Summary
המושבה להרכיב (CFC) assay התא assay במבחנה שבה אבות hematopoietic טופס מושבות בינוני חצי מוצק. שילוב של מורפולוגיה המושבה, מורפולוגיה התא cytometry זרימה משמשים כדי להעריך את היכולת של אבות להתרבות להבדיל לאורך שושלות hematopoietic שונים.
Abstract
האדם hematopoietic גזע / ובתאים מתקבלים בדרך כלל ממח העצם, דם טבורי, או דם היקפיים משמשים ללמוד hematopoiesis ו leukemogenesis. יש להם את היכולת להתמיין שושלות הלימפה ואת מיאלואידית. המושבה להרכיב (CFC) assay תא משמש כדי ללמוד את התרבות ואת דפוס הבידול של אבות hematopoietic על ידי היכולת שלהם ליצור מושבות בתווך מוצק למחצה. המספר את המורפולוגיה של המושבות הוקמה על ידי מספר קבוע של תאים קלט לספק מידע ראשוני על היכולת של אבות להבדיל מתרבים. תאים ניתן לקצור ממושבות הפרט או מהצלחת כולו להמשיך להעריך את מספרם ומדינות בידול באמצעות זרימת cytometry והערכה מורפולוגיים של Giemsa מוכתם שקופיות. Assay זה שימושי להערכת בידול מיאלואידית אך לא הלימפה. מיאלואידית המונח בהקשר זה משמש במובן הרחב שלה כדי להקיף שושלות granulocytic, monocytic, erythroid ו megakaryocytic.
השתמשנו זה assay כדי להעריך את ההשפעות של אונקוגנים על התמיינות של תאים אנושיים העיקרי CD34 + שמקורם דם היקפי. בשביל זה התאים למטרה הם transduced עם לבנות או לשלוט retroviral או לבנות ביטוי oncogene של עניין, במקרה זה NUP98-HOXA9. אנו מעסיקים וקטור retroviral נפוץ, MSCV-IRES-GFP, אשר מבטאת mRNA bicistronic שמייצר הגן של עניין סמן ה-GFP. תאים מופעלות מראש על ידי גידול בנוכחות ציטוקינים יומיים לפני התמרה retroviral. אחרי עוד יומיים, GFP + תאים מבודדים ידי מיון הקרינה המופעל תאים (FACS) ומעורבבים עם המדיום methylcellulose המכילים מוצק למחצה בתוספת ציטוקינים מודגרות עד מושבות להופיע על פני השטח, בדרך כלל על 14 ימים. מספר ומורפולוגיה של המושבות מתועדים. תאים יוסרו אז מן הלוחות, שטף, נספר, והוא נתון cytometry זרימה ובדיקה מורפולוגיים. Cytometry זרימה עם נוגדנים ספציפיים על פני התא סמנים הביע במהלך hematopoiesis מספק מידע על השושלת שלב ההבשלה. מחקרים מורפולוגי של תאים בודדים תחת מיקרוסקופ לאחר מכתים רייט Giemsa לספק מידע נוסף לגבי השושלת והתבגרות. השוואה בין תאים transduced עם בקרת וקטור ריק לאלה transduced עם oncogene מגלה את ההשפעות של oncogene על בידול hematopoietic.
Protocol
1. הכנה של ריאגנטים
- הכן סטרילי פתרונות מניות 1000x של קינאז FMS הקשורות טירוזין 3 (FLT-3), ליגנד granulocyte / macrophage המושבה גורם מגרה (GM-CSF), תא גזע גורם (SCF), thrombopoietin (TPO), אינטרלוקין (IL) -3 , ו - IL-6 בהתאם להוראות היצרן. הכן Retronectin סטרילי מניות פתרון (1mg/ml) גם על פי הוראות היצרן. מחלקים את הפתרונות הללו לתוך המניה aliquots קטן ולשמור על -20 ° C כדי למנוע חזר להקפיא להפשיר.
- הכן FBS 2% IMDM.
- הכן בינוני IMDM להשלים עם ריכוזים הסופי של FBS 20%, 2 גלוטמין מ"מ, 100 יחידות / מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין (PS). מוסיפים את ציטוקינים הבאים רק לפני השימוש: 100 ng / ml FLT-3 ליגנד, 20 ng / ml GM-CSF, 100 ng / ml SCF, 100 ng / ml TPO, 50 ng / ml IL-3, ו - 100 ng / ml IL-6.
- הכן BSA 1% HBSS (Ca & Mg חינם, ללא פנול אדום) ו BSA 2% ב D-PBS (Ca & Mg-free). לעקר את הפתרונות על ידי עובר דרך מסנני מזרק 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C.
- הכן EDTA 0.02% ב HBSS ולאחסן ב 4 ° C.
- הכן GaLV-pseudotyped רטרווירוס קידוד ה-DNA של עניין חנות aliquots ב -80 ° C. הליך זה מחוץ להיקף של מאמר זה, אבל מתואר במקומות אחרים (1-3).
עבור מכתים Giemsa
- רק לפני השימוש, לסנן את הפתרון רייט / Giemsa כתם פעמיים עד 1 מיקרומטר ניירות לסנן לתוך בקבוק זכוכית נקי.
- מיד לפני השימוש, להכין רייט / Giemsa חיץ pH 6.4, על ידי ערבוב 50 מ"ל של התמיסה רייט / Giemsa מסוננים הכתם 200 מ"ל של תמיסת פוספט חיץ, pH 6.4 - ג'ורדנו הנוסחה.
- הכן חיץ פוספט פתרון, 6.0 pH ידי המסת 27.3 גרם של KH 2 PO 4 ו - 4.62 גרם של Na 2 HPO 4 ב 3.5 LH 2 O.
- הכן מתנול 50% H 2 O.
2. נוהל
הפשרה מראש ההפעלה של CD34 + תאים
- הפשירי בקבוקון של CD34 תאים קפואים + במהירות 37 ° C על ידי רועדות בעדינות עד גביש קרח קטן האחרון שנותר ולהעביר את ההשעיה התא (1 מ"ל) על צינור חרוטי 50 מ"ל. בעדינות ולשטוף את התאים הנותרים מבקבוקון עם 1 מ"ל של בטמפרטורת החדר 2% FBS / IMDM ולהוסיף אותו טיפה חכם שפופרת 50 מ"ל בזמן מסתחררים בעדינות. המתן 3 דקות. לאחר מכן, לאט להוסיף 2 מ"ל של 2% FBS / IMDM, תוך ערבוב בעדינות, להמתין 3 דקות. חזור על נוהל על ידי הוספת 2% FBS / IMDM כי הוא נפח זהה ההשעיה תא מדולל ב 3 דקות במרווחים, מסתחררים בעדינות בין תוספות, עד נפח הסופי מגיע 32 מ"ל.
- צנטריפוגה XG ב 250 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להסיר את supernatant והותיר אחריו סביב 0.5 מ"ל.
- שטפו את הכדור על ידי השעיית ב 20 מ"ל 2% FBS / IMDM ו centrifuging ב XG 200 עבור 8 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את supernatant ו להשעות את התאים בינוני IMDM להשלים בכ 0.5 x 10 6 תאים / מ"ל. קח 10 μl של השעיה התא לתוך תערובת microtube, עם נפח זהה של תמיסת Trypan כחול (0.4%) ולספור באמצעות hemocytometer.
- לדלל את התאים 0.1-0.15 X 10 6 תאים / מ"ל ידי הוספת בינוני IMDM מלא בתוספת ציטוקינים (ראה 1.3)
- התרבות התאים humidified 37 ° C חממה עם 5% CO 2 על 2 ימים.
התמרה retroviral ידי וירוס לפני טעינת
- ביום התמרה, לספור תאים לפני תחילת וירוס וטעינה מוקדמת כדי לקבוע את מספר בארות להיות מוכנים.
- פתרון לדלל את המניות Retronectin עד 25 מיקרוגרם / מ"ל ולהוסיף 400 μl היטב בכל צלחת 24 גם ללא טיפול בתרבית רקמה. דגירה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר בשכונה biosafety זרימה למינרית המעיל מראש.
- הסר את הפתרון Retronectin ולהוסיף 400 μl של BSA 2% ב D-PBS היטב כל אחד. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הפשירי מניות פתרונות וירוס ולשמור על הקרח. הסר את הפתרון BSA, להוסיף 0.5 מ"ל של הכנת נגיף זה טוב, צנטריפוגה XG ב 2200 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- הסר את הפתרון וירוס מבארות וחזור על טעינת וירוס המתואר 2.10 שלוש פעמים נוספות.
- יש לשטוף היטב עם כל הקור 0.5 מ"ל HBSS (+ Ca & מ"ג) או IMDM.
- לאסוף את טרום מופעל CD34 + תאים על ידי centrifuging ב XG 200 עבור 8 דקות בטמפרטורת החדר.
- Resuspend התאים ב 0.1-0.15 x 10 6 תאים ל 1.5 מ"ל במדיום IMDM להשלים עם ציטוקינים.
- הוסף 1.5 מ"ל תא השעיה זה היטב מדגירים את humidified 37 ° C חממה עם 5% CO 2 על 2 ימים.
מיון תאים אוסף של תאים transduced
- בעדינות אך ביסודיות להשעות את התאים הנ"ל וירוס טעון צלחתs ולסנן דרך פילטר CellTrics 50 מיקרומטר התא לתוך צינור חרוטי. קח 10 μl של השעיה התא לתוך תערובת microtube, עם נפח שווה של פתרון כחול Trypan ולספור באמצעות hemocytometer. יש לשטוף היטב עם כל מ"ל 0.8 הקור 0.02% EDTA / HBSS (Ca & Mg-free ללא פנול אדום) ולהוסיף הצינור אוסף אותו דרך פילטר CellTrics 50 מיקרומטר התא.
- צנטריפוגה התאים ב XG 200 עבור 8 דקות 4 ° C, ולשטוף את הכדור עם קר HBSS (Ca & Mg חינם ללא פנול אדום) על ידי centrifuging ב XG 200 עבור 8 דקות 4 ° C.
- Resuspend גלולה 1% BSA / HBSS (Ca & Mg חינם ללא פנול אדום) ריכוז של 15 מ"ל X 10 / 6 או אמצעי אחסון מינימלי של 0.250 מ"ל למיון התא. שמור את התאים על הקרח בחושך. הכן צינורית המכילה קר 20% FBS / IMDM / גלוטמין / PS בינוני לאיסוף תאים ממוינים. המיון מתבצע על Core סדרן מהירות גבוהה נייד של ג'אלווין Siteman במרכז לחקר הסרטן באוניברסיטת וושינגטון בית הספר לרפואה באמצעות סדרן במהירות גבוהה MoFlo (Dako, Glostrup, דנמרק).
CFC assay
- להפשיר את המספר הנדרש של 3 aliquots מ"ל של התקשורת CFC assay. וורטקס במרץ לערבב ולהניח צינורות לעמוד לפחות 5 דקות כדי לאפשר בועות כל ההווה לעלות אל פני השטח לפני הוספת תאים.
- כדי להשיג את הריכוז תא למדגם כל מיון, מחלקים את מספר הסלולרי שמספק מתקן מיון לפי נפח תא משוער ההשעיה. קח 3,000 וירוסים transduced, תאים ממוינים לתוך microtube סטרילי קר המכיל 2% FBS / IMDM. טרום לכוונן את עוצמת הקול של 2% FBS / IMDM כך נפח ההשעיה הסופי יהיה כ 0.3 מ"ל.
- להשעות את התאים להעביר את התא כולו ההשעיה 0.3 מ"ל ל aliquot 3 מ"ל של Methocult GF + H4435, אשר מורכב methylcellulose 1%, 30% FBS, BSA 1%, 10 מ -4 2 mercaptoethanol, 2 מ"מ L-גלוטמין, 50 ng / ml SCF, 20 ng / ml GM-CSF, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, 20 ng / ml-G-CSF, ו -3 יחידות / מ"ל IMDM אריתרופויאטין. האדם Methylcellulose מועשר מדיה (מו"פ Systems) אשר מורכב methylcellulose 1.3%, FBS 25%, BSA 1%, 5 x 10 -5 M 2-mercaptoethanol, 2 מ"מ L-גלוטמין, 50 ng / ml SCF, 20 ng / מ"ל GM-CSF, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, 20 ng / ml-G-CSF, ו -3 יחידות / מ"ל אריתרופויאטין IMDM יכול לשמש גם.
- וורטקס במרץ כדי להפוך את עליית התערובת באופן מלא ליפול 3-4 פעמים. בואו הצינור עומד עדיין על 3 דקות.
- צרף 16 מד בוטה קצה המחט מזרק 3 מ"ל ותנסחו 2.2 מ"ל. אין להכין בועות גדולות; לגרש אותם בתחילת לדחוף החוצה על ידי כמה פעמים. דחוף החוצה 1.1 מ"ל כל מנה לשניים 30 שאינם מטופלים מ"מ להפיץ את התערובת באופן שווה על ידי סיבוב.
- המקום לשכפל צלחות צלחת 100 מ"מ יחד עם צלחת מים המכילים 3 מ"ל מים סטריליים. התרבות 14-17 ימים.
- לאפיין התפלגות המושבות על פי המורפולוגיה שלהם עם מיקרוסקופ הפוך בהגדלה 40X בצלחת תרבות המסומנים רשת הניקוד. לענין assay שלנו, במושבות מסווגים 3 קטגוריות: טהור erythroid, myelomonocytic, ומעורבים. ראה הנחיות היצרן עבור subclassification מושבה נוספת.
- צלחת כולו assay CFC עשויים להיות סרק ללא הגדלה באמצעות סורק רגיל ב 600 dpi, צריכת חשמל נמוכה (40X) photomicrographs המושבות ניתן לקחת באמצעות מיקרוסקופ הפוך מצויד במצלמת צבע.
- לצורך ניתוח נוסף של בידול ושגשוגם, התאים את הצלחת CFC כל assay הם התאוששו על ידי השעיית בכמה כרכים של בטמפרטורת החדר 2% FBS / IMDM. לאחר צנטריפוגה XG ב 300 דקות 10 ב 4 ° C, התאים resuspended ב 2% FBS / IMDM, נספר, ומוכתמת או עם נוגדנים cytometry זרימה או להעביר שקופיות באמצעות צנטריפוגות Cytospin עבור מכתים Giemsa.
נוגדן מכתים ואת זרימת cytometry
- תאים צנטריפוגה XG ב 200 דקות 8 ב 4 ° C ו resuspend בסרום 50% קר עכבר רגיל HBSS (Ca & Mg חינם ללא פנול אדום).
- המקום כ 5 x 10 5 תאים לכל צינור μl 80 (12 x 75 מסביב לתחתית צינורות מ"מ) ולשמור על הקרח. הוסף תערובת נוגדנים (כ 20 תערובת μl או פתרון בקרת שלילי ללא נוגדנים שולטת) ומערבבים קלות על ידי הקשה על צינורות. הכן לשלוט צינורות כיול עם נוגדנים או לא עם נוגדן נגד CD45 לכל fluorochrome. המקום צינורות על הקרח בחושך דגירה במשך 20 דקות. מערבבים קלות על ידי הקשה על צינורות אחרי 10 דקות הראשונות. לאחר דגירה 20 דקות, ממלאים את צינורות עם HBSS קר צנטריפוגות ב XG 200 דקות 8 ב 4 ° C. Resuspend גלולה paraformaldehyde ב -0.5% / HBSS קר.
תערובות הבאות של נוגדנים משמשים בדרך כלל עבור הניתוח שלנו. עבור בידול מיאלואידית: CD11b (phycoerythrin-מצומדות שיבוט ICRF44) / CD33 (allophycocyanin-WM53 מצומדות שיבוט) / CD45 (phycoerythrin-Cy7-congjugated שיבוט HI30). עבור בידול erythroid: CD71 (phycoerythrin-מצומדות שיבוט M-A712) / CD235a (allophycocyanin-מצומדות שיבוט GA-R2) / CD45 (phycoerythrin-Cy7-congjugated שיבוט HI30). - Cytometry זרימה מבוצע על Core סדרן מהירות גבוהה נייד של ג'אלווין Siteman במרכז לחקר הסרטן באוניברסיטת וושינגטון בית הספר לרפואה על cytometer זרימה FACScan לשדרג ל 5 צבעים ושני לייזרים (BD Biosciences) ונותחו באמצעות CellQuest (BD Biosciences) או FlowJO v7.2.4 (עץ Star, Inc, אשלנד, או, ארה"ב) תוכנה.
Giemsa מכתים
- כ 30,000 תאים התאושש צלחות CFC assay שתוארו לעיל מושעים ב 0.3 מ"ל 2% FBS / IMDM והועברו שקופית באמצעות צנטריפוגות Cytospin בסל"ד 1000 עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הגדר ועולים בתשעה כלי מכתים המכיל הפתרונות לפי הסדר הבא.
- Absolute מתנול
- רייט / Giemsa מניות פתרון
- רייט / Giemsa חיץ, pH 6.4
- מתנול 50% H 2 O
- H 2 O
- H 2 O
- חיץ פוספט, 6.0 pH
- H 2 O
- H 2 O
- מניחים את השקופיות לתוך מנשא מגלשה לטבול מתנול אבסולוטי (# 1) עבור 2 דקות ו למחוק את עודף מתנול.
- מיד לטבול המוביל שקופית פתרון מניות רייט / Giemsa (# 2) עבור 5 דקות.
- העברת המוביל אל רייט / Giemsa חיץ, pH 6.4 (# 3) דגירה של 10 דקות.
- טובלים את הספק פעמיים מתנול 50% (מס '4), 10 פעמים H 2 O (# 5), עוד 10 פעמים H 2 O (# 6), ולאחר מכן 5 פעמים חיץ פוספט, pH 6.0 (# 7) .
- העברת המוביל לתוך H 2 O (# 8) ו דגירה דקות 2. חזור על לשטוף ב H 2 O (# 9).
- אפשר השקופיות לאוויר יבש לחלוטין במנשא. הסר כל שקופית ולנגב את הגב של השקופית עם מתנול ספוג Kimwipes להסיר כתמים. מניחים ירידה של 60 Cytoseal וכוס לכסות לאטום.
- ספירת 500 תאים ההפרש מבוצע עבור השקופית Giemsa מוכתמת כל באמצעות מיקרוסקופ BX51 אולימפוס. תאים מחולקים לחמש קטגוריות: תאים פרימיטיביים כוללים תקיעות ו promyelocytes; תאים מיאלואידית ביניים כוללים myelocytes ו metamyelocytes; תאים מיאלואידית בוגרת כוללים להקות, מפולח נויטרופילים, מונוציטים, ומקרופגים; ביניים תאים erythroid כוללות תאים עם hemoglobinization ביניים; ובוגרת תאים erythroid כוללים תאים עם hemoglobinization מלא. Photomicrographs הם שצולמו במצלמת אולימפוס DP71 במטרה שמן 60x.
3.0) תוצאות נציג:
- Assay CFC: חלק מהאוכלוסייה תא קלט יתרבו, להבדיל, ומושבות טופס בינוני חצי מוצק בתקופה 14-17 ימי דגירה. בניסוי זה, ברור כי הביטוי של האונקוגן NUP98-HOXA9 גרמה להיווצרות אדום בולט (erythroid המושבות) (איור 1) (3).
- מכתים נוגדן ו cytometry זרימה: זרימה immunophenotyping cytometric של תאים שנאספו צלחות CFC assay מספק מידע על מצב הבידול של האוכלוסייה התא. על ידי שימוש בשילוב של נוגדנים כנגד סמנים בידול מסוים, השושלת ואת מידת ההבשלה של התאים ניתן להעריך. במקרה זה CD235a שימש כדי לזהות תאים erythroid. כפי שניתן לראות בתרשים 2A, NUP98-HOXA9 גרמה לעלייה באחוז התאים CD235a + erythroid, אבל את בהירות הביטוי CD235a ידי תאים אלה פחתה בהשוואה לקבוצת הביקורת, המציין עיכוב התבגרות erythroid. ב 2B איור, תאים מיאלואידית מזוהים מכוח חיוביות שלהם CD33. NUP98-HOXA9 גרמה לירידה במספר CD33 + תאים, עם ירידה בהירות הביטוי CD11b, עולה בקנה אחד עם עיכוב של התבגרות מיאלואידית (3). כך cytometry התוצאות הראו כי זרימת NUP98-HOXA9 גרם היפרפלזיה erythroid עם עיכוב של התבגרות הן מיאלואידית ו erythroid.
- מכתים Giemsa: בדיקה מורפולוגית של התאים שנאספו צלחות CFC assay מספק מידע על השושלת ואת מידת ההבשלה של האוכלוסייה התא. המסקנות שהתקבלו מורפולוגית עשויים להיות שונים מאלה שהושגו על ידי מחקרים זרימת cytometric, ובכך שיטות אלה משלימים אחד את השני (3). הניסוי חוזר על עצמו לפחות 3 פעמים, ובכל פעם ספירת 500 תאים ההפרש מבוצע להבחין 5 קטגוריות של תאים כפי שתואר לעיל. דוגמאות של תאים אלה הצביע באיור 3. התוצאות הן tabulated ונותחו על מנת לקבוע אם יש הבדלים משמעותיים סטטיסטית בין oncogene-transduced מדגם הביקורת. במקרה זה, התוצאות הראו כי NUP98-HOXA9 גרמה לעלייה הכללית במספרים של תאים, עם היפרפלזיה erythroid ועיכוב של שני erythroid והתבגרות מיאלואידית (3) (לא מוצג).
FIGURE האגדות
איור 1: השפעת NUP98-HOXA9 על מורפולוגיה CFC האדם.
ראשי אנושי CD34 + תאים היו retrovirally transduced עם או MSCV-IRES-GFP וקטור שליטה או וקטור להביע NUP98-HOXA9, ותאי מוינו חיוביות עבור ה-GFP. אלף תאים היו זורעים לתוך כל אחד שתי מנות כפולות עבור assay CFC ואת הניסוי חזר על עצמו 3 4 פעמים עצמאית. צלחות נציג ללא הגדלה (משמאל) photomicrographs צריכת חשמל נמוכה של נציג erythroid מושבות (מימין) מוצגים (3).
איור 2: תזרים cytometry מראה שיבוש CD34 העיקרי האדם + התמיינות תאים על ידי NUP98-HOXA9.
(א) cytometry זרימה עבור בידול erythroid: תאים מהצלחות CFC (ראה תרשים 1) נקצרו מוכתם נוגדנים CD45 ו CD235a. CD235a + השער היה זממו על (פאנל מימין) היסטוגרמה כדי להראות את הביטוי של CD235a ביחס לתאי הבקרה (ב) תזרים cytometry לבידול מיאלואידית: תאים מהצלחות CFC נקצרו מוכתם CD45 ו - CD33. CD33 + השער היה זממו על היסטוגרמה להראות ביטוי CD11b לעומת הבקרה (פאנל מימין). חלקם של התאים נפילה בתוך כל שער מוצגים (3).
איור 3: מורפולוגיה Cell מראה שיבוש של בידול על ידי NUP98-HOXA9 לעומת שליטה וקטור.
מריחות Cytospin הוכנו מהצלחות CFC ו מוכתמים Giemsa. Photomicrographs נלקחו לשדות נציג במטרה שמן 60x. ב ': הפיצוץ; MM: מיאלואידית בוגרת, IM: מיאלואידית ביניים, אני: erythroid בוגר, כלומר: erythroid ביניים (3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assay CFC נמצא בשימוש נרחב על מנת לקבוע את תפוצת ואת דפוסי הבידול של אבות hematopoietic כדי לחקור את ההשפעות של אונקוגנים (4, 5). יש לו יתרון על פני תרבויות נוזלי להיות assay משובטים, כך המושבות לייצג את הצאצאים של אב יחיד ניתן להסיר באופן פרטני לצורך ניתוח נוסף. המגבלה של assay CFC היא שזה לא מספיק לצורך זיהוי של אבות יותר בשלה, או בתאי גזע hematopoietic; תאים אלה מזוהים באמצעות לטווח ארוך תרבות ייזום תאים (LTC-IC) assay (6, 7). הניסויים שתוארו כאן להוכיח כי oncogene AML הקשורים NUP98-HOXA9 מעכב ההבשלה מיאלואידית ו erythroid וגורם erythroid היפרפלזיה (1, 3).
מאז תרבות methylcellulose מבוסס הוא יחסית ארוך טווח בינוני CFC אינו מכיל אנטיביוטיקה, היא בעלת חשיבות עליונה על מנת למנוע זיהום של תרביות תאים, במיוחד במהלך ואחרי מיון. זיהום חיידקי או פטרייתי קל יהיה להציף את התרבות. פרשנות של זרימת cytometry ומורפולוגיה תא דורש ניסיון, בהתייעצות עם צוות מיומן מומלץ. FBS רק כי כבר מראש לגילוי התאמה לשימוש עם ראשי אבות מיאלואידית האדם אמור לשמש; המוצר שאנחנו משתמשים באופן שגרתי נמצאת בטבלה ריאגנטים. Methylcellulose מבוססי CFC התקשורת הם צמיגה מאוד תשומת לב מיוחדת יש לנקוט בעת הטיפול בהם לערבב באופן אחיד ולמנוע בועות לפני נשפך לתוך הצלחות. הכללה של צלחת מים עם צלחות CFC בצלחת גדולה יותר חשוב למנוע התייבשות של המדיום CFC במהלך הדגירה הממושך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים ג'אלווין Siteman במרכז לחקר הסרטן באוניברסיטת וושינגטון בית הספר לרפואה של בארנס יהודים החולים בסנט לואיס, מיזורי, לשימוש של Core סדרן Cell מהירות גבוהה, שסיפקה cytometry זרימת ציוד ושירותים מיון. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R01 HL082549 ו K02 HL084179 (NRY). סרטן Siteman מרכז נתמך בחלקו על ידי תמיכה במרכז לחקר הסרטן NCI גרנט P30 CA91842.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Life Technologies | 12440 | |
| FBS | Stem Cell Technologies | 06150 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | |
| FLT-3 ligand | PeproTech Inc | 300-19 | |
| GM-CSF | PeproTech Inc | 300-03 | |
| SCF | PeproTech Inc | 300-07 | |
| TPO | PeproTech Inc | 300-18 | |
| IL3 | PeproTech Inc | 200-03 | |
| IL6 | PeproTech Inc | 200-06 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | |
| HBSS | Life Technologies | 14175 | |
| PBS | Life Technologies | 14200 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Methocult GF+ H4435 | Stem Cell Technologies | 04445 | |
| Human Methylcellulose Enriched Media | R&D Systems | HSC005 | |
| Wright/ Giemsa stain | Harleco | 64571 | |
| Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 - Giordano formula | Ricca Chemical Company | 1450 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 8310 | |
| Normal Mouse Serum | Rockland Immunochemicals | D208 | |
| Anti-Human CD11b phyc–rythrin-conjugated | BD Biosciences | 555388 | |
| Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551378 | |
| Anti-Human CD45 phyc–rythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | |
| Anti-Human CD71 phyc–rythrin-conjugated | BD Biosciences | 555537 | |
| Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551336 | |
| Anti-Human CD45 phyc–rythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | |
| 24-well non-treated tissue culture plates | BD Biosciences | 35-1147 | |
| 30 mm non-treated dish | Stem Cell Technologies | 27150 | |
| 100 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Gridded scoring dishes | Stem Cell Technologies | 27500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2097 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2070 | |
| Syringes 3 ml | Stem Cell Technologies | 28240 | |
| 16 gauge blunt-end, 1½ inch needle | Stem Cell Technologies | 28110 | |
| 50 μm CellTrics cell filter | Partec | 04-004-2327 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| TPX sample chambers | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A78710018 | |
| Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Shandon filter cards | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5991022 | |
| Shandon cytospin slide holder | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 59920063 | |
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| 1 μm filter paper | VWR international | 28307-134 | |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Diaphot | |
| Microscope camera | Nikon Instruments | DS-F11 | |
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
| Microscope camera | Olympus Corporation | DP71 | |
| Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC | |
| Cytospin | Shandon, Inc. | Cytospin 2 | |
| Bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810-R | |
| Water purification system | Barnstead | Nanopure-Diamond |
References
- Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , Forthcoming (2010).
- Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
- Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. Human hematopoietic colonies in health and disease. Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).
- Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. Hematopoietic colony-forming cell assays. Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).
- Coulombel, L. Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays. Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).
- Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 88, 3765-3773 (1996).
