Summary
Il tasso di turnover dei virus in sistemi marini e d'acqua dolce può essere stimato da una riduzione e tecnica ripetersi. I dati permettono ai ricercatori di dedurre i tassi di virus-mediata mortalità microbica nei sistemi acquatici.
Abstract
I virus sono componenti pervasivo dei sistemi marini e d'acqua dolce, e sono noti per essere agenti significativo di mortalità microbica. Sviluppare stime quantitative di questo processo è fondamentale come si può poi sviluppare migliori modelli di struttura delle comunità microbiche e della funzione così come migliorare la nostra comprensione di come i virus lavorano per alterare acquatici cicli biogeochimici. La tecnica di riduzione del virus permette ai ricercatori di stimare la velocità con cui vengono rilasciate particelle virali da parte della comunità microbica endemica. In breve, l'abbondanza di liberi (extracellulare) virus si riduce in un campione, mentre la comunità microbica è mantenuta a vicino concentrazione ambiente. La comunità microbica è poi incubate in assenza di virus libero e la velocità con cui i virus ripresentarsi nel campione (attraverso la lisi dei membri già infetti della comunità) può essere quantificato mediante microscopia in epifluorescenza o, nel caso di virus specifici, quantitativa PCR. Questi tassi possono poi essere utilizzati per stimare il tasso di mortalità microbica a causa di virus-mediata lisi cellulare.
Protocol
1. Ultrafiltrazione di acqua di mare per generare acqua "virus-free" (Wilhelm & Poorvin 2001)
- Circa 20L di acqua di mare / lakewater è raccolto come in modo asettico possibile.
- L'acqua è in serie prefiltrata attraverso 142-mm di diametro filtri di policarbonato 0,8 micron, che possono essere conservati a -20 ° C per l'analisi della comunità. Filtri più grandi dimensioni dei pori possono essere utilizzati prima di questo passaggio per sistemi molto produttivo.
- Per ottenere acqua ultrafiltrato da un sistema M12 Amicon (Millipore) viene utilizzato un cut-off 30 kDa-cartuccia spirale di escludere tutti i virus, anche piccolo virus RNA.
- I campioni vengono processati e concentrati a velocità ~ 25% ~ 15-16 kPa di contropressione.
- Il campione rimanente di circa 500 ml di acqua conterrà una comunità concentrata virus (che può essere salvato per altri esperimenti), mentre il restante 19,5 L di virus acqua verrà utilizzata per le prove di produzione virale.
- Dopo ogni giorno di utilizzo, il Amicon M12 sistema deve essere pulito per evitare di danneggiare la membrana del filtro a cartuccia.
- Se si lavora con acqua di mare, lavare la membrana con almeno 6L di Milli-Q acqua seguita da un lavaggio con soluzione di NaOH 0.1N per 30-45 minuti.
- Anche in questo caso lavare la cartuccia con almeno 6L di acqua Milli-Q.
- Al termine usando il sistema di M12, la cartuccia a spirale deve essere conservato in un 0.05MH 3 PO 4 soluzione a 4 ° C.
2. Virus Metodo di riduzione per la produzione virale (Wilhelm et al. 2002)
- Fino a 500 ml di acqua di mare / lakewater campione sia con ospite e virus si ottiene e posto in una unità sterifilter con un 0,2 micron nominale dei pori di dimensioni a basso legame proteico filtro (ad esempio, Durapore) posto su di esso.
- Il campione viene delicatamente vuoto sotto pressione a <200 mmHg, mentre continuamente risospendere il campione usando una pipetta sterile trasferimento di inibire le cellule batteriche di concentrarsi sul filtro.
- Lentamente tre volumi di ultrafiltrato si aggiungono alla sospensione batterica per ridurre significativamente il numero di virus libero nel campione.
- La frazione batterica viene diluito torna a 500 ml con acqua priva di virus e divisa in tre repliche da 150 ml ciascuno e sono collocati in chiaro 250ml bottiglie in policarbonato.
3. Portata di filtrazione tangenziale (TFF) Metodo di produzione virale (Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005)
TFF rappresenta un approccio alternativo al metodo di riduzione virale.
- Circa 500 ml di campione naturale viene raccolto come sopra descritto.
- Questo esempio è concentrata con un 0,2 micron nominale dei pori di dimensioni tangenziale sistema di filtraggio del flusso.
- Quando la frazione batterica è ridotta a circa 10-15 ml, ultrafiltrato, senza virus viene aggiunta acqua e distribuito come sopra.
- Le bottiglie vengono incubate a replicare in situ utilizzando camere ambientali.
- I livelli di luce sono alterati alle condizioni della superficie utilizzando azzurrata acrilico acrilico o deselezionare con lo screening rete per diminuire l'intensità della luce.
- Temperature di superficie ambiente sono spesso ottenute utilizzando un mazzo di acqua di mare che scorre incubatrice.
- I campioni per la stima dell'abbondanza batteriche e virali vengono prese al tempo 0, con una concentrazione finale di 2,0-2,5% glutaraldeide sterile aggiunto in cryovials. Questi campioni sono immediatamente istantaneamente congelati con l'azoto liquido e conservati congelati fino elaborati.
- Se l'azoto liquido non è disponibile, diapositive microscopia possono essere preparati e trasformati immediatamente (vedere la procedura di seguito)
- Sottocampioni sono raccolti ogni 2,5 ore per almeno 10 ore con il metodo sopra descritto.
- In questo momento l'acqua possono essere raccolti per l'analisi PCR quantitativa. Fino a 5 ml del campione può essere aggiunto a una provetta Microbank ™ con nessun agente fissativo con il congelamento immediato il flash in azoto liquido.
4. Produzione Microscopia virale (Noble & Fuhrman 1998, Wen et al. 2004)
- Campioni congelati da 0.02-micron filtrata per microscopia devono essere scongelati su ghiaccio.
- Preparare una soluzione stock di SYBR Green diluendo la soluzione stock 1:10 con acqua sterile. Successivamente, dalla soluzione madre, preparare una soluzione di lavoro con l'aggiunta di 1 ml di soluzione madre a 39 ml di acqua sterile. Un glicerolo 50%, 50% di soluzioni tampone fosfato salino (PBS, 0,05 M Na 2 HPO 4, 0,85% NaCl, pH 7,5) e fresco soluzione madre al 2,5% del p-fenilendiammina dovrebbe anche essere preparato prima di iniziare. Tenere il glycerol/50% 50% soluzione di PBS a 4 ° C e il p-phenylenediammagazzino ine a -20 ° C al buio fino a quando partire. A destra prima di filtrare aggiungere il p-fenilendiammina alla PBS 50% glycerol/50% ad una concentrazione finale del 0,1% per essere utilizzato come soluzione Antifade.
- Mettere un 25 millimetri 0.02-micron filtro Anodisc sulla cima di un 0.45-micron MicronStep, filtro di supporto cellulosico. Aggiungere 850 ml di campione fissato alla parte superiore del Anodisc e vuoto a 20 pKa fino a completa essiccazione. Mettere 100 ml di soluzione SYBR Green lavorando ad una piastra di Petri sterile e, con il vuoto ancora, rimuovere con attenzione il Anodisc dalla torre di filtro e luogo on the Green SYBR. Incubare i campioni al buio a temperatura ambiente per 20 minuti. Rimuovere con cautela il filtro dalla soluzione SYBR Green e stoppino sul retro del filtro con un Kimwipe per rimuovere tutti i residui di colorante. Se lo si desidera, ritorno il filtro alla torre e passare fino a 800 ml di 0.02-micron acqua filtrata o supporti sterile attraverso il filtro a sciacquare via macchia in eccesso.
- Aggiungere una piccola goccia di soluzione Antifade di un vetrino da microscopio e luogo uno slittamento di copertura sulla parte superiore. Rimuovere la lista di coperchio e aggiungere il filtro essiccato al vetrino da microscopio bagnato con la soluzione Antifade. Ancora una volta, aggiungere una piccola quantità di soluzione Antifade al vetrino e lentamente posto sulla parte superiore del filtro, avendo cura di eliminare eventuali bolle che si possono formare.
- Immediatamente congelare i campioni a -20 ° C fino al momento (che dovranno essere utilizzati entro pochi mesi per prevenire lo scolorimento e abbassato conta virus)
- I virus sono enumerati utilizzando la microscopia a fluorescenza (nel nostro caso un microscopio Leica DMRXA), con un ampio set di filtro blu (λ = Ex 450-490 nm, Em λ = 510 nm con un filtro di soppressione a λ = 510 nm). Ogni filtro avrà almeno 20 campi di vista contati, facendo attenzione a quantificare virus totale da ogni griglia campo per garantire un'equa distribuzione dei virus attraverso la membrana del filtro.
- I tassi medi di ripetersi virus da tre indipendenti replica vengono poi calcolati e una deviazione standard è determinato dai tassi di produzione.
5. Rappresentante Risultati
I dati grezzi raccolti dal ricercatore richiede un numero minimo di elaborazione matematica per generare tassi di ricorrenza di abbondanza virus. Il set di dati primari risultante da questo studio è il tasso di ricorrenza di abbondanza virus nel sottocampioni dal incubazioni. Questi i risultati del modulo regressioni indipendente dal tempo contro virus abbondanza per ognuno dei campioni. Per ogni campione le incubazioni individuo agisce in un unico trattamento, in modo da replicare completando tre-incubazioni il ricercatore in grado di calcolare i tassi così come una stima della variazione (ad esempio, la deviazione standard) (vedi Figura 1).
Un avvertimento di questo processo è che la riduzione invariabile virus abbondanza porta ad una riduzione della cellule ospiti nel campione che portano il peso del virus. Per compensare questa perdita, enumerazione di abbondanza batterica sia dalla sorgente (acqua di mare filtrata o di lago) e la T = 0 campione di incubazione sono necessari. Queste informazioni possono essere utilizzate per tenere conto della percentuale di cellule perse: ipotizzando che il processo di riduzione abbondanza virus non è selettiva a favore o contro qualsiasi membro della comunità microbica, questo fattore può quindi essere utilizzata per stimare il tasso di produzione in loco di virus .
Figura 1. La produzione di campioni particelle virus-simili nel corso di un incubazione di 10 ore in condizioni in situ tramite microscopia in epifluorescenza. Sono stati raccolti nel corso di una fioritura di fitoplancton al largo della costa della Nuova Zelanda, nel settembre del 2008.
Figura 2. Schema del processo di flusso di lavoro per analizzare la produzione di virus. Il processo inizia con l'ultrafiltrazione di acqua campione di generare virus acqua. Questo è completato con un sistema di ultrafiltrazione. Nei campioni di acqua parallelo sono raccolti dal sito stesso e il virus liberi passare attraverso un filtro, mentre la comunità microbica (contenente una miscela di cellule infette e non infette) viene mantenuto. Questa comunità è poi risospeso in acqua privo di virus e incubate in condizioni in situ. Il tasso di ricomparsa del virus viene poi monitorato per le prossime 10 ore per determinare il tasso di produzione di virus.
Discussion
Una componente fondamentale nella comprensione come i virus dell'influenza comunità microbiche marine è quello di determinare la velocità con cui vengono prodotte particelle di virus. Dato che abbondanze sono (più o meno) statici nella maggior parte dei sistemi (Wilhelm & Suttle 1999, Weinbauer 2004), e che i virus sono stati rimossi o resi non infettivi rapidamente in sistemi acquatici (Wilhelm et al. 1998), allora i tassi di produzione deve essere rispetto rapida per sostituire particelle perso.
La stima del virus le cause di mortalità per la comunità microbica richiede una conoscenza di quanti virus vengono prodotti ogni volta che un virus lisa una cella (la "dimensione burst"). Le dimensioni del virus in campioni di scoppio naturale può variare notevolmente. Burst dimensioni possono essere determinate direttamente al microscopio elettronico a trasmissione (ad esempio, Weinbauer e Peduzzi 1994), ma questo è spesso oltre le capacità di un laboratorio dato o non sempre pratico. In situazioni in cui non può essere empiricamente determinato, i valori della letteratura di 24 virus per evento lisi può essere utilizzato per sistemi marini e 34 per i sistemi di acqua dolce (Parada et al. 2006). Se il tasso di produzione di virus è diviso per questo numero, il risultato è l'abbondanza di cellule per volume distrutto da virus su base giornaliera. I microbi lisato valore può essere diviso per il magazzino in piedi di abbondanza batterica conseguente mortalità del virus indotto per il sistema in questione: già esistenti le stime variano da pochi punti percentuali a quasi tutta la popolazione e sono spesso dipende da altri fattori del sistema in questione (Wilhelm & Matteson 2008). Per determinare la percentuale di mortalità totale è spesso questo numero moltiplicato per due (lavorativi dal presupposto che il 50% delle cellule andare a riprodursi e il 50% delle cellule si perdono, Weinbauer 2004).
Dato che la biodisponibilità dei nutrienti ed elementi traccia (per esempio, N, P, Fe) può limitare il tasso di produttività primaria, e come tale flusso del carbonio, attraverso sistemi acquatici, e la comprensione del ruolo del virus-driven mortalità microbica in questo processo è diventato di interesse per geochimici marino. Alcune stime indicano che ora esistono virus rilasciare un concentrazioni significative di elementi nutritivi di nuovo alla colonna d'acqua su base giornaliera (Rowe et al. 2008, Higgins et al. 2009) e che questi elementi sono rapidamente assimilate dalla comunità microbica (Poorvin et al. 2004, Mioni et al. 2005). Il tasso di flusso di nutrienti per l'ambiente può essere determinato moltiplicando il numero di cellule distrutte dalla quantità di nutrienti per cella (indicato "quote"). Queste informazioni possono fornire una componente fondamentale per la nostra comprensione di come le catene alimentari microbiche funzione tutti i sistemi acquatici.
Sviluppi in corso: gli sforzi attuali per una serie di gruppi di ricerca riguardano l'adeguamento della strategia di cui sopra per enumerare virus specifici all'interno della comunità e, come tale, per determinare come gli organismi specifici sono influenzate dalla attività dei virus. Per fare questo i ricercatori utilizzano il quantitativo di reazione a catena della polimerasi (qPCR) per stimare l'abbondanza di particolari gruppi di virus o famiglie in parallelo alle stime della comunità virus totale. I risultati sono quindi applicati direttamente per fornire stime di mortalità del virus, ricambio nutritivo, ecc per specifici gruppi di plancton. Questo approccio nuovo e potente permetterà ai ricercatori nei prossimi anni a scavare molto più a fondo i processi associati con l'ecologia del virus e, per la prima volta, di quantificare le interazioni di specifici virus ospitano comunità oltre i vincoli dei sistemi di laboratorio.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
La pubblicazione di questo articolo è stato sostenuto da una borsa di studio presso l'Ufficio di Ricerca presso l'Università del Tennessee. Gli autori ringraziano la precedente generazione di studenti e ricercatori che hanno lavorato per affinare queste procedure. Ricerca è stata sostenuta dalle concessioni dal National Science Foundation (NSF-0851113, NSF-0825405 e NSF-0550485).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% p-phenylenediamine | Acros Organics | 130575000 | Stock for Antifade |
| Amicon Proflux M12 system | EMD Millipore | N/A | Any ultrafiltration device may be used for this step |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Invitrogen | S-7563 | |
| Helicon S10 30kDa Filter | EMD Millipore | CDUF010LT | |
| Pelicon XL filters 0.22 μm | Fisher Scientific | PXGVPPC50 | |
| GE 0.2 μm PCTE membrane filters (47mm) | Fisher Scientific | 09-732-35 | |
| Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System | EMD Millipore | XX42LSS11 | Other TFF systems may be used for this step |
| 0.45 μm Micronstep, Cellulosic, white plain filters (25mm) | Fisher Scientific | E04WP02500 | |
| GE Whatman 0.02 μm Anodisc filters (25mm) | Fisher Scientific | 68-09-6002 | |
| Leica DMRXA microscope | Any epifluorescence microscope with a blue filter set may be used | ||
| 20L polycarbonate carboys | Fisher Scientific | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5) | Fisher Scientific | BP329-500, S640-500 | |
| 50% Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G151-1 | |
| Corning 2 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-71 | Any cryovials may be used |
| Corning 5 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-74 | Any cryovials may be used |
| 85% H3PO4 | Fisher Scientific | A242-212 | Spiral Membrane storage |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-3 | M12 cleaning |
| Graduated Cylinders | |||
| Isopore 0.8-μm pore-size membrane filter (142mm) | EMD Millipore | ATTP14250 | |
| Millipore Stainless Steel Pressure Filter Holder (142mm) | Fisher Scientific | YY30 090 00 |
References
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