Summary
De omloopsnelheid van virussen in zee-en zoetwater-systemen kan worden geschat door een reductie en herhaling techniek. De gegevens kunnen de onderzoekers om de tarieven van de virus-gemedieerde microbiële sterfte in aquatische systemen af te leiden.
Abstract
Virussen zijn alomtegenwoordig componenten van mariene en zoetwater-systemen, en staan bekend als belangrijke agenten van microbiële sterfte. Ontwikkeling van kwantitatieve schattingen van dit proces is van cruciaal belang als we kunnen dan de ontwikkeling van betere modellen van microbiële gemeenschap structuur en functie als ons begrip van hoe virussen werken in het water levende biogeochemische cycli te veranderen. Het virus reductie techniek stelt onderzoekers in staat in te schatten de snelheid waarmee virusdeeltjes vrijkomen uit de endemische microbiële gemeenschap. In het kort, is de overvloed van de vrije (extracellulair) verminderde virussen in een monster, terwijl de microbiële gemeenschap wordt gehandhaafd op in de buurt van omgevings-concentratie. De microbiële gemeenschap wordt dan geïncubeerd in de afwezigheid van vrije virussen en de snelheid waarmee virussen terugkomen in de steekproef (door de afbraak van reeds besmet zijn leden van de gemeenschap) kan worden gekwantificeerd door epifluorescentie microscopie of, in het geval van specifieke virussen, kwantitatieve PCR. Deze tarieven kunnen vervolgens worden gebruikt om de snelheid van microbiële sterfte als gevolg van virus-gemedieerde cel-lysis te schatten.
Protocol
1. Ultrafiltratie van zeewater aan "Virus-vrij" Water (Wilhelm & Poorvin 2001) Genereer
- Ongeveer 20L van zeewater / lakewater is zo aseptisch verzameld als mogelijk te maken.
- Water is serieel prefiltered door middel van 142-mm polycarbonaat 0,8 micrometer filters die bij -20 ° C worden bewaard voor de gemeenschap analyse. Grotere poriegrootte filters kunnen worden gebruikt voordat deze stap voor zeer productieve systemen.
- Voor het verkrijgen van ultra gefiltreerde water uit een Amicon M12-systeem (Millipore) een 30 kDa-cut-off spiraal cartridge wordt gebruikt voor alle virussen uit te sluiten, zelfs kleine RNA-virussen.
- De monsters worden verwerkt en geconcentreerd op ~ 25% snelheid met ~ 15 tot 16 kPa van tegendruk.
- De resterende steekproef van ~ 500 ml water bevat een geconcentreerde virus gemeenschap (die kan worden opgeslagen voor andere experimenten), terwijl de resterende 19,5 L van virus-vrij water zal worden gebruikt voor de productie van virale assays.
- Na elke dag van gebruik, moet het Amicon M12-systeem worden gereinigd om schade aan het membraan van de filterpatroon te voorkomen.
- Als u werkt met zeewater, spoel het membraan uit met minstens 6L van Milli-Q water, gevolgd door een wassen met 0,1 N NaOH-oplossing gedurende 30-45 minuten.
- Weer spoelen de cartridge met minstens 6L van Milli-Q water.
- Als u klaar bent met het M12-systeem, zou de spiraal patroon worden opgeslagen in een 0.05MH 3 PO 4 oplossing bij 4 ° C.
2. Virus Reductie Methode voor virale productie (Wilhelm et al.. 2002)
- Tot 500 ml van het zeewater / lakewater monster met zowel gastheer en virussen wordt verkregen en geplaatst in een sterifilter eenheid met een 0,2-um een nominale poriegrootte lage eiwitbinding filter (bijv. Durapore) op het apparaat geplaatst.
- Het monster wordt zachtjes vacuüm druk op <200 mmHg, terwijl voortdurend resuspenderen het monster met behulp van een steriele transferpipet om bacteriële cellen te remmen uit te concentreren op de filter.
- Langzaam drie volumes van ultrafiltraat worden toegevoegd aan de bacteriesuspensie significant te verminderen van het aantal vrije virussen in het monster.
- De bacteriële fractie wordt verdund terug tot 500 ml met virus-vrij water en verdeeld in drie herhalingen van 150 ml per stuk en zijn geplaatst in duidelijke 250ml polycarbonaat flessen.
3. Tangentiële Flow Filtration (TFF) Methode voor Virale Productie (Weinbauer et al.. 2.002, Winget et al.. 2005)
TFF stelt een alternatieve aanpak voor de reductie van het virus-methode.
- Ongeveer 500 ml van natuurlijke monster wordt zoals hierboven beschreven.
- Dit monster wordt geconcentreerd met behulp van een 0,2-um een nominale poriegrootte tangentiële flow filtratie systeem.
- Wanneer de bacteriële fractie is teruggebracht tot ongeveer 10-15 ml, is ultrafiltratie, virus-vrij water toegevoegd en verdeeld zoals hierboven.
- De identieke flessen worden geïncubeerd bij in situ-omstandigheden met behulp van klimaatkamers.
- Lichtniveaus worden gewijzigd aan de oppervlakte omstandigheden met behulp van blauw getint acryl of helder acryl met een netto-screening om de lichtintensiteit te verlagen.
- Omgevingstemperatuur oppervlaktetemperaturen worden vaak verkregen door middel van een vloeiende zeewater dek incubator.
- Monsters voor bacteriële en virale overvloed schattingen zijn genomen op tijdstip 0 met een uiteindelijke concentratie van 2,0-2,5% steriele glutaraldehyde toegevoegd in cryovials. Deze monsters worden onmiddellijk flash bevroren met vloeibare stikstof en bewaard bevroren tot verwerkt.
- Als vloeibare stikstof is niet beschikbaar is, kan microscoopglaasjes worden bereid en onmiddellijk verwerkt (zie procedure hieronder)
- Deelmonsters worden verzameld om de 2,5 uur voor ten minste 10 uur door de hierboven beschreven werkwijze.
- Op dit moment water kan worden verzameld voor kwantitatieve PCR analyse. Tot 5 ml van het monster kan worden toegevoegd aan een cryovial zonder fixatief agent met onmiddellijke flits bevriezen in vloeibare stikstof.
4. Virale Productie Microscopie (Noble & Fuhrman 1998, Wen et al.. 2004)
- Bevroren monsters tot 0,02-um worden gefilterd voor microscopie moeten worden ontdooid op ijs.
- Bereid een voorraad oplossing van SYBR Green door verdunning van de stockoplossing 01:10 met steriel water. Vervolgens uit de voorraad opgelost, een werkende oplossing door het toevoegen van 1 ml van de stamoplossing tot 39 ml steriel water. Een 50% glycerol, 50% fosfaat gebufferde zoutoplossingen (PBS, 0,05 M Na 2 HPO 4, 0,85% NaCl, pH 7,5) en verse 2,5% voorraad oplossing van p-fenyleendiamine moet ook worden voorbereid voordat u begint. Houd de 50% glycerol/50% PBS-oplossing bij 4 ° C en de p-phenylenediamine voorraad bij -20 ° C in het donker tot de start. Recht toe te voegen voordat het filteren van de p-fenyleendiamine aan de 50% glycerol/50% PBS tot een uiteindelijke concentratie van 0,1% om te worden gebruikt als de Antifade oplossing.
- Plaats een 25 mm 0.02-um Anodisc filter op de top van een 0,45-um MicronStep, cellulose steun filter. Voeg 850 ul van de vaste monster naar de top van de Anodisc en vacuüm bij 20 pKa tot het volledig gedroogd. Plaats 100 pl van SYBR Green werkende oplossing voor een steriele petrischaal en, met het vacuüm nog op, voorzichtig de Anodisc te verwijderen uit het filter toren en plaats op de SYBR Green. Incubeer de monsters in het donker bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Verwijder voorzichtig het filter uit de SYBR Green oplossing en pit de achterkant van het filter met een Kimwipe alle overblijvende kleurstof te verwijderen. Indien gewenst, terug het filter naar de toren en geef tot 800 ul van 0.02-um gefilterd water of steriele media door het filter te spoelen overtollige vlek.
- Voeg een kleine druppel antifade oplossing op een objectglaasje en plaats een deksel slip op de top. Verwijder het deksel glijden en voeg de gedroogde filter om de microscoop schuiven nat met de antifade oplossing. Opnieuw, voeg een kleine hoeveelheid antifade oplossing voor het dekglas en langzaam te plaatsen op de top van het filter, en zorg ervoor om zich te ontdoen van eventuele luchtbellen die zich kunnen vormen.
- Onmiddellijk te bevriezen de dia's bij -20 ° C totdat het nodig is (deze moet worden gebruikt binnen een paar maanden om verkleuring te voorkomen en verlaagde virus telt)
- Virussen zijn opgesomd met behulp van fluorescentie microscopie (in ons geval een Leica DMRXA microscoop) met een brede blauwe filter set (λ Ex = 450 tot 490 nm, λ = 510 nm Em met een onderdrukking filter bij λ = 510 nm). Elk filter heeft minstens 20 gebieden geteld bekijken, zorg ervoor dat de totale virussen kwantificeren van elk veld net een gelijkmatige verdeling van virussen over het filter membraan te verzekeren.
- Gemiddelde tarieven van het virus herhaling van de drie onafhankelijke herhalingen worden dan berekend en een standaarddeviatie wordt bepaald door de productie-tarieven.
5. Representatieve resultaten
De ruwe gegevens verzameld door de onderzoeker vereist minimale wiskundige bewerking om herhaling tarieven van het virus overvloed te genereren. De primaire gegevens als gevolg van deze studie is de herhaling tarieven van het virus overvloed in de deelmonsters van de incubaties. Deze resultaten vormen onafhankelijk regressies van het virus overvloed versus de tijd voor elk van de monsters. Voor elk monster de individuele incubaties fungeren als een behandeling, zodat door het invullen van drie gelijke-incubatie kan de onderzoeker berekening van de rente, alsook een schatting van de variatie (bijvoorbeeld standaarddeviatie) (zie figuur 1).
Een waarschuwing van dit proces is dat de vermindering van virus overvloed onveranderlijke leidt tot een vermindering in de ontvangende cellen in het monster die het dragen van de last virus. Ter compensatie van dit verlies, opsomming van bacteriële overvloed van zowel de bron (ongefilterd zeewater of meer water) en de T = 0 incubatie monster nodig. Deze informatie kan gebruikt worden om rekening te houden voor het percentage van de verloren cellen: de veronderstelling dat het proces van het verminderen van virus overvloed niet selectief is voor of tegen een lid van de microbiële gemeenschap, deze factor kan dan gebruikt worden om de raming van de in situ productie snelheid van virussen .
Figuur 1. De productie van virusachtige deeltjes over een 10 uur incubatie bij in situ-omstandigheden met behulp van epifluorescentie microscopie. Monsters werden verzameld tijdens een algenbloei voor de kust van Nieuw-Zeeland in september 2008.
Figuur 2. Schematische weergave van de workflow-proces voor het testen virus productie. Het proces begint met de ultrafiltratie van het monster water om virus-vrij water te genereren. Dit is ingevuld met behulp van een ultrafiltratie-systeem. Parallel watermonsters worden verzameld van dezelfde site en de vrije virussen geleid door een filter, terwijl de microbiële gemeenschap (die een mengsel van besmette en niet-geïnfecteerde cellen) blijft behouden. Deze gemeenschap wordt vervolgens opnieuw gesuspendeerd in het virus vrije water en geïncubeerd onder in situ-omstandigheden. De herhaling snelheid van virussen wordt dan gecontroleerd op de komende 10 uur om de tarieven van het virus de productie te bepalen.
Discussion
Een essentieel onderdeel in het begrijpen hoe virussen mariene microbiële gemeenschappen invloed is het bepalen van de snelheid waarmee virusdeeltje worden geproduceerd. Gezien het feit dat abundanties zijn (min of meer) statisch in de meeste systemen (Wilhelm & Suttle 1999, Weinbauer 2004), en dat er virussen worden verwijderd of gemaakt van niet-infectieuze snel in aquatische systemen (Wilhelm et al.. 1998), dan de productie tarieven moeten worden ten opzichte van snelle deeltjes om verloren te vervangen.
Het schatten van de sterfte virussen veroorzaken aan de microbiële gemeenschap vereist een kennis van hoe veel virussen worden geproduceerd elke keer een virus lyseert een cel (de "burst size"). Virus barsten maten in natuurlijke monsters kan sterk variëren. Burst afmetingen kan direct worden bepaald door transmissie elektronenmicroscopie (bijv. Weinbauer & Peduzzi 1994), maar dit is vaak dan de mogelijkheden van een bepaald laboratorium of niet altijd even praktisch. In situaties waar ze niet kunnen empirisch worden bepaald, kan de literatuur waarden van 24 virussen per lytische geval worden gebruikt voor het mariene systemen en 34 voor zoetwater-systemen (Parada et al.. 2006). Als de snelheid van het virus productie wordt gedeeld door dit nummer, het resultaat is de overvloed aan cellen per volume vernietigd door virussen op een dagelijkse basis. De microben gelyseerd waarde kan vervolgens worden gedeeld door de staande voorraad van bacteriële overvloed wat resulteert in het virus geïnduceerde sterfte voor het systeem in vraag: de bestaande schattingen lopen uiteen van enkele procenten tot bijna de hele bevolking en zijn vaak afhankelijk van andere factoren in het systeem in kwestie (Wilhelm & Matteson 2008). Voor het bepalen van het percentage van de totale mortaliteit dit aantal wordt vaak vermenigvuldigd met twee (werken vanuit de veronderstelling dat 50% van de cellen gaan om te reproduceren en 50% van de cellen verloren zijn gegaan, Weinbauer 2004).
Gezien het feit dat voedingsstoffen en sporenelementen biologische beschikbaarheid (bijv. N, P, Fe) kan de snelheid van de primaire productie te beperken, en als zodanig koolstof flux, door middel van aquatische systemen, en het begrip van de rol van virus-driven microbiële sterfte in dit proces is geworden van belang voor mariene geochemici. Verschillende schattingen bestaan nu suggereren dat virussen terug release een aanzienlijke concentraties van voedingsstoffen elementen aan de waterkolom op een dagelijkse basis (Rowe et al.. 2008, Higgins et al.. 2009) en dat deze elementen snel geassimileerd worden door de microbiële gemeenschap (Poorvin et Al. 2.004, Mioni et al.. 2005). Het tarief van de voedingsstoffen flux aan het milieu kan worden bepaald door vermenigvuldiging van het aantal cellen vernietigd door de hoeveelheid voedingsstoffen per cel (aangeduid als "quota"). Deze informatie kan een essentieel onderdeel van ons begrip van hoe microbiële voedselketens functie in aquatische systemen.
Lopende ontwikkelingen: De huidige inspanningen door een reeks onderzoeksgroepen te betrekken aanpassing van de bovenstaande strategie om specifieke virussen te sommen binnen de gemeenschap en als zodanig, om te bepalen hoe specifieke organismen worden beïnvloed door virusactiviteit. Om dit te doen onderzoekers gebruik maken van de kwantitatieve polymerase chain reaction (qPCR) om de overvloed aan specifieke virussen groepen of families die schatten in parallel aan de ramingen van de totale virus gemeenschap. De resultaten worden vervolgens direct toegepast op schattingen van het virus sterfte, nutriëntenconsumptie, etc voor specifieke groepen plankton te bieden. Deze krachtige nieuwe aanpak kunnen de onderzoekers in de komende jaren veel dieper graven in processen in verband met de ecologie van virussen en, voor de eerste keer, om de interacties van specifieke virus-gastheer gemeenschappen buiten de beperkingen van de laboratorium-systemen te kwantificeren.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De publicatie van dit artikel werd ondersteund door een subsidie van het Office of Research aan de universiteit van Tennessee. De auteurs bedanken de vorige generatie van studenten en onderzoekers die hebben gewerkt aan deze procedures te verfijnen. Onderzoek werd ondersteund door subsidies van de National Science Foundation (NSF-0851113, 0825405 en NSF-NSF-0550485).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% p-phenylenediamine | Acros Organics | 130575000 | Stock for Antifade |
| Amicon Proflux M12 system | EMD Millipore | N/A | Any ultrafiltration device may be used for this step |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Invitrogen | S-7563 | |
| Helicon S10 30kDa Filter | EMD Millipore | CDUF010LT | |
| Pelicon XL filters 0.22 μm | Fisher Scientific | PXGVPPC50 | |
| GE 0.2 μm PCTE membrane filters (47mm) | Fisher Scientific | 09-732-35 | |
| Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System | EMD Millipore | XX42LSS11 | Other TFF systems may be used for this step |
| 0.45 μm Micronstep, Cellulosic, white plain filters (25mm) | Fisher Scientific | E04WP02500 | |
| GE Whatman 0.02 μm Anodisc filters (25mm) | Fisher Scientific | 68-09-6002 | |
| Leica DMRXA microscope | Any epifluorescence microscope with a blue filter set may be used | ||
| 20L polycarbonate carboys | Fisher Scientific | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5) | Fisher Scientific | BP329-500, S640-500 | |
| 50% Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G151-1 | |
| Corning 2 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-71 | Any cryovials may be used |
| Corning 5 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-74 | Any cryovials may be used |
| 85% H3PO4 | Fisher Scientific | A242-212 | Spiral Membrane storage |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-3 | M12 cleaning |
| Graduated Cylinders | |||
| Isopore 0.8-μm pore-size membrane filter (142mm) | EMD Millipore | ATTP14250 | |
| Millipore Stainless Steel Pressure Filter Holder (142mm) | Fisher Scientific | YY30 090 00 |
References
- Higgins, J. L., Kudo, I., Nishioka, J., Tsuda, A., Wilhelm, S. W. The response of the virus community to a mesoscale iron fertilization in the sub-Arctic Pacific Ocean. Deep-Sea Res II. 56, 2788-2795 (2009).
- Mioni, C. E., Poorvin, L., Wilhelm, S. W. Virus and siderophore-mediated transfer of available Fe between heterotrophic bacteria: characterization using a Fe-specific bioreporter. Aquat Microb Ecol. 41, 233-245 (2005).
- Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Parada, V., Herndl, G., Weinbauer, M. G. Viral burst size of heterotrophic prokaryotes in aquatic systems. J Mar Biol Assoc U K. 86, 613-621 (2006).
- Poorvin, L., Rinta-Kanto, J. M., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. Viral release of Fe and its bioavailability to marine plankton. Limnol Oceanogr. 49, 1734-1741 Forthcoming.
- Rowe, J. M., Saxton, M. A., Cottrell, M. T., DeBruyn, J. M., Berg, G. M., Kirchman, D. L., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. Constraints on virus production in the Sargasso Sea and North Atlantic. Aquat Microb Ecol. 52, 233-244 (2008).
- Weinbauer, M. G.
- Weinbauer, M. G., Peduzzi, P. Frequency, size and distribution of bacteriophages in different marine morphotypes. Mar Ecol Prog Ser. 108, 11-20 (1994).
- Weinbauer, M. G., Winter, C., Hö, fle, G, M. Reconsidering transmission electron microscopy based estimates of viral infection of bacterioplankton using conversion factors derived from natural communities. Aquat Microb Ecol. 27, 103-110 (2002).
- Wen, K., Ortmann, A. C., Suttle, C. A. Accurate estimation of viral abundance by epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 70, 3862-3867 (2004).
- Wilhelm, S. W., Brigden, S. M., Suttle, C. A. A dilution technique for the direct measurement of viral production: a comparison in stratified and tidally mixed coastal waters. Microb Ecol. 43, 168-173 (2002).
- Wilhelm, S. W., Matteson, A. R. Freshwater and marine virioplankton: a brief overview of commonalities and differences. Freshw Biol. 53, 1076-1089 (2008).
- Wilhelm, S. W., Poorvin, L. Quantification of algal viruses in marine samples. Paul, J. H. , Academic Press. London, UK. 53-66 (2001).
- Wilhelm, S. W., Suttle, C. A. Viruses and nutrient cycles in the sea. Bioscience. 49, 781-788 (1999).
- Wilhelm, S. W., Weinbauer, M. G., Suttle, C. A., Jeffrey, W. H. The role of sunlight in the removal and repair of viruses in the sea. Limnol Oceanogr. 43, 586-592 (1998).
- Winget, D. M., Williamson, K. E., Helton, R. R., Wommack, K. E. Tangential flow diafiltration: an improved technique for estimation of virioplankton production. Aquat Microb Ecol. 41, 221-232 (2005).
