Summary
Den kolonibildande celler (CFC)-analysen är ett in vitro test där hematopoetiska stamceller bildar kolonier i ett halvfast medium. En kombination av koloni morfologi, cellmorfologin och flödescytometri används för att bedöma möjligheten för stamceller att föröka sig och skilja längs olika hematopoetiska linjerna.
Abstract
Mänskliga hematopoetisk stamcellstransplantation / progenitorceller erhålls vanligen från benmärg, navelsträngsblod eller perifert blod och används för att studera blodbildningen och leukemogenesis. De har förmåga att differentieras till lymfoida och myeloida linjerna. Den kolonibildande celler (CFC)-analysen används för att studera spridning och differentiering mönster av hematopoetiska stamceller genom sin förmåga att bilda kolonier i ett halvfast medium. Antalet och morfologi av kolonierna som bildas av ett fast antal indataceller ge preliminär information om förmåga stamceller att differentiera och föröka sig. Celler kan skördas från enskilda kolonier eller hela plattan för att ytterligare utvärdera deras antal och stater differentiering med hjälp av flödescytometri och morfologiska utvärdering av Giemsa-färgade diabilder. Denna analys är användbar för att bedöma myeloid men inte lymfoida differentiering. Termen myeloisk i detta sammanhang används i vid bemärkelse till att omfatta granulocytisk, monocytic, erytroida och megakaryocytic linjerna.
Vi har använt denna analys för att bedöma effekterna av onkogener på differentiering av primära humana CD34 + celler från perifert blod. För detta ändamål celler transduced med antingen kontroll retrovirus bygga eller en konstruktion som uttrycker onkogen av intresse, i detta fall NUP98-HOXA9. Vi använder ett vanligt retrovirus vektor, MSCV-IRES-GFP, som uttrycker en bicistronic mRNA som producerar genen av intresse och en GFP markör. Celler är föraktiverade genom att växa i närvaro av cytokiner i två dagar innan retrovirala transduktion. Efter ytterligare två dagar, är GFP + celler som isolerats med fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) och blandas med en metylcellulosa innehåller halvfast mediet kompletteras med cytokiner och inkuberas tills kolonier förekommer på ytan, vanligtvis 14 dagar. Antalet och morfologi av kolonierna är dokumenterade. Cellerna avlägsnas sedan från plåtarna, tvättade, räknade, och utsätts för flödescytometri och morfologiska undersökning. Flödescytometri med antikroppar som är specifika för markörer cellytan uttryck under blodbildningen ger information om härstamning och mognad skede. Morfologiska studier av enskilda celler i mikroskop efter Wright-Giemsa färgning ger ytterligare information om härstamning och mognad. Jämförelse av celler transduced med styrning tomma vektorn till dem transduced med en onkogen visar effekterna av onkogen på hematopoetiska differentiering.
Protocol
1. Beredning av reagens
- Förbered sterila 1000x stamlösningar av FMS-relaterade tyrosinkinas 3 (FLT-3) ligand, granulocyt / makrofag kolonistimulerande faktor (GM-CSF), stamceller faktor (SCF), trombopoetinreceptorn (TPO), interleukin (IL) -3 , och IL-6 i enlighet med tillverkarens anvisningar. Förbered steril lösning Retronectin lager (1mg/ml) också enligt tillverkarens anvisningar. Dela upp dessa stamlösningar i små alikvoter och förvara vid -20 ° C för att undvika upprepade frys-tina.
- Förbered 2% FBS i IMDM.
- Förbered komplett IMDM medium med slutliga koncentrationer på 20% FBS, 2 mM glutamin, 100 enheter / ml penicillin / streptomycin (PS). Lägg till följande cytokiner strax före användning: 100 ng / ml FLT-3 ligand, 20 ng / ml GM-CSF, 100 ng / ml SCF, 100 ng / ml TPO, 50 ng / ml IL-3, och 100 ng / ml IL-6.
- Bered 1% BSA i HBSS (Ca & Mg-fri, utan fenolrött) och 2% BSA i D-PBS (Ca & Mg-fri). Sterilisera lösningar genom att passera 0,22 ìm spruta filter och förvara vid 4 ° C.
- Förbered 0,02% EDTA i HBSS och förvara vid 4 ° C.
- Förbered galv-pseudotyped retrovirus som kodar för DNA-intresse och förvara i alikvoter vid -80 ° C. Detta förfarande är utanför ramen för denna artikel, men beskrivs på annat håll (1-3).
För Giemsa färgning
- Strax före användning, filtrera Wright / Giemsa bets lösning två gånger genom 1 mm filterpapper i en ren glasflaska.
- Omedelbart före användning, förbereda Wright / Giemsa buffert pH 6,4, genom att blanda 50 ml av det filtrerade Wright / Giemsa bets lösning och 200 ml fosfatbuffert, pH 6,4 - Giordano formel.
- Bered fosfatbuffert, pH 6,0 genom att lösa 27,3 g KH 2 PO 4 och 4,62 g Na 2 HPO 4 i 3,5 LH 2 O.
- Förbered 50% metanol i H 2 O.
2. FÖRFARANDE
Upptining och före aktivering av CD34 + celler
- Tina en flaska med frysta CD34 + celler snabbt vid 37 ° C genom att försiktigt skaka tills en sista liten iskristall är kvar och överför cellsuspensionen (1 ml) till en 50 ml koniska rör. Försiktigt skölja av de resterande celler från injektionsflaskan med 1 ml rumstemperatur 2% FBS / IMDM och lägga till den droppvis till 50 ml tub samtidigt snurra försiktigt. Vänta i 3 minuter. Sedan långsamt tillsätt 2 ml 2% FBS / IMDM, medan blanda försiktigt och vänta i 3 minuter. Upprepa proceduren genom att tillsätta 2% FBS / IMDM det är samma volym som den utspädda cellsuspensionen 3 minuters mellanrum, virvlande försiktigt i mellan tillägg, tills den slutliga volymen uppgår till 32 ml.
- Centrifugera vid 250 xgi 10 minuter i rumstemperatur och avlägsna supernatanten lämnar efter ca 0,5 ml.
- Tvätta pelleten genom att avbryta i 20 ml 2% FBS / IMDM och centrifugering vid 200 xgi 8 minuter i rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten och suspendera cellerna i hela IMDM medel på cirka 0,5 x 10 6 celler / ml. Ta 10 ìl av cellsuspensionen i ett mikrorör, blanda med samma mängd Trypan blå-lösning (0,4%) och räkna med en hemocytometer.
- Späd cellerna att 0,1-0,15 X 10 6 celler / ml genom att lägga hela IMDM mediet kompletteras med cytokiner (se 1.3)
- Kultur cellerna i en fuktig 37 ° C inkubator med 5% CO 2 i 2 dagar.
Retroviral transduktion av virus före lastning
- På dagen för transduktion, räkna celler innan viruset förspänning för att bestämma det antal brunnar för att vara förberedd.
- Späd Retronectin stamlösning till 25 mikrogram / ml och tillsätt 400 l i varje brunn på en 24-såväl obehandlade vävnadskultur plattan. Inkubera 2 timmar vid rumstemperatur i laminärt flöde biosäkerhet huva till redan päls.
- Ta bort Retronectin lösning och tillsätt 400 l med 2% BSA i D-PBS i varje brunn. Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur.
- Tina lösningar virus lager och hålla på is. Ta bort BSA lösningen, tillsätt 0,5 ml av virus förberedelse till varje brunn, och centrifugera vid 2200 xg vid 4 ° C i 15 minuter.
- Ta bort viruset lösningen från brunnar och upprepa viruset lastning beskrivs i 2,10 tre gånger.
- Skölj varje brunn med kallt 0,5 ml HBSS (+ Ca och Mg) eller IMDM.
- Samla föraktiverade CD34 + celler genom att centrifugera vid 200 xg under 8 minuter i rumstemperatur.
- Resuspendera cellerna vid 0,1-0,15 x 10 6 celler per 1,5 ml i fullständig IMDM medium med cytokiner.
- Tillsätt 1,5 fjädring ml cell i varje brunn och inkubera i en fuktig 37 ° C inkubator med 5% CO 2 i 2 dagar.
Cell sortering och insamling av transduced celler
- Försiktigt men grundligt avbryta celler i ovanstående virus laddad plattas och filtrera genom ett 50 ìm CellTrics cellen filter till en konisk tub. Ta 10 ìl av cellsuspensionen i ett mikrorör, blanda med en lika stor volym Trypan blå lösning och räkna med en hemocytometer. Skölj varje brunn med 0,8 ml kallt 0,02% EDTA / HBSS (Ca & Mg-fritt utan fenol rött) och lägga till i samma samling röret genom en 50 ìm CellTrics cell filter.
- Centrifugera cellerna vid 200 xg under 8 minuter vid 4 ° C, och tvätta pelleten med kallt HBSS (Ca & Mg-fritt utan fenolrött) genom att centrifugera vid 200 xg under 8 minuter vid 4 ° C.
- Återsuspendera pelleten i 1% BSA / HBSS (Ca & Mg-fritt utan fenol rött) till en koncentration på 15 x 10 6 / ml eller en minsta volym av 0,250 ml för cell sortering. Håll celler på isen i mörkret. Förbered ett rör med kall 20% FBS / IMDM / Glutamin / PS medium för att samla in sorterat celler. Sortering utförs på High Speed Cell Sorter Kärnan i Alvin J. Siteman Cancer Center vid Washington University School of Medicine använder ett MoFlo hög hastighet sorterare (Dako, Glostrup, Danmark).
CFC-analysen
- Tina erforderligt antal 3 ml alikvoter av CFC-analys medier. Vortex kraftfullt för att blanda och låt rören stå minst 5 min för att låta eventuella bubblor att stiga till ytan innan du lägger celler.
- För att få cellkoncentrationen för varje sorterad prov, dela cell nummer från sorteringsanläggning som ungefärliga cellsuspension volym. Ta 3000 virus transduced, sorterade cellerna i en steril mikrorör med kallt 2% FBS / IMDM. Pre-justera volymen på 2% FBS / IMDM så att den slutliga fjädring volymen kommer att vara cirka 0,3 ml.
- Häng celler och överföra hela 0,3 fjädring ml cell till en 3 ml alikvot av Methocult GF + H4435, som består av 1% metylcellulosa, 30% FBS, 1% BSA, 10 -4 M 2-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin, 50 ng / ml SCF, 20 ng / ml GM-CSF, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, 20 ng / ml G-CSF, och 3 enheter / ml erytropoietin IMDM. Mänskliga metylcellulosa berikad Media (FoU-system) som består av 1,3% metylcellulosa, 25% FBS, 1% BSA, 5 x 10 -5 M 2-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin, 50 ng / ml SCF, 20 ng / ml GM-CSF, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, 20 ng / ml G-CSF, och 3 enheter / ml erytropoietin IMDM kan också användas.
- Vortex kraftfullt för att göra blandningen stiger helt och falla 3-4 gånger. Låt röret stå still i 3 min.
- Fäst en 16 gauge trubbig slut nål för en 3 ml spruta och dra upp 2,2 ml. Dra inte upp stora bubblor, utvisa dem i början genom att trycka ut ett par gånger. Tryck ut 1,1 ml vardera i två 30 mm obehandlade fat och bredde ut blandningen jämnt genom att rotera.
- Placera dubbla plattor i en 100 mm platta tillsammans med en vatten skål som innehåller 3 ml sterilt vatten. Kultur i 14 - 17 dagar.
- Karaktärisera och poäng kolonierna enligt deras morfologi med ett inverterat mikroskop vid 40x förstoring i en kultur maträtt markerad med en poäng rutnät. Vid tillämpning av vår analys, är de kolonier klassificeras i tre kategorier: ren erytroida, myelomonocytär och blandade. Se tillverkarens instruktioner för mer koloni underindelningar.
- Hela CFC-analysen tallriken kan skannas utan förstoring med en vanlig scanner med 600 dpi, och låg effekt (40x) mikrofotografier av kolonier kan tas med ett inverterat mikroskop utrustat med en färgkamera.
- För ytterligare analyser av differentiering och spridning, är celler från hela CFC-analysen plåt återvinns genom att avbryta i flera volymer av rumstemperatur 2% FBS / IMDM. Efter centrifugering vid 300 xgi 10 minuter vid 4 ° C, är de celler återsuspenderade i 2% FBS / IMDM räknas, och antingen färgas med antikroppar för flödescytometri eller överföras till bilder med hjälp av en Cytospin centrifug för Giemsa färgning.
Antikropp färgning och flödescytometri
- Centrifugera cellerna vid 200 xg under 8 minuter vid 4 ° C och återsuspendera i kalla 50% vanlig mus serum i HBSS (Ca & Mg-fritt utan fenolrött).
- Placera ungefär 5 x 10 5 celler i 80 l per rör (12 x 75 mm rundbottnad rör) och håller på is. Lägg antikropp blandning (ca 20 l blandning eller negativ kontroll lösning för no-antikroppar kontroller) och blanda genom att knacka lätt på rören. Förbered rör kalibrering kontroll utan antikroppar eller med en anti-CD45-antikropp för varje fluorokrom. Placera rören på is i mörkret och inkubera i 20 minuter. Blanda genom att knacka lätt tuber efter de första 10 min. Efter 20 minuter inkubation, fylla rören med kallt HBSS och centrifugera vid 200 xg under 8 minuter vid 4 ° C. Återsuspendera pelleten i kylan 0,5% paraformaldehyd / HBSS.
Följande blandningar av antikroppar används vanligtvis för vår analys. För myeloid differentiering: CD11b (fykoerytrin-konjugerat klon ICRF44) / CD33 (allophycocyanin-konjugerade klon WM53) / CD45 (fykoerytrin-Cy7-congjugated klon HI30). För erytroida differentiering: CD71 (fykoerytrin-konjugerat klon M-A712) / CD235a (allophycocyanin-konjugerat klon GA-R2) / CD45 (fykoerytrin-Cy7-congjugated klon HI30). - Flödescytometri utförs på High Speed Cell Sorter Kärnan i Alvin J. Siteman Cancer Center vid Washington University School of Medicine på en FACScan flödescytometer uppgraderas till 5 färger och två lasrar (BD Biosciences) och analyseras med hjälp CellQuest (BD Biosciences) eller FlowJO v7.2.4 (Träd Star, Inc., Ashland, OR, USA) mjukvara.
Giemsa färgning
- Cirka 30.000 celler återhämtat sig från CFC-analysen plattor som beskrivs ovan är upphängda i 0,3 ml 2% FBS / IMDM och överförs till en bild med hjälp av en Cytospin centrifugera vid 1000 rpm i 10 min i rumstemperatur.
- Sätt upp nio färgning fartyg som innehåller lösningar i följande ordning.
- Absolut Metanol
- Wright / Giemsa stamlösning
- Wright / Giemsa buffert, pH 6,4
- 50% metanol i H 2 O
- H 2 O
- H 2 O
- Fosfatbuffert, pH 6,0
- H 2 O
- H 2 O
- Placera glider in en bild bärare och doppa i absoluta metanol (# 1) i 2 min och blot bort överflödigt metanol.
- Omedelbart dopp bilden bärare i Wright / Giemsa stamlösning (# 2) i 5 minuter.
- Överför transportören till Wright / Giemsa buffert, pH 6,4 (# 3) och inkubera i 10 min.
- Doppa transportören två gånger i 50% metanol (# 4), 10 gånger i H 2 O (# 5), en annan 10 gånger i H 2 O (# 6), och sedan 5 gånger i fosfatbuffert, pH 6,0 (# 7) .
- Överför transportören i H 2 O (# 8) och inkubera i 2 min. Upprepa tvätta i H 2 O (# 9).
- Låt objektglasen lufttorka helt i transportören. Ta bort varje bild och torka baksidan av bilden med metanol-indränkt Kimwipes att ta bort fläckar. Placera en droppe Cytoseal 60 och ett skyddsglas att täta.
- Ett 500-cell differentialräkning görs för varje Giemsa-färgade bilden med hjälp av en Olympus BX51 mikroskop. Celler delas in i fem kategorier: primitiva celler inkluderar blaster och promyelocyter, mellanliggande myeloida celler inkluderar myelocyter och metamyelocyter, mogna myeloida celler inkluderar band, segmenterade neutrofiler, monocyter och makrofager, mellanliggande erytroida celler innehåller celler med mellanliggande hemoglobinization, och mogna erytroida celler inkluderar cellerna med full hemoglobinization. Mikrofotografier är tagna med en Olympus DP71 kamera med en 60x olja mål.
3,0) representativa resultat:
- CFC analysen: Vissa av indatacell befolkningen kommer föröka sig, skilja, och bilda kolonier på halvfasta mediet under den 14-17-dagars inkubationstid. I detta experiment är det uppenbart att uttryck för NUP98-HOXA9 onkogen orsakade bildandet av framstående röd (erytroida kolonier) (Figur 1) (3).
- Antikropp Färgning och flödescytometri: flödescytometrisk immunfenotypning av celler som samlats in från CFC-analysen plattor ger information om differentiering tillståndet i cellen befolkningen. Genom kombinerad användning av antikroppar mot vissa differentiering markörer kan härstamning och grad av mognad av celler bedömas. I detta fall CD235a användes för att identifiera erytroida celler. Som framgår av Figur 2A, orsakade NUP98-HOXA9 en ökning av andelen CD235a + erytroida celler, men ljusstyrkan i CD235a uttryck genom att dessa celler var minskat jämfört med kontrollgruppen, vilket indikerar hämning av erytroida mognad. I figur 2B är myeloida celler identifieras genom sin CD33 positivitet. NUP98-HOXA9 orsakade en minskning av antalet CD33 + celler, med en minskning av ljusstyrka CD11b uttryck, i överensstämmelse med en hämning av myeloisk mognad (3). Således flödescytometri Resultaten visar att NUP98-HOXA9 orsakade en erytroida hyperplasi med en hämning av både myeloisk och erytroida mognad.
- Giemsa Färgning: morfologisk undersökning av celler som samlats in från CFC-analysen plattor ger information om härstamning och grad av mognad i cellen befolkningen. De slutsatser som erhålls morfologiskt kan skilja sig från sådana som erhållits genom flödescytometrisk studier, och därför dessa metoder kompletterar varandra (3). Försöket skall upprepas minst 3 gånger, och varje gång en 500-cell differentialräkning görs för att särskilja fem kategorier av celler som beskrivs ovan. Exempel på dessa celler påpekade i figur 3. Resultaten har sammanställts och analyserats för att avgöra om det finns statistiskt signifikanta skillnader mellan onkogen-transduced prov och kontroll. I detta fall visade resultaten att NUP98-HOXA9 orsakade en total ökning av antalets av celler, med erytroida hyperplasi och hämning av både erytroida och myeloisk mognad (3) (ej på bild).
FIGUR LEGENDS
Figur 1: Effekterna av NUP98-HOXA9 om mänskliga CFC morfologi.
Primära humana CD34 + celler var retrovirally transduced med antingen kontroll MSCV-IRES-GFP vektor-eller vektor som uttrycker NUP98-HOXA9, och celler sorterades för GFP positivitet. Ett tusen celler var seedade i vardera av två dubbla plattor för CFC analys och experimentet upprepades 3 4 oberoende gånger. Representant plattor utan förstoring (vänster) och låg mikrofotografier makt representativa erytroida kolonier (höger) visas (3).
Figur 2: Flödescytometri visar störningar av mänsklig primära CD34 + celler differentiering av NUP98-HOXA9.
(A) Flödescytometri för erytroida differentiering: Celler från CFC plåtarna (se figur 1) har skördats och färgas med antikroppar mot CD45 och CD235a. Den CD235a + grinden var ritade på ett histogram (högra panelen) för att visa uttrycket av CD235a i förhållande till kontroll celler (B) Flödescytometri för myeloisk differentiering: Celler från CFC-plattorna har skördats och färgades med CD45 och CD33. Den CD33 + grinden var ritade på ett histogram för att visa CD11b uttryck jämfört med kontroll (högra panelen). De procentsatser av celler som omfattas av varje grind visas (3).
Figur 3: cellmorfologin visar störning av differentiering av NUP98-HOXA9 jämfört med vektorstyrning.
Cytospin utstryk var beredda från CFC tallrikar och färgas med Giemsa. Mikrofotografier togs från representativa områden med en 60x olja mål. B: blast, MM: mogna myeloida, IM: mellanliggande myeloisk, ME: mogen erytroida, IE: mellanliggande erytroida (3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CFC-analys har använts i stor utsträckning för att fastställa spridningen och mönster differentiering av hematopoetisk stamceller och att studera effekterna av onkogener (4, 5). Det har den fördelen framför flytande kulturer av att vara en klonal analys, så att kolonierna representerar avkomman av en enda stamceller och kan individuellt bort för vidare analys. Begränsningen av CFC-analysen är att det inte är tillräcklig för att upptäcka mer omogna stamceller eller hematopoetisk stamceller, sådana celler detekteras med hjälp av den långsiktiga kultur-initiera cell (LTC-IC)-analysen (6, 7). Experimenten beskrivs här visar att AML-associerade onkogen NUP98-HOXA9 hämmar myeloisk och erytroida mognad och orsakar erytroida hyperplasi (1, 3).
Eftersom metylcellulosa-baserade kulturen är relativt långsiktiga och CFC mediet inte innehåller antibiotika, är det av största vikt för att förhindra kontaminering av cellkulturer, speciellt under och efter sortering. Minsta lilla bakterie-eller svampinfektioner föroreningar kommer att överbelasta kulturen. Tolkning av flödescytometri och cellmorfologin kräver erfarenhet, samråd med utbildad personal rekommenderas. Endast FBS som har pre-screening för lämplighet för användning med primära humana myeloida stamceller bör användas, den produkt som vi rutinmässigt använder finns med i reagenser tabellen. Metylcellulosa-baserade CFC media är mycket trögflytande och särskild försiktighet bör iakttas vid hantering av dem för att blanda jämnt och eliminera bubblor innan strömmar in plattor. Införande av ett vatten skålen med CFC plattorna i en större platta är viktigt att förhindra uttorkning av CFC mediet under långvarig inkubation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Alvin J. Siteman Cancer Center vid Washington University School of Medicine och Barnes-Jewish Hospital i St Louis, MO, för användning av High Speed Cell Sorter Core, som gav utrustning flödescytometri och sortering tjänster. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag R01 HL082549 och K02 HL084179 (NRY). Den Siteman Cancer Center stöds delvis av en NCI Cancer Center Support Grant P30 CA91842.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Life Technologies | 12440 | |
| FBS | Stem Cell Technologies | 06150 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | |
| FLT-3 ligand | PeproTech Inc | 300-19 | |
| GM-CSF | PeproTech Inc | 300-03 | |
| SCF | PeproTech Inc | 300-07 | |
| TPO | PeproTech Inc | 300-18 | |
| IL3 | PeproTech Inc | 200-03 | |
| IL6 | PeproTech Inc | 200-06 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | |
| HBSS | Life Technologies | 14175 | |
| PBS | Life Technologies | 14200 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Methocult GF+ H4435 | Stem Cell Technologies | 04445 | |
| Human Methylcellulose Enriched Media | R&D Systems | HSC005 | |
| Wright/ Giemsa stain | Harleco | 64571 | |
| Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 - Giordano formula | Ricca Chemical Company | 1450 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 8310 | |
| Normal Mouse Serum | Rockland Immunochemicals | D208 | |
| Anti-Human CD11b phyc–rythrin-conjugated | BD Biosciences | 555388 | |
| Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551378 | |
| Anti-Human CD45 phyc–rythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | |
| Anti-Human CD71 phyc–rythrin-conjugated | BD Biosciences | 555537 | |
| Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551336 | |
| Anti-Human CD45 phyc–rythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | |
| 24-well non-treated tissue culture plates | BD Biosciences | 35-1147 | |
| 30 mm non-treated dish | Stem Cell Technologies | 27150 | |
| 100 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Gridded scoring dishes | Stem Cell Technologies | 27500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2097 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2070 | |
| Syringes 3 ml | Stem Cell Technologies | 28240 | |
| 16 gauge blunt-end, 1½ inch needle | Stem Cell Technologies | 28110 | |
| 50 μm CellTrics cell filter | Partec | 04-004-2327 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| TPX sample chambers | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A78710018 | |
| Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Shandon filter cards | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5991022 | |
| Shandon cytospin slide holder | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 59920063 | |
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| 1 μm filter paper | VWR international | 28307-134 | |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Diaphot | |
| Microscope camera | Nikon Instruments | DS-F11 | |
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
| Microscope camera | Olympus Corporation | DP71 | |
| Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC | |
| Cytospin | Shandon, Inc. | Cytospin 2 | |
| Bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810-R | |
| Water purification system | Barnstead | Nanopure-Diamond |
References
- Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , Forthcoming (2010).
- Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
- Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. Human hematopoietic colonies in health and disease. Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).
- Pereira, C., Clarke, E., Damen, J.
- Coulombel, L. Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays. Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).
- Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 88, 3765-3773 (1996).
