培養クライオスタットを用いて厚さ20μmまで。
13。代表的な結果
図1。海馬スライス培養とミクログリアの外観は。左手の画像は、典型的な成熟した（すなわち、in vitroで 21日間）海馬スライス培養は主ニューロンの細胞構築を示すために、NeuN（緑）で染色を示しています。錐体ニューロンは、地域CA1とCA3と凹みで示されています状回（DG）ニューロンは、左に食べた。スケールバーは250μmである。右側の画像は、CA1領域から導出され、成熟したスライス培養内で静止ミクログリアの分枝の品質を説明するために、より高い電力で示されています。細胞は、ミクログリアの表面マーカー、cd11bでマークされた。スケールバーは50μmである。
図2。コールド-プレコンディショニング海馬スライス培養における神経保護。文化はSYTOXグリーン、蛍光マーク死んだ細胞のマーカーとインキュベートされています。一番上の行は、偽の対照培養物を示し、下段は℃で90分間28に公開されたスライスを示しています。左手、事前に画面のイメージはCA1傷害を示していない。相対的な傷害のカラーキャリブレーションの規模は、左上の画像に表示されます。中段の画像は、24時間、20μMNMDAに暴露した後の相対的なスライス培養の損傷を示しています。偽のコントロールの傷害がコールドプレコンディショニング（CP）にさらされた文化のそれより大きいことに注意してください。伝統的に、培養物を、CA1神経細胞の損傷レベルとCP対偽の相対的な傷害を最大化するために一晩NMDA 20μMに曝露事故/最大負傷の比として注目されています。しかし、最大の傷害の刺激への曝露は、前処理から神経保護作用を克服するために十分ではない可能性があります。従って、傷害/最大傷害の比率を使用するには、正確に前処理から神経保護作用を反映していない場合があります。これは、CP最大レベルは、偽の対照群よりも小さい示し、右側の画像で明らかである。
図3。コールドプレコンディショニングの実験における傷害のレベルを定量するために初期の、最初の日の測定値を用いることの有用性を示す概略が。上述のように、我々は比率（傷害/最大負傷）の使用は、コールドプレコンディショニングから神経保護を覆い隠すことができるが見つかりました。これは、回路図から偽の損傷が赤で表示されている左にしていることがわかる後に青でコールドプレコンディショニング。ある日、NMDA曝露後に冷間プレコンディショニングは、40％の神経保護と整合性傷害V.偽（"5"）のコントロールの相対的な"3"レベルを示しています。しかし、比（すなわち、傷害/最大負傷）を使用して伝統的な形式が使用されている場合、保護は明らかではない[すなわち、（5 / 10）偽vの= 50％（3 / 6）冷前処理のための= 50％ ]。
図4。 Typial定量PCRの結果が表示されます。コントロール（青）と実験試料（赤）を示すPCR増幅のための上側の曲線のRNAコピー数V.閾値サイクルを。下の画像は4つのサンプル（黒、緑、黄、紫）のために典型的な増幅プロファイルを示しています。後者のCt閾値サイクルに注目してください（オレンジ色のラインでマークする）26.0、29.5、31.0、32.5で発生する。
図5。二重ラベルの免疫染色は、定量PCRおよび定量PCRアレイの結果を確認するために用いるスライス培養をIL - 11（赤）とNeuN（緑、神経細胞をマークする）のために処理した。IL - 11の細胞の発現遺伝子座を探るために。星状膠細胞と推定されるいくつかの小さな細胞（矢印）、、表示しながら、いくつかの錐体ニューロンが（矢印）IL - 11およびNeuN染色を（黄色）を示すことに注意して唯一のIL - 11染色（赤）増加した。
Discussion
コールド - プレコンディショニング神経保護に関与サイトカインシグナル伝達系の描写に重要な二つの根本的に重要な概念は、図6と図7に示されています。最初に、サイトカインは通常の脳内シグナル伝達分子が非常に低濃度です。それにもかかわらず、生理的サイトカイン濃度の変化は、遺伝子の発現を変化させる能力（図6）の脳の構造と機能（すなわち、表現型）を変更するために計り知れない可能性を秘めている。さらに、サイトカインは、同様の効果と、単一のサイトカインが変数の効果（図7）を持つことができますを持つことが非常に冗長とその複数のサイトカインの多面的です。従って、正確に冷間前処理演算子（または他の生理的前処理の刺激）から神経保護作用のための生得的なサイトカイン拠点を確立するために、関連するシグナリング変数の複合解析を判定する必要があります。これは、多重化アッセイ戦略によって実現されます。これは、コールドプレコンディショニング神経保護のサイトカイン"署名"を設立します。
図6。脳内サイトカインのシグナル伝達のパワー。イラストは他のよく知ら対応の濃度に比べて脳のサイトカインの生理的濃度の巨大なシグナル伝達力を伝える。濃度は、基準点として、単一の猫のひげをはじめ、距離の逆数として表されます。ナトリウム（コショウの粒で示される10 -1 M）およびカリウム（トマトで示される10 -3 M）は、内の役割はそれぞれ約150及び3mMの、のレベルで間質脳空間に存在し、十分に認識している神経細胞の電気生理学的機能。同様に、pH（すなわち、〜10 -7 Mの水素イオンの濃度とシカゴの湖畔に沿って780メートルとして図示）とカルシウム（すなわち、7.8キロマコーミックからシカゴの湖畔に沿って衛星Googleの画像から見て示すように、〜10 -8 Mの濃度）シカゴ大学の近くにハイドパークでのプロモントリーポイントに置きます。さらに、これらの濃度以上の間隙に放出された神経伝達物質は、局所脳領域の活性に影響を与える。対照的に、サイトカインは、（地球から火星までの距離として示されている）十数万倍未満の濃度で脳の機能を変更することができます。
図7。生得的なサイトカイン経路のインタラクティブなシグナリング。サイトカインは、非常に冗長とその複数のサイトカインの多面的なものは、同様の効果を持つことができ、単一のサイトカインは、変数の効果を持つことができます。そのような多様性は、リガンド、受容体、およびリン酸化のレベルで発生する複雑な対話型のシグナリングに由来する。さらに複雑さは、セル固有の生得的なサイトカイン、受容体、および関連するリン酸化タンパク質の変化の各能力で、脳が別の細胞型から構成されているという事実から生じている。ここに例示を目的として、唯一の生得的なサイトカインシグナル伝達経路は、（免疫細胞の研究から派生）が表示されます。単純にするために、脳は生得的なサイトカインの潜在的な相互作用を示す単セル（白い線）（（IL -1α/βとしてここに呼ばれる）、IL -1αおよびIL -1β、TNF -α、IL - 6、として描かれているIFN -γとIL - 10）、受容体（IL - 1R1、TNFR1、IL-6/gp130、IFNγR、およびIL - 10R）、およびリン酸化タンパク質（すなわち、キナーゼERK1 / 2、P38（P38 - MAPK）やJNK）と転写因子（ATF - 2、NFκB、およびSTAT3）。 TNFR1を介したATF - 2を介して遺伝子発現を誘発するJNK、p38の- MAPKおよびERK1 / 2、に例えば、TNF -αシグナル。 TNF -αはまた、NFκB活性化を介して直接遺伝子発現を変化させる。示されるように一緒に、これらの転写因子の活性化は、サイトカインとその受容体の増加（矢印）と減少した（平滑末端）式を呼び起こす。重要なことは、これらの経路は、他の（例えば、IL -1β）サイトカインの一つサイトカインの変化（例えば、TNF -α）の影響の生産を示している。従って、正確に確立するために関連するシグナリング変数の冷間前処理演算子、複合解析から神経保護のためのサイトカインの塩基は決定されなければならない。これは、コールドプレコンディショニングの生得的なサイトカイン"署名"を設立します。 （画像を参照＃25のデータから、コンパイルされています。）
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、国立神経疾患研究所およびストローク（NS - 19108）、片頭痛研究財団、そしてリチャードP.クレイグへホワイト財団からの補助金によって賄われていた。さんマーシャP.クレイグは、培地およびスライス培養のメンテナンスの準備に協力した。我々は、この記事の最終版の彼女のコメントやリビジョンのためエレーナグリンベルクに感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of Slice Cultures | |||
| Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) | PICM0-3050 | ||
| Basal Medium Eagle | 21010 | ||
| Earle s Balanced Salt Solution | E2888 | ||
| Horse serum | 26050-088 | ||
| Glutamax | 35050 | ||
| Gentamicin | 15710-064 | ||
| Fungizone | 15295 | ||
| D-glucose | G8769 | ||
| BSL-1 fume hood | |||
| McIlwain tissue chopper | |||
| Teflon disks | 023-49-310-1 | ||
| Spatula | 14-373-25A | ||
| Curved iris scissors | 14091-09 | ||
| Long straight scissors | 14002-14 | ||
| Long forceps | 13-812-40 | ||
| Angled forceps | 11808-02 | ||
| Short forceps | 13-812-38 | ||
| #5 Inox forceps | 11254-20 | ||
| 2 Iris spatulae | 10094-13 | ||
| 150 x 15 mm Petri dishes | 08-757-148 | ||
| 60 x 15 mm Petri dishes | 08-757-100B | ||
| Wild M8 stereomicroscope | |||
| Gey s balance salt solution | G9779 | ||
| Blak-Ray shortwave Ultraviolet measuring meter | J-225 | ||
| 6-well Falcon culture dishes | 08-772-1B | ||
| Neurobasal | 21103 | ||
| B27 supplement | 17504 | ||
| Gem21 Neuroplex | 400-160-010 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| CO2 Analyzer | #2820 | ||
| Pre-screening for Vitality of Slice Cultures | |||
| Sytox Green | S7020 | ||
| DMIBRE inverted microscope | |||
| Cold-Preconditioning | |||
| BSL-2 Fume Hood | |||
| Excitotoxic Injury | |||
| CoolSnap fx CCD camera | |||
| Fluoroscein | F36915 | ||
| MetaMorph software | v. 7.5.04 | ||
| 100 μm deep hemacytometer | |||
| N-methyl-D-aspartate | 454575 | ||
| SigmaStat software | v. 3.5 | ||
| Co-treatments applied with Cold-Preconditioning | |||
| sTNFR1 | 425-R1-050 | ||
| Bovine Serum Albumin | A-4503 | ||
| RNA Isolation | |||
| RNAlater | AM7021 | ||
| Micro RNEasy Kit | 74004 | ||
| β-mercapt–thanol | 03446-100 | ||
| Diposable 1.5 RNAse-free Pestle | 749521-1590 | ||
| RNasin | N261A | ||
| Tris[hydroxymethyl]aminomethane | T3069 | ||
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt hydrate | #E7889 | ||
| RNA Quantification | |||
| RiboGreen Assay | R11491 | ||
| Yeast tRNA | 15401-011 | ||
| 1.5 mL centrifuge tubes | 16155500 | ||
| 96-well fluorescent assay plate | DK-4000 | ||
| 96-well fluorescent plate reader | Safire II | ||
| Quantitative PCR | |||
| iScript reverse transcription kit | 170-8891 | ||
| SYBR Green | S7563 | ||
| Platinum Taq polymerase | RNA Ultrasense 11732-927 | ||
| iCycler thermocycler | iCycler Optical Module | ||
| iCycler system software | v. 3.1 | ||
| Quantitative PCR for Microarrays | |||
| RNase Away | #7000 | ||
| RT2 First Strand Kit | C-03 | ||
| SYBR Green-based PCR mix | Specific for iCycler | PA-011 | |
| RT2 Profiler PCR Array | PARN-011A | ||
| Proteomic Assay | |||
| Cell lysis kit | 171-304011 | ||
| Microcentrifuge | Micro 7 | ||
| BSA protein stock | 500-0007 | ||
| BCA protein assay kit | 23225 | ||
| Immuno 96 MicroWell plates | 449824 | ||
| Sealing tape | 2239444 | ||
| 96-well plate reader | 1420-mulilabel counter | ||
| Bioplex Rat TNF-α cytokine assay | X0000001T | ||
| Immunostaining | |||
| 16% Paraformaldehyde | 43368 | ||
| Lysine | L-6001 | ||
| Sodium phosphate | S374-1 | ||
| Sodium periodate | S-1878 | ||
| Sodium azide | S-2002 | ||
| Hydrogen Peroxide (30%) | H1009 | ||
| Goat serum | CS 0920 | ||
| Triton X-100 | T-8787 | ||
| Staining dishes | 14511 | ||
| Plate Shaker | 3520 | ||
| #1 Filter Papers (185 mm) | 1001-185 | ||
| 3,3 -diaminobenzidine | D8001 | ||
| Dimethyl sulfoxide | D8418 | ||
| Ethanol | 111000200 | ||
| Xylene | X3S-4 | ||
| Permount mounting media | SP15-100 | ||
| Cryostat | cm3050 S | ||
| Tissue-Tek | 27050 | ||
| Fine-tip paint brush | 11806 | ||
| PAP blocking pen | 22309 | ||
| SFX signal enhancer | A31631 | ||
| ProLong Antifade | P7481 | ||
References
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