Summary
集落形成细胞（CFC）的检测是在体外实验中，造血祖细胞形成半固体培养基中的菌落。结合菌落形态，细胞形态，流式细胞仪是用来评估的祖细胞的增殖和分化沿不同的造血谱系能力。
Abstract
人造血干/祖细胞通常从骨髓，脐带血，外周血和用于研究造血和白血病。他们有能力分化成淋巴和髓细胞谱系。集落形成细胞（CFC）的测定是用来研究的增殖和分化的造血祖细胞的能力，在半固体培养基中形成的殖民地模式。一个固定数量的输入细胞形成的菌落的数量和形态提供初步信息有关的祖细胞能够分化和增殖。从单个菌落或从整个板块收获细胞可以进一步评估它们的数量和分化状态，用流式细胞仪检测和形态学评估姬姆萨染色幻灯片。这种分析是有用的评估髓细胞分化，但没有淋巴。在这方面的长期髓系在其更广泛的意义上使用，包括粒细胞，单核细胞，红系，巨核细胞谱系。
我们已经用这种检测评估的首要人权从外周血CD34 +细胞衍生的细胞分化癌基因的影响。这样做的目的细胞转要么控制逆转录病毒构建或利益表达的原癌基因的构建，在这种情况下，NUP98 - HOXA9。我们采用一种常用的逆转录病毒载体MSCV - IRES - GFP，表达了产生的利益和GFP标记基因的双顺反子mRNA的。细胞被预先激活，越来越多的前两天，以逆转录病毒转导的细胞因子的存在。另外两天后，GFP +细胞是孤立的荧光激活细胞分选（FACS），并含有一个甲基纤维素半固体与细胞因子的补充和培养至菌落出现在表面上，一般为14天的中期混合。记录的数量和形态的殖民地。细胞，然后从板块中删除，洗涤，计数，和流式细胞仪检测和形态学检查。流式细胞仪检测表达在造血细胞表面标记的特异性抗体提供有关血统和成熟阶段的信息。 Wright - Giemsa染色后显微镜下单个细胞的形态学研究提供进一步的信息方面的血统和成熟。控制空载体转导细胞比较，揭示造血分化癌基因的影响癌基因转导。
Protocol
1。试剂的制备
- 准备无菌FMS相关酪氨酸激酶3的1000倍的股票解决方案（FLT - 3）配体，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM - CSF的），干细胞因子（SCF），血小板生成素（TPO），白细胞介素（IL）-3 ，IL - 6和根据制造商的指示。准备的无菌Retronectin股票溶液（1mg/ml的）也可根据制造商的说明。分成小等份，这些股票的解决方案，并保持在-20 ° C，避免反复冻融。
- 准备2％FBS的IMDM。
- 准备完整的IMDM培养液终浓度20％胎牛血清，谷氨酰胺2毫米，100个单位/ ml青霉素/链霉素（PS）。使用前加入以下因子：100毫微克/毫升FLT - 3配体，20 ng / ml的GM - CSF 100 ng / ml的SCF的，100 ng / ml的TPO，50 ng / ml的IL - 3，和100纳克/毫升IL - 6。
- 准备1％BSA的HBSS（钙和镁的自由，无酚红）和2％的牛血清白蛋白在D - PBS（钙和镁免费）。通过0.22微米针头式过滤器和存储在4 ° C。的消毒解决方案
- 准备在0.02％EDTA的HBSS，并储存在4 ° C。
- 准备镀锌假型逆转录病毒编码的DNA分装的兴趣和存储于-80 ° C。此过程是本文的范围之外，但其他地方描述（1-3）。
对于姬姆萨染色
- 使用前，通过1微米到一个干净的玻璃瓶的滤纸过滤两次赖特/姬姆萨染色解决方案。
- 使用前，准备赖特/吉姆萨缓冲液pH 6.4，混合50毫升的过滤赖特/姬姆萨染色溶液和200毫升磷酸盐缓冲液，pH值6.4 - 佐丹奴公式。
- 准备通过溶解在3.5 LH 2 O KH 2 PO 4 27.3克和4.62克的Na 2 HPO 4的磷酸盐缓冲溶液，pH值6.0
- 准备在H 2 O 50％甲醇
2。程序
解冻和预激活的CD34 +细胞
- 一小瓶冷冻CD34 +细胞迅速解冻，在37 ° C时轻轻晃动，直到最后的小冰晶左侧和转移的细胞悬液（1毫升）50毫升锥形管。轻轻冲洗掉1毫升室温从瓶中剩余的细胞2％FBS / IMDM培养，并把它添加落明智的，50毫升管轻轻纷飞。等待3分钟。接下来，慢慢加入2毫升2％FBS / IMDM，同时轻轻搅拌，并等待3分钟。重复添加2％FBS / IMDM是相同体积稀释的细胞悬液，在3分钟的间隔，轻轻纷飞之间增加，直到最终的量达到32毫升的过程。
- 在室温为10分钟，在250 XG离心，去除上清液，留下约0.5毫升。
- 洗净颗粒悬浮在20毫升2％FBS / IMDM培养和离心8分钟，在室温200 XG。
- 去除上清液，并暂停完整的IMDM培养基中的细胞 ，约0.5 × 10 6细胞/ ml。考虑到一个微管10μL的细胞悬液，混合相同体积的台盼蓝溶液（0.4％）和使用一个血球计数。
- 加入与细胞因子为辅的完整的IMDM培养基稀释细胞0.1-0.15 × 10 6细胞/ ml（ 见 1.3）
- 文化与5％的CO 2天2细胞中的饱和湿度37℃培养箱。
预加载病毒的逆转录病毒转导
- 转天，堆载预压，以确定井数要准备开始前病毒的细胞进行计数。
- 25微克/毫升Retronectin的原液稀释，添加400μL，每孔24孔非治疗组织培养板。层流生物安全罩前大衣为2小时，在室温下孵育。
- 取出Retronectin的解决方案，并添加400μL的2％BSA的D - PBS，每孔。 30分钟，在室温下孵育。
- 解冻病毒的解决方案，并保持在冰上。删除BSA溶液，每孔加入0.5毫升病毒编写，并在4℃离心2200 XG 15分钟。
- 从水井中删除病毒的解决方案和重复病毒负荷在2.10三次描述。
- 每孔0.5毫升冷的HBSS（+钙和镁）或IMDM冲洗。
- 在室温下8分钟200 XG离心收集预激活的CD34 +细胞。
- 重悬在0.1〜0.15 × 10 6个细胞与细胞因子的完整的IMDM培养液1.5毫升的细胞。
- 加入1.5 ml的细胞悬液，每孔和5％的CO 2天2饱和湿度37℃培养箱中孵育。
细胞分类和收集细胞
- 轻轻地，但彻底中止细胞病毒在上面装板S和过滤器通过50微米CellTrics成一个锥形管的细胞过滤器。台盼蓝溶液等体积混合成微管，以10μL的细胞悬液，计数使用一个血球。冲洗每口井用0.8毫升冷0.02％EDTA / HBSS（钙和镁无酚红），并通过50微米CellTrics细胞过滤器添加到同一个收集管。
- 8分钟，在4 ° C离心200 XG的细胞，颗粒（钙和镁无酚红）与冷的HBSS洗离心8分钟，在4 200 XG ° C。
- 在1％BSA / HBSS（钙和镁无酚红）15 × 10 6 / ml或体积最小的细胞分类为0.250毫升的浓度重悬沉淀。继续在黑暗中的冰的细胞。准备一个试管中冷20％FBS / IMDM /谷氨酰胺/ PS收集排序细胞的培养基。排序是细胞的阿尔文J. Siteman癌症中心在华盛顿大学医学院的医学使用一个MoFlo高速分拣机（DAKO，Glostrup，丹麦）高速分拣机的核心。
氟氯化碳含量测定
- 解冻所需数量的氟氯化碳检测媒体3毫升分装。涡大力混合，并让管站至少5分钟，让目前任何气泡上升之前加入细胞表面。
- 要获得每个排序的样品细胞浓度，划分分类设施，提供近似的细胞悬液体积的细胞数。以3000病毒转排序，进入无菌冷2％FBS / IMDM中含微管的细胞。预调整量的2％FBS / IMDM培养等，最终悬浮液体积约0.3毫升。
- 悬浮细胞和整个0.3毫升细胞悬液转移到3毫升分装Methocult GF + H4435，其中包括1％甲基纤维素，30％FBS，1％BSA，10 -4 M 2 -巯基乙醇，2毫米L -谷氨酰胺， 50毫微克/毫升的SCF，20 ng / ml的GM - CSF的，20 ng / ml的IL - 3，20 ng / ml的IL - 6，20毫微克/毫升G - CSF和3个单位/毫升红细胞生成素的IMDM。人力甲基纤维素丰富的媒体（R＆D系统）1.3％甲基纤维素组成，25％FBS，1％BSA，5 × 10 -5 M 2 -巯基乙醇，2毫米L -谷氨酰胺，50纳克/毫升的SCF，20毫微克/毫升GM - CSF的，20 ng / ml的IL - 3，20 ng / ml的IL - 6，20毫微克/毫升G - CSF和3个单位/毫升的IMDM促红细胞生成素可也使用。
- 涡大力充分混合上升和下降3-4倍。让管站3分钟。
- 3毫升注射器将16计钝针，并制定了2.2毫升。不要画了大泡;驱逐他们开始推了几次。推了1.1毫升，每一个到两个30毫米非治疗的菜和蔓延旋转混合均匀。
- 放置在一个100毫米的钢板重复板块包含3毫升无菌水的水菜。文化为14 - 17天。
- 根据其标记具有得分电网培养皿放大40倍倒置显微镜的形态特点和得分殖民地。对于我们实验的目的，菌落分为3类：纯红，骨髓和混合。请参见制造商的指示，为进一步殖民地subclassification。
- 可能没有使用一个定期在600 dpi的扫描仪，低功耗（40X）菌落显微照片可采取配备彩色摄像机使用倒置显微镜的放大倍率扫描整个氟氯化碳检测板。
- 整个氟氯化碳检测板的细胞分化和增殖的进一步分析，恢复暂停在室温2％FBS / IMDM中的几卷。在300 XG在4 ° C 10分钟离心后，细胞悬浮在2％FBS / IMDM计算，或者染色，流式细胞仪检测抗体，或转移到幻灯片使用一个Cytospin离心机姬姆萨染色。
抗体染色和流式细胞仪
- 8时4分在200 XG离心机细胞° C和重悬在寒冷的50％正常小鼠血清中的HBSS（钙和镁无酚红）。
- 放置在每管80μL（12 × 75毫米圆底管）约5 × 10 5细胞，并保持在冰上。添加抗体混合物（约20μL混合，或无抗体控制阴性对照溶液）和混合轻轻拍打管。准备与无抗体或抗CD45抗体，每个荧光校准控制管。在黑暗中孵育20分钟冰放置管。混合管后第10分钟，轻轻拍打。 20分钟潜伏期后，填写与冷的HBSS管和离心8分钟在200 XG，在4 ° C。在寒冷的0.5％的多聚甲醛/的HBSS重悬沉淀。
我们的分析通常用于以下抗体的混合物。髓样分化：细胞CD11b（藻红蛋白共轭克隆ICRF44）/ CD33（allophycocyanin共轭克隆WM53）/ CD45（藻红蛋白- Cy7 congjugated克隆HI30）。红细胞分化：CD71（藻红蛋白共轭克隆的M - A712）/ CD235a（变藻蓝蛋白偶联克隆的GA - R2）/ CD45（藻红蛋白- Cy7 congjugated克隆HI30）。 - 的阿尔文J. Siteman癌症中心在华盛顿大学医学院的细胞的高速分拣机核心升级到5种颜色和两个激光器（BD Biosciences公司）在FACScan流式细胞流式细胞仪和流式细胞仪进行分析使用CellQuest（BD Biosciences公司）或FlowJO v7.2.4（树星公司，亚什兰，美国）软件。
姬姆萨染色
- 以上所述的从氟氯化碳的检测板回收约30,000细胞暂停在0.3毫升2％FBS / IMDM培养和转移到幻灯片使用一个Cytospin离心机在室温下10分钟1000转。
- 设置了九个染色血管，含有下列顺序解决方案。
- 绝对甲醇
- 赖特/姬姆萨原液
- 赖特/吉姆萨缓冲液，pH值6.4
- 在H 2 O的 50％甲醇
- H 2 O
- H 2 O
- 磷酸盐缓冲液，pH值6.0
- H 2 O
- H 2 O
- 放入幻灯片和幻灯片的载体，浸在绝对甲醇（＃1），2分钟吸干多余的甲醇。
- 随即，浸5分钟，赖特/姬姆萨原液幻灯片载波（＃2）。
- 转移到赖特/吉姆萨缓冲液，pH 6.4（＃3）承运人和孵育10分钟。
- 浸在50％甲醇的载体两次（＃4），10倍，在H 2 O（＃5），另外的10倍，H 2 O（＃6），然后在磷酸盐缓冲液，pH值6.0的5倍（＃ 7） 。
- 转移到H 2 O（＃8）承运人和孵育2分钟。在H 2 O（＃9）重复洗。
- 允许的幻灯片空气干燥的载体，完全。取出每张幻灯片，幻灯片用甲醇浸泡Kimwipes背面擦拭去除污渍。将下降了60 Cytoseal和一个密封的玻璃盖。
- 一个500细胞分类计数是每个姬姆萨染色使用奥林巴斯BX51显微镜幻灯片。细胞分为五大类：原始细胞，包括爆炸和promyelocytes;中间的骨髓细胞，包括myelocytes和metamyelocytes;成熟的骨髓细胞，包括乐队，分段中性粒细胞，单核细胞和巨噬细胞，中间的红系细胞，包括中间hemoglobinization的细胞和成熟的红系细胞细胞与完整hemoglobinization。显微照片是采取了奥林巴斯DP71相机60X石油目标。
3.0）代表性的成果：
- 氟氯化碳含量测定：输入细胞群的增殖，分化，和半固体培养基上形成菌落，在14 17天的潜伏期。在这个实验中，这是显而易见的，NUP98 - HOXA9癌基因的表达导致形成突出的红色（红殖民地）（图1）（3）。
- 抗体染色和流式细胞仪流式细胞免疫分型：流量从CFC检测板收集的细胞分化状态的细胞群提供的信息。对某些分化标记的抗体结合使用，宗族和细胞的成熟程度进行评估。在这种情况下，被用来确定CD235a红系细胞。如图2a所示，NUP98 - HOXA9造成CD235a +红系细胞的比例增加，但这些细胞的亮度CD235a表达减少，与对照组相比，说明抑制红细胞的成熟。在图2b中，凭借其CD33阳性骨髓细胞识别。 NUP98 - HOXA9导致在CD33 +细胞的数量减少，在CD11b表达的亮度下降，抑制髓性成熟（3）一致。因此，流式细胞仪检测结果显示，NUP98 - HOXA9造成抑制髓细胞和红细胞的成熟的红细胞增生。
- Giemsa染色：从CFC检测板收集的细胞形态学检查，细胞群的成熟程度和宗族的信息。流式细胞仪的研究中获得的形态获得的结论可能会有所不同，因此这些方法都是相辅相成，相互（3）。实验至少重复3次，每次500细胞分类计数进行区分5个类别，细胞如上所述。这些细胞的例子指出，在图3。结果列和分析，以确定是否有显着性差异癌基因转导的样品和控制。在这种情况下，结果表明，NUP98 - HOXA9造成一个整体的数量增加的细胞，红细胞增生及抑制红和髓系成熟（3）（未显示）。
图例
图1：对人类氟氯化碳形态NUP98 - HOXA9的影响 。
首要人权CD34 +细胞retrovirally转要么控制MSCV - IRES - GFP的向量或向量表示NUP98 - HOXA9，和排序的GFP阳性细胞。一千个细胞接种到每个两个重复板氟氯化碳检测，实验重复3 4独立的时间。代表板无放大（左）和代表红殖民地（右）的低功耗显微照片（3）所示。
图2：流式细胞仪检测显示NUP98 - HOXA9人类首要的CD34 +细胞分化受阻。
（一）流式细胞仪检测红细胞分化：从CFC板的细胞（见图1）收获与抗体染色，CD45和CD235a。 （二）的CD235a +门上绘制直方图（右图），显示相对于对照组细胞表达CD235a流式细胞仪检测髓样分化：从CFC板收获细胞和CD45和CD33染色。 CD33 +门上绘制直方图来显示CD11b表达与对照组比较（右图）。每个门范围内的细胞的百分比（3）所示。
图3：细胞形态显示NUP98 - HOXA9分化的破坏相比，矢量控制 。
从CFC板Cytospin涂片，Giemsa染色。显微照片取自代表一个60倍的石油的目标领域。 B：爆炸，MM：成熟的粒细胞，即时通讯：中间髓系，ME：成熟的红细胞，即：中间红（3）。
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Discussion
已广泛用于氟氯化碳检测，以确定造血祖细胞的增殖和分化的模式，并研究原癌基因的影响（4，5）。它利用液体培养的克隆实验，殖民地代表一个单系祖的后代，并作进一步的分析可以单独删除，。的CFC检测的限制，这是不足够更不成熟的祖细胞或造血干细胞的检测，发现这种细胞的长期培养启动细胞（LTC - IC）的测定（6，7）。这里所描述的实验表明，反洗钱相关基因NUP98 - HOXA9抑制髓系和红系成熟，并导致红细胞增生（1，3）。
由于甲基纤维素为基础的文化是相对长期和氟氯化碳的介质不含有抗生素，这是防止细胞培养的污染，尤其是在和排序后，最重要的。最轻微的细菌或真菌污染，将淹没的文化。流式细胞仪和细胞形态的解读需要一定的经验;受过训练的人员的咨询建议。只有胎牛血清是否适合使用的主要的人类髓系祖细胞已预先筛选应使用试剂表中所列的产品，我们经常使用的是。甲基纤维素为基础的氟氯化碳的媒体都非常粘稠，并同时处理混合均匀和消除气泡板浇筑前，应采取特别的照顾。重要的是要防止干燥过程中的氟氯化碳介质长时间孵化纳入与在一个较大的板块的氟氯化碳板的水盘。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢华盛顿大学医学院和巴恩斯犹太医院在圣路易斯，密苏里州的阿尔文J. Siteman癌症中心，为使用高速细胞分选的核心，提供流式细胞仪检测设备和排序服务。这项工作是由国家资助卫生研究院R01 HL082549和K02 HL084179（NRY）的支持。 Siteman癌症中心是支持部分由NCI癌症中心支援津贴P30 CA91842。Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Life Technologies | 12440 | |
| FBS | Stem Cell Technologies | 06150 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | |
| FLT-3 ligand | PeproTech Inc | 300-19 | |
| GM-CSF | PeproTech Inc | 300-03 | |
| SCF | PeproTech Inc | 300-07 | |
| TPO | PeproTech Inc | 300-18 | |
| IL3 | PeproTech Inc | 200-03 | |
| IL6 | PeproTech Inc | 200-06 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | |
| HBSS | Life Technologies | 14175 | |
| PBS | Life Technologies | 14200 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Methocult GF+ H4435 | Stem Cell Technologies | 04445 | |
| Human Methylcellulose Enriched Media | R&D Systems | HSC005 | |
| Wright/ Giemsa stain | Harleco | 64571 | |
| Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 - Giordano formula | Ricca Chemical Company | 1450 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 8310 | |
| Normal Mouse Serum | Rockland Immunochemicals | D208 | |
| Anti-Human CD11b phyc–rythrin-conjugated | BD Biosciences | 555388 | |
| Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551378 | |
| Anti-Human CD45 phyc–rythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | |
| Anti-Human CD71 phyc–rythrin-conjugated | BD Biosciences | 555537 | |
| Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551336 | |
| Anti-Human CD45 phyc–rythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | |
| 24-well non-treated tissue culture plates | BD Biosciences | 35-1147 | |
| 30 mm non-treated dish | Stem Cell Technologies | 27150 | |
| 100 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Gridded scoring dishes | Stem Cell Technologies | 27500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2097 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2070 | |
| Syringes 3 ml | Stem Cell Technologies | 28240 | |
| 16 gauge blunt-end, 1½ inch needle | Stem Cell Technologies | 28110 | |
| 50 μm CellTrics cell filter | Partec | 04-004-2327 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| TPX sample chambers | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A78710018 | |
| Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Shandon filter cards | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5991022 | |
| Shandon cytospin slide holder | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 59920063 | |
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| 1 μm filter paper | VWR international | 28307-134 | |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Diaphot | |
| Microscope camera | Nikon Instruments | DS-F11 | |
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
| Microscope camera | Olympus Corporation | DP71 | |
| Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC | |
| Cytospin | Shandon, Inc. | Cytospin 2 | |
| Bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810-R | |
| Water purification system | Barnstead | Nanopure-Diamond |
References
- Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , Forthcoming (2010).
- Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
- Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. Human hematopoietic colonies in health and disease. Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).
- Pereira, C., Clarke, E., Damen, J.
- Coulombel, L. Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays. Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).
- Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 88, 3765-3773 (1996).
