Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Strategier för Studie av Neuroprotektion från Cold-konditioneringen

Published: September 2, 2010 doi: 10.3791/2192
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurology, The University of Chicago Medical Center

Summary

Vi strävar efter att definiera neurala immun signalering ansvarig för kall-konditioneringscykel som medel att identifiera nya mål för läkemedel utvecklas för att skydda hjärnan innan skada debut. Vi presenterar strategier för sådant arbete som kräver biologiska system, experimentella manipulationer samt tekniska kapacitet som är mycket reproducerbar och känslig.

Abstract

Neurologiska skador är en vanlig orsak till sjuklighet och dödlighet i narkos och relaterade kirurgiska ingrepp som kan lindras genom utveckling av effektiva, enkla att administrera och säkra prekonditionering behandlingar. Vi strävar efter att definiera neurala immun signalering ansvarig för kall-konditioneringscykel som medel att identifiera nya mål för läkemedel utvecklas för att skydda hjärnan innan skada debut. Låg nivå pro-inflammatoriska medlare signalera förändringar över tid är avgörande för kallt förkonditionering neuroprotektion. Denna signalering är förenligt med de grundläggande principerna av fysiologiska konditionering hormesis, som kräver att irritativa stimuli når en tröskel magnitud tillräckligt med tid för anpassning till de stimuli som skydd för att bli uppenbara.

Därför kräver avgränsning av immunförsvaret signalering inblandade i kallt förkonditionering neuroprotektion att biologiska system och experimentella manipulationer samt tekniska kapacitet är mycket reproducerbar och känslig. Vår strategi är att använda hippocampus skära kulturer som en in vitro modell som nära återspeglar deras in vivo motsvarigheter med multi-synaptisk neurala nätverk påverkas av mogna och rofylld macroglia / mikroglia. Detta gliaceller tillstånd är särskilt viktigt för mikroglia eftersom de är den främsta källan av cytokiner, som är operativ i femtomolar sortimentet. Dessutom kan slice kulturer hållas in vitro i flera veckor, vilket är tillräckligt med tid att framkalla aktiverande stimuli och bedöma adaptiva svar. Slutligen kan miljöförhållanden exakt kontrolleras med slice kulturer så att cytokin signalering av kallvalsade förkonditionering kan mätas, härmade, och anpassas för att dissekera den kritiska noden aspekter. Cytokin signalering analyser kräver användning av känsliga och reproducerbara multiplexade tekniker. Vi använder kvantitativa PCR för TNF-α till skärmen för microglial aktivering följt av kvantitativ realtids-qPCR array screening för att bedöma vävnad hela cytokin förändringar. Det senare är en mycket känslig och reproducerbar sätt att mäta flera cytokin systemet signalera förändringar samtidigt. Stora förändringar bekräftas med riktade qPCR och sedan protein upptäckt. Vi sond för mjukpapper-baserade förändringar cytokin protein med multiplexade mikrosfär flödescytometrisk analyser med hjälp av Luminex teknik. Cell-specifika cytokinproduktionen bestäms med dubbel-etikett immunohistokemi. Sammantaget kan detta hjärnvävnad beredning och stil användning, kopplad till den föreslagna undersökande strategier, vara en optimal metod för att identifiera potentiella måltavlor för utveckling av nya behandlingar som skulle kunna imitera fördelarna med kallt prekonditionering.

Protocol

Sterila och aseptiska tekniker är avgörande för förberedelser, underhåll och användning av skiva kulturer under längre perioder. Dessutom är den logiska grunden för vår användning av skiva kulturer först efter 18 dagar in vitro bygger på bevis som tyder på retande och hämmande synaptisk transmission blir mest mogna och Glia (astrocyter och mikroglia) blir vilande och i överensstämmelse med deras in vivo motsvarigheter (Figur 1 ).

1. Upprättande och underhåll av hippocampus Slice kulturer

  1. Samma dag odling, balansera sterila skär i 1,1 media mL tillväxt som består av 50 ml bassubstratets Eagle, 25 ml Earles Balanced Salt Solution 23 ml hästserum, 0,5 ml Glutamax (200 mm stock), 0,1 ml gentamicin (10 mg / mL lump), 0,4 ml Fungizone (250 mikrogram / ml), 1,45 ml D-glukos (45%, 42 mm totalt).
  2. Håll sex-och brickor i en inkubator vid 36 ° C, 5% koldioxid och 95% luftfuktighet.
  3. För maximal sterilitet är odling helst göras i en filtrerad HEPA positivt tryck kulturen rum med luften också renas genom sluten ultraviolett ljus luft-rensning fläktar och iklädd en ren skyddsrock och sterila handskar sträckte sig över ärmarna laboratorierock .
  4. Förbered slice kulturer i en BSL-1 laminärt dragskåp som omfattar alla material som behövs (dvs McIlwain vävnad helikopter, relaterade teflon insatser, rakhyvel skärbladet dissektion kallt (3-4 ° C) tallrik, kirurgiska instrument och dissektion petriskålar) med hjälp av en Wild (M8) stereomikroskop.
  5. Låt kylplatta (kör från en närliggande vattenbad) för att nå 3-4 ° C temperatur i minst 30 minuter medan samtidigt exponera dissekering material för ultraviolett ljus för att ytterligare etablera sterilitet dissekering området och verktyg.
    1. Den laminärt flöde Huvan är regelbundet testas för att säkerställa att ultraviolett ljus har tillräcklig makt på bordsskivan nivå med en kortvågig ultraviolett ljus mäta meter.
  6. Använd råttungar (P8-P9 och ~ 23 g / st. Från kullar slaktas till 10 vid födseln) bedövas med 100% koldioxid i ett litet djur ruta på en aseptisk bänk bakom spiskåpa och renas genom att doppa i 100% etanol i dragskåpet, där alla efterföljande steg ska utföras.
  7. Halshugga valpar i ena halvan av en 100 mm petriskål och placera huvudet under andra halvåret, med hjälp av en ny maträtt per valp.
  8. Dissekera ut hjärnan och placera den i den nedre halvan av en 60 mm petriskål innehållande 10 ml steril kallt (3-4 ° C) Gey Balanced Salt Solution kompletteras med D-glukos till 6,5 mg / ml (dvs 7,5 ml 45 % d-glukos per 500 ml flaska Gey talet.
  9. Dissekera ut hippocampus från varje halvklotet och placera dem på en Teflon disk för McIlwain helikoptern. Sprid media bort från hjärnvävnaden med hjälp av en iris spatel för att förhindra att skära hjärnan sektioner från att fastna i kniven.
  10. § den hippocampi vinkelrätt över långa axeln med McIlwain kompostkvarn, med snittjocklek inställd på 350-400 ìm.
  11. Raskt tvätta nyklippt skivor off av teflon insatser och i den övre halvan av en 60 mm petriskål med kallt (3-4 ° C) Gey Balanced Salt Solution med 6,5 mg / ml D-glukos med hjälp av en en ml pipett.
  12. Inspektera skivor under stereomikroskop för en intakt dentate gyrus och pyramidal cellager.
  13. Placera försiktigt största skivor på ett sätt (tre per inlägg, och 12 skivor / valp) och underhålla under normala inkubationstiden förhållanden i en inkubator rengöras var sjätte månad och kalibreras var tredje månad med en infraröd Koldioxidanalysatorn och termometer noggrannhet på en decimal.
  14. Uppdatera tillväxt medier i kultur rätter varje 3-4 dagar in vitro med en BSL-2 huva och steril teknik.
  15. Efter 7 dagar in vitro, byt media med 1,1 mL serum-fria medier (SFM) bestående av 97 ml Neurobasal, 2 mL B27, 0,5 ml Glutamax (200 mm), 0,1 ml askorbinsyra (0,5 M) och 0,68 ml D- Glukos (45%, 42 mm totalt).

2. Pre-skärm livskraft Slice kulturer

  1. Alikvotera Sytox Grön lager (10 mikroliter) och förvara vid -20 ° C.
  2. Späd Sytox lager till 500 Nm arbetar i serum-fri tillväxt medier (dvs 10 mikroliter i 100 ml media). Förvara Sytox medier vid 4 ° C och i upp till en vecka.
  3. Placera 1,1 mL Sytox per brunn i 6-bra kultur rätter och värm till 36 ° C vid 5% koldioxid under en tillräckligt lång period (dvs, vilket framgår av brist av kondensat på kultur rätter).
  4. Under tiden kan en UV-lampa (dvs en fluorescerande ljuskälla med ett FITC-filter) som drivs via en stabiliserad strömförsörjning för att säkerställa en enhetlig ljusintensiteten värmas upp till temperatur i minst 20 min.
  5. Placera slice kulturer (18 dags in vitro) i Sytox-media i 10 min och sedan tillbaka till hållbart skogsbruk för att screena för irreversibla CA1 pyramidal lager skada.
  6. Visa kulturer på en aseptisk ytan av ett inverterat mikroskop, undersöks under 5x förstoring.
  7. Acceptera kulturer med färre än 30 Sytox positiva celler i CA1 området.

3. Cold-Konditionering

  1. Placera 1,1 ml av ett hållbart skogsbruk i 6-bra kultur rätter. Låt kyls medier (t.ex. 30 ° C) för att balansera i en inkubator (5% koldioxid och 95% luftfuktighet) i minst 20 minuter före användning. Avsaknad av kondensat på kultur rätter indikerar att tillräcklig tid för jämvikt har inträffat.
  2. Överför skär skiva kultur kyls medier (1,1 ml / brunn) plattan hålls vid 30 ° C och inkubera i 90 minuter med steril teknik i BSL-2 dragskåp.
  3. Placera skiva kulturer tillbaka till normala SFM under normala inkubationstiden förhållanden i 24 timmar, återigen med hjälp av steril teknik via en BSL-2 dragskåp.

4. Excitotoxic Skada

  1. Börja skiva kultur experimentell användning prescreen genom att exponera till Sytox media för 20 min.
    1. Förvärva enskilda skiva bilderna med skivor kvar på en inriktning som liknar den som används för prescreen (bakgrundsbilder). Detta görs genom att placera ett märke till vänster och två poäng till höger med tuschpenna på "10" och "två" klockan på varje insats. Denna manöver underlättar med samma intresseområde form för varje kultur uppsättning av bilder.
  2. Samtidigt, slå på UV-lampa källan (vid reglerat strömförsörjning) och CCD-kamera för minst 20 min så de varm temperatur.
  3. Sedan kalibrera CCD-kamera med en fluoroscein standard.
    1. "Rensa" CCD genom att utsätta för ljus i 50 cykler, om inte ett automatiskt kalibrera CCD-kameran används. Vi har etablerat ett program inom metamorfa att rensa våra Cool Snap kamera används för att skada kvantifiering.
    2. Plats 10 mikroliter av fluoroscein i 90 mL PBS (10 mM fosfatbuffert, 150 mM NaCl på 7,3 pH) och skaka.
    3. Pipettera 10 mikroliter av fluoroscein blandningen på en 100 ìm djupt hemacytometer.
    4. Justera fullständig bild intensitet 1000/4096.
  4. Samla bakgrundsbilder av slice kulturer för att verifiera att kalla förkonditionering inte orsaka skada (dvs kasta kulturer med ≥ 250 CA1 område av intresse intensitet).
  5. Förbered brickor med NMDA medier.
    1. Förbered 10 lösning mM lager av NMDA minst varje vecka.
    2. För excitotoxic skada, späd NMDA till 20 50 nm i hållbart skogsbruk och utjämna till normala inkubation under minst 20 min.
  6. Använda BSL-2 huva och steril teknik, sätts in i NMDA-media i 60 min under normala inkubationstiden förhållanden.
  7. Skölj NMDA off av insatser genom att doppa varje in tre gånger i tre separata 60 mm rätter varje innehållande 10 ml Neurobasal värmts till 36 ° C. Använd inte mer än tre skär för varje uppsättning av tre 60 rätter mm tvätt.
  8. Återgå kulturer till normala inkubationstiden förhållanden.
  9. Samla skador bilder 24 timmar efter exponering för NMDA.
    1. Kalibrera kameran med fluoroscein standard som beskrivs ovan.
    2. Placera kulturer i Sytox media för 20 min.
  10. Kvantifiera Skador:
    1. Använda metamorfa program, rita en AOI runt CA1 regionen.
    2. Mät intensitet valda regionen för "skada".
    3. Kopiera och klistra in AOI från "skada" till "bakgrunden" bild.
    4. Ange värden från "skada" och "bakgrund" i Excel.
    5. Kvantifiera "täljare-bakgrund" för kontroll och Cold-konditioneras kulturer.
    6. Använda statistisk programvara (t ex SigmaStat), köra lämpliga statistiska test för att jämföra skador experimentell grupp (er) jämfört med en kontrollgrupp, som alltid bör ingå i varje experimentell köra.
    7. Obs: Om skadan är låg i en dag efter skadan bilder, utföra kontrollbesök experiment för två tre dagar. Skydd i kulturer kan maskeras på grund av brist på känslighet för skada (Figur 2).
    8. OBS: Frågan om "skydd" fick oss att flytta till mätning av skada nivåer och inte nyckeltal för alla jämförelser (Figur 3).

5. Samarbetet behandlingar Appliceras med Cold-konditionering

En viktig fördel med slice kulturer är att miljöförhållandens kan kontrolleras exakt. Det innebär att cytokin signalering från kall-konditionering kan mätas, härmade, och anpassas för att dissekera den kritiska noden aspekter.

  1. Rekombinanta (t.ex. agonist) proteiner och neutraliserande (t.ex. antikroppar eller lösliga receptorn) proteiner kan användas för att härma och modulera respektive cytokin signalering.
  2. I allmänhet är dessa proteiner beredas och lagras som alikvoter vid -20 ° C för användning inom sex månader för att säkerställa tillräcklig bioaktivitet.
  3. Här beskriver vi exemplarisk användning av TNF-α signalering upphävs med löslig TNF receptor 1 (sTNFR1).
    1. Bered sTNFR1 hos 0,1% bovint serumalbumin i PBS för att ett lager av 50 mikrogram / ml, uppmätt i 20-50 mikroliter mängder och förvara vid -20 ° C.
    2. För användning, späd sTNFR1 till 200 ng / ml i slice kulturer tillväxt media värmts till 36 ° C och placera skiva kulturer i sTNFR1-media för 20 min före kall-konditionering.
      1. OBS: För att minska variansen är det bäst att späda 200 ng / ml sTNFR1 i en stor volym av tillväxt media (dvs 1:250 utspädning från 50 mikrogram / ml sTNFR1 lager i 10 ml tillväxt medier kräver 40 mikroliter sTNFR1) jämfört lägga sTNFR1 direkt till varje brunn i skålen (4,4 mikroliter per 1,1 ml media).
    3. Späd sTNFR1 till 200 ng / ml i media och placera 1,1 ml i varje sätter väl. Låt media för att utjämna till 30 ° C i minst 20 minuter innan du utsätter slice kulturer att kalla förkonditionering i 90 minuter enligt ovan.
    4. Placera slice kulturer tillbaka vid 36 ° C med sTNFR1 som finns i media.
    5. 24 timmar senare utsätter kulturer Sytox media för 20 min som tidigare beskrivits och samla bakgrundsbilder för att verifiera att kalla förkonditionering inte skada kulturer.
  4. Kvantifiera data som beskrivs ovan.
  5. Uppdatera media med komponenter var 3-4 dagar in vitro.

6. Omedelbar och Fördröjd Excitotoxic skada efter Cold-konditioneringsfasen

  1. Omedelbara skador med kall-konditionering.
    1. Utför kall-konditioneringen enligt ovan.
      1. Efter kalla konditioneringsfasen återgå kulturer till det normala inkubation i 20 min.
      2. Sedan utsätter kulturer 20-50 mikroM NMDA skada i en timme.
      3. Skölj kulturer tre gånger enligt ovan och återgå till normal inkubation.
      4. Efter 24 timmar, förvärva skada foton som beskrivits ovan.
  2. Fördröjda effekter av kallvalsade prekonditionering.
    1. Utför kall-konditioneringen enligt ovan.
    2. Exponera kulturer NMDA skada 24 timmar senare som beskrivs ovan.
    3. Att fortsätta förvärva skador bilder för upp till tre dagar efter den första kalla prekonditionering att övervaka skyddet.

7. RNA-Isolering

Följande genexpression förfaranden skalas för en enda skiva kultur.

  1. Överföring skiva kulturer från tillväxt media och normala inkubationstiden till 3 ml RNAlater i 6-bra kultur rätter att stabilisera RNA. Förvaras vid 4 ° C i upp till tre dagar i väntan på bearbetning som beskrivs nedan.
  2. Lyft försiktigt skära kulturen ur insatsen med en fin spets pensel och lägg i 1 ml kallt (4 ° C) PBS i en 1,5 ml (DNase, RNase och DNA-fri) mikrocentrifugrör.
  3. Centrifugera prover för 30 sek och ta bort PBS supernatanten.
  4. Förvara proverna vid -80 ° C.
  5. Att isolera RNA från slice kulturer (~ 250 ng / st.), Prover tina på is.
  6. Isolera RNA med hjälp av Qiagen MicroRNeasy kit via följande procedurer som beskrivs närmare och anpassas från RNeasy Micro handboken (Qiagen).
    1. Placera 350 mikroliter Buffer RLT (som innehåller 10 mikroliter β-merkaptoetanol per ml) i varje mikrocentrifugrör innehåller en bit kultur.
    2. Homogenisera proverna genom att vortexa i 30 sek. Mal sönder vävnad, om det behövs (dvs vävnad pellets fortfarande syns) med en disponibel mortelstöt tills helt homogeniseras i buffert RLT.
    3. Plats 350 mikroliter av 70% etanol i lysat mixen och pipett för att blanda.
    4. Överför homogenatet till en spin kolumn och placera i en samling rör (både spinn kolumnen provröret tillhandahålls av Qiagen).
    5. Centrifugera provet i 15 sek vid max hastighet. Behåll kolumnen.
    6. Tvätta spin kolonnen genom att tillsätta 350 mikroliter buffert RW1 plus centrifugera i 15 sek vid max hastighet. Släng buffert.
    7. Späd 10 mikroliter av DNase I lager i 70 mikroliter Buffert FUD ge 80 mikroliter totala volymen. Pipettera försiktigt för att blanda inte virvel. Förbered 80 mikroliter av utspädd DNase lager per prov. Inkubera vid rumstemperatur i 30 min.
    8. Tillsätt 350 mikroliter Buffert RW1 att prova spinna kolumnen och centrifugera i 15 sek. Kassera provröret.
    9. Med hjälp av en ny kollektion tub, lägga 500 mikroliter Buffer RPE för provtagning och centrifugera i 15 sek och kasta buffert.
    10. Plats 500 mikroliter av 80% etanol på prov och centrifugera i 2 min. Kassera provröret.
    11. Torka spin kolumner genom att centrifugera i 5 min vid max hastighet med slang lock öppen, kasta Uppsamlingsrör och överföra snurra kolumn i en 1,5 ml provrör levereras av satsen.
    12. Att samla isolerade RNA, plats 14 mikroliter RNase-fritt vatten i mitten av spin kolumnen membranet. Centrifugera i en minut och samla vätska.
    13. Tillsätt 2 mikroliter av RNasin (utspätt till 1 U / mikroliter i TE buffert) och förvara vid -80 ° C. TE buffert består av 10 mM Tris (tris [hydroxymetyl] aminomethane), 1mm EDTA (Etylendiamintetraättiksyra dinatriumsalt hydrat) på 8,0 pH.

8. RNA Kvantifiering

  1. Notera: RNasin inte störa RiboGreen analysen.
  2. Späd RiboGreen 1:200 i RNase-fria TE buffert på följande sätt.
    1. TE (ml): 1, Ribogreen (mikroliter): 5;
    2. TE (ml): 4; Ribogreen (mikroliter): 20;
    3. TE (ml): 6; Ribogreen (mikroliter): 30.
  3. RNA-standarder bereds på följande sätt.
    1. Jäst tRNA används som RNA-standard. tRNA lagras (-20 ° C) som 1 mg / ml i TE buffert.
    2. Späd 1 mg / ml lager 1:100 i TE buffert, med hjälp av (DNase, RNase och DNA gratis) 1,5 rör ml mikrocentrifug att producera en 1 mikrogram / ml arbetar standarden.
    3. Förbered standardkurvan direkt i en 96-håls fluorescerande analys plattan genom att lägga till TE buffert spädningsvätska först, sedan tillsätta den rätta mängden av 1 mikrogram / ml standard i TE bufferten redan på plattan brunnar som visas i tabellen här intill. Gör två brunnar för varje standard enligt följande.
      1. Vol. av std. (Mikroliter): 100; Vol. av TE (mikroliter): 0; RNA i bra (NG): 100;
      2. Vol. av std. (Mikroliter): 80, Vol. av TE (mikroliter): 20; RNA i bra (NG): 80;
      3. Vol. av std. (Mikroliter): 60, Vol. av TE (mikroliter): 40, RNA i bra (NG): 60;
      4. Vol. av std. (Mikroliter): 40, Vol. av TE (mikroliter): 60; RNA i bra (NG): 40;
      5. Vol. av std. (Mikroliter): 20, Vol. av TE (mikroliter): 80; RNA i bra (NG): 20;
      6. Vol. av std. (Mikroliter): 0; Vol. av TE (mikroliter): 0; RNA i bra (NG): 0.
  4. Analysen är beredd på följande sätt.
    1. Tillsätt 99 mikroliter av TE buffert i varje av provet brunnarna i 96 brunnar. Det mest effektiva sättet att göra detta är att använda en flerkanalspipett.
    2. Tillsätt 1 mikroliter av RNA till experimentella provbrunnar.
    3. Tillsätt 100 mikroliter av den utspädda RiboGreen till varje brunn med flerkanalspipett och kör med en eller två slag av pipett.
    4. Läs plattan på en fluorescerande plattläsaren vid 480 nm excitation och 520 nm utsläpp.
    5. Konstruera en kalibreringskurva med hjälp av Microsoft Excel med uppmätta fluorescensen intensiteter av RNA-standarder.
    6. Beräkna RNA-halter i prover med den resulterande linjära ekvationen från de normer kurvan.

9. SYBR Grön Kvantitativ PCR

  1. PCR-förfaranden bäst i ett rent område reserverat speciellt för arbete med RNA (Figur 4).
    1. Sanera området och tillhörande lab utrustning från eventuella DNA föroreningar och RNas aktivitet innan användning med UV-ljus, 10% blekmedel eller RNase Away.
    2. Använd handskar genom alla procedurer.
    3. Använd RNas fritt vatten för alla förfaranden som följer med kitet. Använd inte DEPC-(diethylpyrocarbonate) renat vatten.
    4. Stäng alla PCR-relaterade rör direkt efter användning för att fördröja aerosol kontaminering av främmande DNA.
  2. Utveckla och karakterisera grundfärg för mRNA mål (n) av intresse. Dessa metoder beskrivs i den kompletterande Metoder för Hulse et al. Journal of Neuroscience, 2008 13.
  3. cDNA produceras från 30 till 200 ng totala RNA genom omvänd transkription med iScript.
    1. Valet av start-RNA mängden bestäms av den totala mängden RNA som finns med målet att utföra RT-PCR-analys på en del av provet (dvs 10% -20% av det totala antalet).
    2. Resterande större del av RNA sparas för framtida analys.
    3. Den iScript kit använder en blandning av slumpmässiga hexamerer och oligo-dT primer, och en modifierad MMLV omvänt transkriptas i en total volym av 20 mikroliter.
    4. Omvänd transkription intäkterna för 25 ° C i 30 minuter följt av 42 ° C i 50 min, och omvänt transkriptas därefter denatureras vid 85 ° C i 5 min.
    5. Späd cDNA i TE buffert till en slutlig koncentration av 0,4 ng / mikroliter i förhållande till start RNA kvantitet.
  4. SYBR Grön PCR-baserad strategi används för att förstärka cDNA.
    1. PCR-reaktioner övervakas i realtid genom att övervaka SYBR Grön bolagsordningen.
    2. Den 50 mikroliter reaktioner innehåller 3 mM MgCl 2, 200 mikroM dNTPs, 15 pmol vardera framåt och bakåt grundfärger, 1 mikroM fluorescein, 1x SYBR grön färg, 10 mikroliter (4 ng) slice kultur cDNA och 1,25 U Platinum Taq-polymeras som en reaktion buffert bestående av 50 mM KCl och 10 mM Tris, 8,3 pH.
    3. PCR utförs med hjälp av iCycler termocykler som kan samla in data i realtid.
    4. Cykling parametrar består av 15 sek denaturering (95 ° C) följt av 30 sek glödgning / förlängning (60 ° C) upprepas 45 gånger.
    5. Optiska mätningar görs under glödgning / förlängning steg och Ct-värden bestämdes med hjälp av iCycler systemprogramvaran.
    6. cDNA för cytokin mål av intresse och β-aktin används för att konstruera standard kurvor.
      1. Kopiera nummer bestäms utifrån molekylvikt och massa plasmiden cDNA.
      2. Standardkurvor av antal kopior / massa är uppbyggda och ingår i varje analys.
      3. Ct-värdena för varje cDNA spädning används för att bestämma det antal kopior v. Ct kurva.
    7. Cytokin-och β-aktin antal kopior gränsvärden fastställs för prover med standard kurvor.

10. Kvantitativa PCR för Microarrays

Kvantitativa realtid qPCR array screening är en mycket känslig och reproducerbar sätt att söka efter låg nivå inflammatoriska förändringar medlare uttryck.

  1. Den RT2 Profiler PCR-uppsättning från SABiosciences används för inflammatorisk uttryck medlare genen förändras, med följande steg beskrivs närmare av tillverkaren.
  2. Analysen använder 0,1-1,0 mikrogram RNA. Vi använder lokala slice områden (t ex CA1 som ger ~ 250 ng totala RNA från två samlingsprover) eller hela enstaka skivor som innehåller lika mycket av det totala RNA.
  3. Prov och kontroll RNA är omvänd transkriberas till cDNA med hjälp av en första del kit (t.ex. # C-03).
    1. Den resulterande cDNA blandas med SYBR Green-baserade PCR-mix (# PA-011) och 25 mikroliter aliquotted i varje av de 96 brunnar av PCR-array plattan (som mäter 84 unika experimentella gener och 16 gener städning).
    2. En rad plattan är förberedd för det experimentella provet och en andra platta är förberedd för kontrollen.
    3. Obs: SYBR Gröna Master Mix från tillverkaren är termocykeln-specifika.
  4. Termisk cykling sker med hjälp av en iCycler med en 40 cykel protokoll som består av en denaturering steg i 15 sek vid 95 ° C följt av en förlängning steg i en min vid 60 ° C. Optiska data samlas in under förlängningen steg. Termisk cykling följs av smälta kurva analys skanna 55-95 ° C temperaturområde i 0,5 ° C steg.
  5. Den relativa uttrycket av gener i behandlade och kontroll plattor beräknades med 2 - ΔΔCt metod att använda som Excel-baserad mjukvara och uttrycks som en trefaldig ökning eller minskning jämfört med kontrollgrupper.
  6. Gener med två-faldig ökning eller minskning i uttryck anses för vidare utvärdering.
  7. Gener som identifierats från PCR-array screening (t.ex. med # Pärn-011A för kallt förkonditionering) är ytterligare confirmeD med qPCR.
    1. PCR arrayer identifiera vilka gener som regleras som svar på stimuli.
    2. I exemplet med kallt konditioneringsfasen identifierade vi IL-11-genen som positivt regleras vid kyla-konditionering.
    3. Nästa steg i analysen är att bekräfta att den nyligen identifierade genen är reglerad i slice kulturer använder qPCR analysen ovan.

11. Multiplexade mikrosfär Flödescytometriska proteomik-analys

  1. Exponera slice kulturer att kalla konditioneringen enligt ovan.
  2. Harvest slice kulturer totalprotein analysen.
    1. Lyft försiktigt skivor av insatsen med en fin spets pensel och lägg i 1 ml kallt (4 ° C) PBS.
    2. Centrifugrör och ta bort PBS bort skiva kulturer. Placera på torris fram till skörden är klar.
    3. Förvara rören vid -80 ° C.
  3. Homogenisera prover slice kultur för att utföra en total protein analys.
    1. Förbered buffert cellys för homogenisering.
      1. Enligt tillverkarens anvisningar (Bio-Rad), lägg proteashämmare till 5 ml lyseringsbuffert och ställ åt sidan på is.
    2. Häll 100 mikroliter av lyseringsbuffert på skivdel kulturer och skaka skivor genom att pipettera upp och ner fem gånger med en 100 mikroliter pipettspets skära upp till 1 mm.
    3. Skaka prov på en tallrik shaker vid 4 ° C i 20 minuter.
    4. Centrifugera prover 13.000 rpm i 15 minuter vid 4 ° C.
    5. Överför supernatanten till ett rent rör och ställ åt sidan på is.
  4. Genomför totalt protein analys.
    1. Förbered BSA (bovint serumalbumin) protein standarder.
      1. Rekonstituera lager BSA med ultrarent vatten enligt tillverkarens anvisningar.
      2. Förbered protein standarder som sträcker sig från 0000 till 1000 mikrogram / ml, utspädd i lyseringsbuffert.
    2. Beräkna volymen av att arbeta reagens som behövs enligt kit instruktioner.
      1. Till exempel (åtta standarder + 18 okända prover) x (två replikat) x (200 mikroliter arbetar reagens som krävs per prov) = 10,4 ml av den totala volymen av att arbeta reagens som krävs för att lasta på en 96 väl mikroplatta (t.ex. mikrosfär flödescytometrisk analys , se nedan).
      2. Vid blandning Reagens A med Reagens B kan vissa grumlighet förekomma, men bör försvinna inom kort.
    3. Belastning 10 mikroliter av standarder och prover på mikrotiterplatta.
    4. Belastning 0,2 ml arbetar reagens i brunnar.
    5. Täck mikrotiterplatta med gängtejp och skaka på tallriken shaker i 30 sek.
    6. Inkubera mikrotiterplatta vid 37 ° C i 30 min.
    7. Cool mikrotiterplatta till rumstemperatur (ca 10 min) innan behandlingen om en plattläsaren vid 595 nm våglängd.
    8. Konstruera en kalibreringskurva med hjälp av Microsoft Excel med uppmätta absorbansen för BSA standarder.
    9. Beräkna protein halterna i prover med den resulterande linjära ekvationen från de normer kurvan.
      1. Späd alla prover till den lägsta koncentrationen uppmätt med lyseringsbuffert och förvara vid -80 ° C.
  5. Utför en-Plex och multiplex cytokin vävnad (eller vätska) analyser som beskrivs i fullständig detalj i referenser # 12 och 16.

12. Immunohistokemi

  1. Fix kulturer i 24 timmar med PLP fixativ bestående av 10 ml 16% paraformaldehyd, g lysin, 0,42 g natriumfosfat, och 0,17 g natrium periodate, 1,096 fylld till en total volym på 80 ml med ultrarent vatten (fixativ är 6,2 pH).
    1. Vi finner att PLP fixeringsvätska är en skonsam fixativ som tillåter detektion av lågaktivt immunfärgning som annars inte skulle vara uppenbart med andra fixeringsmedel.
    2. Kulturer är fasta i 24 timmar och sedan överföras med en fin pensel till PBS som innehåller natriumazid (100 mg / L).
  2. Ljusa fält immunfärgning av flytande hel skiva kulturer sker enligt följande med alla steg kopplat till skakningar vid ~ 50 rpm.
    1. Tvätta skiva kulturer i 3 mL PBS tre gånger i 10 min.
    2. Släcka slice kulturer i 0,3% H 2 O 2.
      1. Späd 30% H 2 O 2 stamlösning i PBS.
    3. Tvätta skiva kulturer i PBS tre gånger, 10 min vardera.
    4. Blockera slice kulturer i en timme vid rumstemperatur i 3 ml blockerande lösningen i sex brunnar som består av 10 ml get serum, 0,75 ml Triton X-100, och 89,25 ml PBS.
      1. Serum för den blockerande lösningen skulle komma från samma art som den sekundära antikroppen togs upp.
    5. Inkubera slice kulturer över natten i primära antikroppen spätts i blockerande lösningen vid 4 ° C.
      1. Den maximala volymen av primär antikropp lösning för små glas Pyrex maträtt brunnar bör vara 0,3 ml högre volymer tenderar att köra över kanten av plattan.
      2. Placera skålen i en fuktig sluten behållare. Vi täcker inte skålen med tillhörande film sedan sektioner kan vara spunnet på den överliggande filmen och förlorade för ytterligare workup.
      3. Justera skaka hastigheten på plattan shaker att bara tillräckligt hög för att cirkulera skivor i antikroppen lösningen.
    6. Ta bort skivor från glasplatta och tvätta i PBS tre gånger i 10 min per tvätt.
    7. Inkubera skivor i sekundära antikroppen i rumstemperatur i en timme medan skakning.
      1. Använd litet glas Pyrex rätter att ladda 0,3 ml sekundär antikropp lösning.
    8. Tvätta tre gånger i PBS, 10 min per tvätt.
    9. Visualisera färgning med 3'-Diaminobenzidin (DAB).
      1. Lös upp 30 mg DAB i 3 ml dimetylsulfoxid.
      2. Filtrera DAB med hjälp av två # 1 filterpapper och tvätta med 54 ml PBS.
      3. Omedelbart före användning, tillsätt 20 mikroliter av 30% H 2 O 2.
      4. Inkubera kulturer i DAB-lösning i 5-7 minuter i rumstemperatur.
      5. Obs: DAB är ett cancerframkallande och måste kasseras på lämpligt sätt. Kassera alla DAB-lösningar i en markerad behållare som lagras i ett dragskåp och placera alla rätter i blekmedelslösning att avaktivera DAB. Alla DAB-lösningar bör på sikt kasseras via institutionella Safety Office.
    10. Tvätta skiva kulturer i PBS tre gånger i 10 min vardera.
    11. Våt montera slice kulturer att gelatin (eller silan) belagda objektglas med 100 mikroliter diskmedel löst i destillerat vatten. Torka över natten i rumstemperatur.
      1. Undvik att använda bilden warmers stark värme kan orsaka sprickbildning i kulturer monterade i bilder.
    12. Torka glider genom en serie graderade etanol (50, 75, 95, 95, 100, 100%) i 30 sekunder vardera.
    13. Tydliga bilder med xylen fyra gånger på tio minuter vardera.
    14. Använda ett glas pasteurpipett, plats 0,1 mL montering medier på toppen av bilden och försiktigt täckglas för att undvika att luftbubblor bildas. Torka över natten i rumstemperatur.
  3. Fluorescerande immunfärgning.
    1. § slice kulturer till 20 mikrometer tjockt med en kryostat.
      1. Justera kryostat inställningarna till -16 ° C i innertemperatur, och -12 ° C för objektets temperatur.
      2. Placera en liten mängd vatten på metall chuck med en pasteurpipett och frysa på torris.
      3. Applicera ett tunt skiva lager av vävnad-Tek media ovanpå frysta chuck.
      4. Låt chuck att frysa och jämvikt till kryostat kammare temperatur.
      5. § Tissue-Tek media för att skapa en tillplattad yta som lämpar sig för om slice kulturer platt.
      6. Observera riktningen på chucken medan sektionering detta ger en konsekvent vinkel för sektionering som förhindrar montering media från att falla av chucken.
      7. När frysta, ta chuck ut och placera i en hållare. Med hjälp av en metall spatel och en fin spets pensel, skjut en bit kultur på spatel och överföra över tillmitten av platta lager av vävnad-Tek media på chucken.
      8. Lägg ett tunt lager av Tissue-Tek media över monterad skiva kultur och frysa vid kammare temperatur i minst 10 min.
      9. Med "trim"-knappen aktiveras, avsnitt övre lager av vävnad-Tek media tills bit kultur är synlig.
      10. Växla från "trim" till "avsnitt" förinställd på 20 mikrometer.
      11. Pick-up 20 ìm sektioner med gelatin-belagda bilder som rumstemperatur och torr glider över natten.
      12. Tissue-Tek media kommer att synas på bilderna, men löser sig i PBS tvättar.
    2. Immunfärgning.
      1. Tvätta objektglasen i PBS tre gånger i 10 min vardera.
      2. Släcka i 0,3% H 2 O 2 i 15 min i rumstemperatur, skaka.
      3. Tvätta objektglasen i PBS tre gånger i 10 min vardera.
      4. Använda SFX signal förstärkare, applicera några droppar Komponent A direkt på avsnitten om bild och inkubera i 30 minuter i rumstemperatur i en fuktig kammare.
        • Inkubation med Komponent A ersätter blockerar steg med 10% get serum lösning som utförs i ljusa fält immunohistokemi.
      5. Inkubera objektglasen i primära antikroppen späds i 0,75% Triton X-100 i PBS i två timmar vid 37 ° C.
        • Applicera primära antikroppen lösningen direkt till toppen av diabilder och inkubera i fuktig kammare för att förhindra avdunstning.
        • Ta inte med serum i någon av de antikroppar lösningarna bara använda PBS och Triton X-100.
      6. Tvätta objektglasen i PBS tre gånger i 10 min vardera.
      7. Inkubera i sekundär antikropp i en timme i rumstemperatur och skydda bilderna från ljus.
        • Centrifugera alla lysrör sekundära antikroppar i 20 minuter för att förhindra varje aggregat kommer in i antikroppen lösningen.
        • Förbered antikropp spädningar med 0,75% Triton X-100 i PBS.
      8. Tvätta objektglasen i PBS tre gånger i 10 min vardera.
      9. Doppa objektglasen gång i destillerat vatten för att tvätta bort salter från PBS.
      10. Torr diabilder över natten i rumstemperatur, täckt från ljus.
      11. Täckglas bilder med Förläng Antifade medier.
        • Tina Komponent A i mikrovågsugn i 5-10 sekunder och tillsätt ca 1 ml till en flaska med komponent B. Blanda ihop med en Pastuer pipett försiktigt så att inte introducera luftbubblor i lösningen.
        • Centrifugera i 5 minuter vid max varvtal för att ta bort bubblor.
        • Applicera ett tunt lager Förläng media till toppen av bilden med hjälp av en Pastuer pipett noga med att undvika att skapa några luftbubblor.
        • Placera försiktigt locket glida ovanpå bilden och torka över natten, täckt från ljus.
      12. Dubbelklicka på etiketten fluorescerande immunfärgning (Figur 5).
        1. Utför fluorescerande immunfärgning som beskrivits ovan, förutom späd både primära antikroppar i samma inkubation lösning.
        2. Späd alla sekundära antikroppar i samma lösning och inkubera enligt ovan.
        3. Serial inkubationstid med två antikroppar resulterat i minskat immunfärgning.

13. Representativa resultat

Figur 1
Figur 1. Utseende av hippocampus skiva kulturer och mikroglia. Den vänstra bilden visar en typisk mogen (dvs 21 dagar in vitro) hippocampus slice kultur fläcken med Neun (grön) för att illustrera cytoarchitecture av de viktigaste nervceller. Pyramidala nervceller visas i områden CA1 och CA3 och bucklaåt gyrus (GD) nervceller till vänster. Skala bar är 250 ìm. Den högra bilden kommer från CA1 området och visat på högre effekt för att illustrera grenade kvalitet vilande mikroglia inom mogna slice kulturer. Celler var märkta med microglial ytan markör, CD11b. Skala bar med 50 mm.

Figur 2
Figur 2. Kall-prekonditionering neuroprotektion i hippocampus slice kulturer. Kulturer inkuberas med Sytox Green, en fluorescerande märkt döda celler markör. På översta raden redovisas bluff kontroll kulturer och den nedersta raden visar skivor utsätts för 28 ° C i 90 min. Vänster hand, pre-skärmbilder visar inga CA1 skada. Relativ skada färgkalibrering skalan visas i övre vänstra bilden. Mellersta raden bilder visar relativ skada bit kultur 24 timmar efter exponering för 20 mikroM NMDA. Observera att falska kontroll skadan är större än av kulturer utsätts för kyla-konditionering (CP). Traditionellt kulturer sedan utsätts för 20 mikroM NMDA över natten för att maximera CA1 neuronala skador nivåer och relativ skada CP v. bluff, noteras som en andel av skada / maximal skada. Kan dock exponering för maximal skada stimuli inte vara tillräckligt för att övervinna neuroprotektion under konditioneringsfasen. Därför användning av förhållandet mellan skada / maximal skada kan inte korrekt återspeglar neuroprotektion under konditioneringsfasen. Detta är uppenbart i den högra bilder som visar CP maximala nivåer är mindre än de falska kontroller.

Figur 3
Figur 3. Schematisk illustrerar nyttan av att använda inledande, första dagen mätningar för att kvantifiera skador nivåer i kallt förkonditionering experiment. Som nämnts ovan fann vi att användandet av nyckeltal (skada / maximal skada) skulle kunna skymma neuroprotektion från kall-konditioneringen. Detta kan ses från schemat till vänster där simulerade skada visas i rött och att efter kalla prekonditionering i blått. En dag efter NMDA exponering kallt konditioneringen visar en relativ "3" skadenivån v. falska ("5") kontroll, i överensstämmelse med 40% neuroprotektion. Men om ett traditionellt format med hjälp av nyckeltal (dvs skada / maximal skada) används, finns inget skydd uppenbar [dvs (5 / 10) = 50% för bluff V. (3 / 6) = 50% för kall-prekonditionering ].

Figur 4
Figur 4. Typial qPCR Resultatet visas. Övre kurvan RNA antal kopior v. tröskeln cykel för PCR-amplifiering visar kontroller (blå) och experimentella prov (röd). Nedre bilden visar typiska förstärkning profiler för fyra prover (svart, grön, gul och lila). Lägg märke till senare Ct tröskeln cykler (markerad med orange linje) sker vid 26,0, 29,5, 31,0 och 32,5.

Figur 5
Figur 5. Dubbelklicka på etiketten immunfärgning används för att bekräfta qPCR och qPCR resultat samling En skiva kulturen behandlas för IL-11 (röd) och Neun (grön, markerar nervceller). Att söka efter den cellulära uttrycket lokus av IL-11. Observera att vissa pyramid nervceller (pilarna) visar IL-11 och Neun färgning (gul), medan några mindre celler (pilar), antas vara astrocyter, visar endast ökat IL-11 färgning (röd).

Discussion

Två fundamentalt viktiga begrepp viktiga för beskrivningen av den cytokin signalering system som deltar i kall-förkonditionering neuroprotektion illustreras i figurerna 6 och 7. Först cytokiner är extremt låga koncentrationer signalmolekyler i normal hjärna. Ändå fysiologiska cytokin koncentration förändringar har en enorm potential att förändra hjärnans struktur och funktion (dvs, fenotyp) på grund av deras förmåga att förändra genuttryck (Figur 6). Dessutom cytokiner är mycket redundanta och pleiotropa i att flera cytokiner kan ha liknande effekter och en enda cytokin kan ha olika effekter (Figur 7). Därför att exakt fastställa medfödda cytokin-baser för neuroprotektion från kall-konditioneringen (eller andra fysiologiska konditioneringsfasen stimuli), sammansatt analys av relaterad signalering variabler skall bestämmas vara. Detta sker genom multiplexering analys strategier. Detta kommer att fastställa cytokin "signaturen" av kallvalsade prekonditionering neuroprotektion.

Figur 6
Figur 6. Effekt av hjärnan cytokin signalering. Illustrationerna förmedla den enorma signalerar makt fysiologiska koncentrationer av hjärnan cytokiner jämfört med halterna av andra välkända motsvarigheter. Koncentration är representerade som inversen av avståndet, börjar med en enda katt morrhår som referenspunkt. Natrium (10 -1 M illustreras med en nypa peppar) och kalium (10 -3 M illustreras av en tomat) finns i interstitiell hjärnan utrymme på nivåer runt 150 och 3 mm, respektive, och har väl erkänt roller i neural cell elektrofysiologiska funktion. Likaså pH (dvs ~ 10 -7 M nivåerna av vätejoner och illustreras som 780 meter längs Chicagos strand) och kalcium (dvs ~ 10 -8 M nivåer visas som 7,8 km sett från en satellit Google bild längs Chicagos lakefront från McCormick Place to Promontory Point i Hyde Park i närheten av University of Chicago). Dessutom signalsubstanser släpps till interstitiell utrymme över dessa koncentrationer påverkar lokal verksamhet hjärnan regionen. Däremot kan cytokiner (visas som avståndet från Jorden till Mars) ändra hjärnans funktion i halter mer än tio miljoner gånger mindre.

Figur 7
Figur 7. Interaktiv signalering av medfödda cytokin vägar. Cytokiner är mycket redundanta och pleiotropa i att flera cytokiner kan ha liknande effekter och en enda cytokin kan ha olika uttryck. Sådan mångfald härrör från komplexa interaktiva signalering som sker på samma nivå som ligander, receptorer, och phosphoproteins. Ytterligare komplexitet beror på att hjärnan består av olika celltyper, med varje som kan cell-specifika medfödda cytokin, receptorn, och relaterade förändringar fosfoprotein. För illustrativt syfte här, är bara medfödda cytokin signalvägar (från immunceller studier) visas. För enkelhetens skull är hjärnan dras som en enda cell (vit linje) som visar potentiella interaktioner för medfödda cytokiner (IL-1α och IL-1β (här kallad IL-1α / β), TNF-α, IL-6, IFN-γ och IL-10), receptorer (IL-1R1, TNFR1, IL-6/gp130, IFNγR, och IL-10R) och phosphoproteins (dvs kinaser ERK1 / 2, P38 (P38-MAPK) och JNK) och transkriptionsfaktorer (ATF-2, NFκB och STAT3). Till exempel TNF-α-signaler via TNFR1 till JNK, P38-MAPK och ERK1 / 2, vilket utlöser genexpression via ATF-2. TNF-α förändrar också genuttryck direkt genom NFκB aktivering. Tillsammans aktivering av dessa transkriptionsfaktorer framkalla ökad (pil) och minskad (trubbiga änden) uttryck av cytokiner och deras receptorer som anges. Viktigt är dessa vägar visar att förändringar i ett cytokin (t.ex. TNF-α) påverkar produktionen av andra (t.ex. IL-1β) cytokiner. Således, för att fastställa exakt cytokin-grunderna för neuroprotektion från kall-konditioneringsfasen måste sammanslagen analys av relaterad signalering variabler bestäms vara. Detta kommer att fastställa medfödda cytokin "signatur" av kallvalsade prekonditionering. (Bild har sammanställts utifrån data av reference # 25.)

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats genom anslag från National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke (NS-19.108), migrän Research Foundation, och Vita Foundation till Richard P. Kraig. Ms Marcia P. Kraig bistås i beredningen av kultur medier och underhåll av skiva kulturer. Vi tackar Yelena Grinberg för hennes kommentarer och ändringar på en slutlig version av denna artikel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Preparation of Slice Cultures
Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) PICM0-3050
Basal Medium Eagle 21010
Earle s Balanced Salt Solution E2888
Horse serum 26050-088
Glutamax 35050
Gentamicin 15710-064
Fungizone 15295
D-glucose G8769
BSL-1 fume hood
McIlwain tissue chopper
Teflon disks 023-49-310-1
Spatula 14-373-25A
Curved iris scissors 14091-09
Long straight scissors 14002-14
Long forceps 13-812-40
Angled forceps 11808-02
Short forceps 13-812-38
#5 Inox forceps 11254-20
2 Iris spatulae 10094-13
150 x 15 mm Petri dishes 08-757-148
60 x 15 mm Petri dishes 08-757-100B
Wild M8 stereomicroscope
Gey s balance salt solution G9779
Blak-Ray shortwave Ultraviolet measuring meter J-225
6-well Falcon culture dishes 08-772-1B
Neurobasal 21103
B27 supplement 17504
Gem21 Neuroplex 400-160-010
Ascorbic acid A4544
CO2 Analyzer #2820
Pre-screening for Vitality of Slice Cultures
Sytox Green S7020
DMIBRE inverted microscope
Cold-Preconditioning
BSL-2 Fume Hood
Excitotoxic Injury
CoolSnap fx CCD camera
Fluoroscein F36915
MetaMorph software v. 7.5.04
100 μm deep hemacytometer
N-methyl-D-aspartate 454575
SigmaStat software v. 3.5
Co-treatments applied with Cold-Preconditioning
sTNFR1 425-R1-050
Bovine Serum Albumin A-4503
RNA Isolation
RNAlater AM7021
Micro RNEasy Kit 74004
β-mercapt–thanol 03446-100
Diposable 1.5 RNAse-free Pestle 749521-1590
RNasin N261A
Tris[hydroxymethyl]aminomethane T3069
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt hydrate #E7889
RNA Quantification
RiboGreen Assay R11491
Yeast tRNA 15401-011
1.5 mL centrifuge tubes 16155500
96-well fluorescent assay plate DK-4000
96-well fluorescent plate reader Safire II
Quantitative PCR
iScript reverse transcription kit 170-8891
SYBR Green S7563
Platinum Taq polymerase RNA Ultrasense 11732-927
iCycler thermocycler iCycler Optical Module
iCycler system software v. 3.1
Quantitative PCR for Microarrays
RNase Away #7000
RT2 First Strand Kit C-03
SYBR Green-based PCR mix Specific for iCycler PA-011
RT2 Profiler PCR Array PARN-011A
Proteomic Assay
Cell lysis kit 171-304011
Microcentrifuge Micro 7
BSA protein stock 500-0007
BCA protein assay kit 23225
Immuno 96 MicroWell plates 449824
Sealing tape 2239444
96-well plate reader 1420-mulilabel counter
Bioplex Rat TNF-α cytokine assay X0000001T
Immunostaining
16% Paraformaldehyde 43368
Lysine L-6001
Sodium phosphate S374-1
Sodium periodate S-1878
Sodium azide S-2002
Hydrogen Peroxide (30%) H1009
Goat serum CS 0920
Triton X-100 T-8787
Staining dishes 14511
Plate Shaker 3520
#1 Filter Papers (185 mm) 1001-185
3,3 -diaminobenzidine D8001
Dimethyl sulfoxide D8418
Ethanol 111000200
Xylene X3S-4
Permount mounting media SP15-100
Cryostat cm3050 S
Tissue-Tek 27050
Fine-tip paint brush 11806
PAP blocking pen 22309
SFX signal enhancer A31631
ProLong Antifade P7481

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aptowicz, C. O., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Homeostatic plasticity in hippocampal slice cultures involves changes in voltage-gated Na+ channel expression. Brain Res. 998, 155-163 (2004).
  2. Beattie, E. C. Control of synaptic strength by glial TNFalpha. Science. 295, 2282-2285 (2002).
  3. Breder, C. D., Dewitt, D., Kraig, R. P. Characterization of inducible cyclooxygenase in rat brain. J Comp Neurol. 355, 296-315 (1995).
  4. Caggiano, A. O., Breder, C. D., Kraig, R. P. Long-term elevation of cyclooxygenase-2, but not lipoxygenase, in regions synaptically distant from spreading depression. J Comp Neurol. 376, 447-462 (1996).
  5. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes. J Comp Neurol. 369, 93-108 (1996).
  6. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Prostaglandin E2 and 4-aminopyridine prevent the lipopolysaccharide-induced outwardly rectifying potassium current and interleukin-1beta production in cultured rat microglia. J Neurochem. 70, 2357-2368 (1998).
  7. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Prostaglandin E receptor subtypes in cultured rat microglia and their role in reducing lipopolysaccharide-induced interleukin-1beta production. J Neurochem. 72, 565-575 (1999).
  8. Calabrese, E. J. Drug therapies for stroke and traumatic brain injury often display U-shaped dose responses: occurrence, mechanisms, and clinical implications. Crit Rev Toxicol. 38, 557-577 (2008).
  9. Calabrese, E. J. Biological stress response terminology: Integrating the concepts of adaptive response and preconditioning stress within a hormetic dose-response framework. Toxicol Appl Pharmacol. 222, 122-128 (2007).
  10. Calabrese, E. J., Baldwin, L. A. Hormesis: the dose-response revolution. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 175-197 (2003).
  11. Hansel, N. N. Analysis of CD4+ T-cell gene expression in allergic subjects using two different microarray platforms. Allergy. 63, 366-369 (2008).
  12. Hulse, R. E., Kunkler, P. E., Fedynyshyn, J. P., Kraig, R. P. Optimization of multiplexed bead-based cytokine immunoassays for rat serum and brain tissue. J Neurosci Methods. 136, 87-98 (2004).
  13. Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-alpha. J Neurosci. 28, 12199-12211 (2008).
  14. Hulse, R. E., Winterfield, J., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Astrocytic clasmatodendrosis in hippocampal organ culture. Glia. 33, 169-179 (2001).
  15. Kraig, R. P. TNF-alpha and Microglial Hormetic Involvement in Neurological Health and Migraine. International Dose-Respose Society. , (2010).
  16. Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Kraig, R. P. Multiplexed cytokine protein expression profiles from spreading depression in hippocampal organotypic cultures. J Cereb Blood Flow Metab. 24, 829-839 (2004).
  17. Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents. J Neurosci. 25, 3952-3961 (2005).
  18. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo. J Cereb Blood Flow Metab. 17, 26-43 (1997).
  19. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures. J Neurosci. 18, 3416-3425 (1998).
  20. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. P/Q Ca2+ channel blockade stops spreading depression and related pyramidal neuronal Ca2+ rise in hippocampal organ culture. Hippocampus. 14, 356-367 (2004).
  21. Lambertsen, K. L. Microglia protect neurons against ischemia by synthesis of tumor necrosis factor. J Neurosci. 29, 1319-1330 (2009).
  22. Lee, J. K. Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response. J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).
  23. Mattson, M. P. Hormesis and disease resistance: activation of cellular stress response pathways. Hum Exp Toxicol. 27, 155-162 (2008).
  24. Ning, B. Systematic and simultaneous gene profiling of 84 drug-metabolizing genes in primary human hepatocytes. J Biomol Screen. 13, 194-201 (2008).
  25. Oppenheim, J., Feldman, M. in Cytokine Reference. Oppenheim, J. J., Feldman, M. 1, Academic. New York. (2001).
  26. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45-e45 (2001).
  27. Stellwagen, D., Beattie, E. C., Seo, J. Y., Malenka, R. C. Differential regulation of AMPA receptor and GABA receptor trafficking by tumor necrosis factor-alpha. J Neurosci. 25, 3219-3228 (2005).
  28. Stellwagen, D., Malenka, R. C. Synaptic scaling mediated by glial TNF-alpha. Nature. 440, 1054-1059 (2006).
  29. Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40, 133-139 (2002).
  30. Wilde, G. J., Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Mann, D. A., Iannotti, F. Attenuation and augmentation of ischaemia-related neuronal death by tumour necrosis factor-alpha in vitro. Eur J Neurosci. 12, 3863-3870 (2000).

Tags

Neurovetenskap medfödd immunitet hormesis mikroglia hippocampus skiva kultur immunohistokemi neurala-immuna genuttryck realtids-PCR
Strategier för Studie av Neuroprotektion från Cold-konditioneringen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mitchell, H. M., White, D. M.,… More

Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning. J. Vis. Exp. (43), e2192, doi:10.3791/2192 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter