Summary
해양 및 담수 시스템에 바이러스의 매출 비율은 감소하고 reoccurrence 기술로 예상하실 수 있습니다. 데이터는 연구자들이 해양 시스템에서 바이러스 중재의 미생물 사망률의 속도를 추측할 수 있습니다.
Abstract
바이러스는 해양 및 담수 시스템의 전반 구성 요소이며, 미생물의 사망률의 중요한 대리인으로 알려져 있습니다. 우리가 그 미생물 지역 사회의 구조와 기능의 더 나은 모델을 개발뿐만 아니라 바이러스가 수상 biogeochemical주기를 변경하는 작업 방법을 우리의 이해를 사전에 수이 과정의 양적 추정을 개발하는 것은 중요합니다. 바이러스 감소 기술은 연구자 바이러스 입자가 발병 미생물 커뮤니티에서 공개되는 속도를 추정 할 수 있습니다. 미생물 커뮤니티 가까운 주위 농도 유지하는 동안 간단히, 무료 (세포) 바이러스의 풍부한는 샘플로 줄어 듭니다. 미생물 커뮤니티는 다음 무료로 바이러스의 부재와 바이러스 정량 (지역 사회의 이미 감염된 회원의 용해를 통해) 샘플에 reoccur epifluorescence 현미경에 의해 계량 수 또는 특정 바이러스의 경우, 어떤 속도에서 incubated입니다 PCR. 이 요금은 다음 바이러스 매개 세포 용해에 의한 미생물의 사망률의 속도를 추정하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
1. "바이러스 무료"물 (빌헬름 & Poorvin 2001)를 생성하기 위해 해수의 Ultrafiltration
- 해수 / lakewater 약 20L가 가능한 무균 수집됩니다.
- 워터는 순차적으로 142 - mm 직경의 폴리 카보 네이트를 통해 지역 사회의 분석을 위해 -20 ° C에서 보관 수있는 0.8 μm의 필터를 prefiltered입니다. 큰 기공 크기 필터는 매우 생산적인 시스템에 대해이 단계 이전에 사용할 수 있습니다.
- 30 KDA - 커토프 나선형 카트리지가 모두 바이러스를 제외하는 데 사용됩니다 Amicon M12 시스템 (Millipore), 심지어는 작은 RNA 바이러스의 ultrafiltered 물을 얻을 수 있습니다.
- 샘플은 backpressure의 ~ 15-16 kPa로 처리 ~ 25 %의 속도로 집중되고있다.
- 물 ~ 500 ML의 나머지 샘플은 바이러스 무료 물의 나머지 19.5 L가 바이러스성 생산 assays에 사용됩니다 동안 집중 바이러스 커뮤니티 (어떤 다른 실험을 위해 저장될 수도 있습니다)가 포함됩니다.
- 이용의 각 하루를 보낸 후, Amicon M12 시스템은 필터 카트리지의 멤브레인 손상을 방지하기 위해 청소해야합니다.
- 이 해수와 함께 작업하는 경우 30~45분에 대한 0.1N NaOH 용액과 함께 세탁 다음 밀리 Q 물 최소한 6L와 멤브레인을 씻어.
- 다시 밀리 Q 물 최소한 6L와 카트리지를 씻어.
- M12 시스템을 이용하여 작업이 완료되면 나선형 카트리지 4 0.05MH 3 PO 4 용액 ° C.에 보관해야
2. 바이러스성 생산을위한 바이러스 감소 방법 (빌헬름 외. 2002)
- 최대 두 호스트 및 바이러스가 0.2 - μm의 공칭 기공 크기 낮은 단백질 바인딩 그것에 배치 필터 (예 : Durapore.) 함께 취득하고 sterifilter 단위에 배치됩니다와 해수 / lakewater 샘플 500 ML에
- 지속 필터에 집중에서 박테리아 세포를 억제하는 살균 전송 피펫을 사용하여 샘플 resuspending하면서 예제는 부드럽게 <200 mmHg로 압력을 진공이다.
- 천천히 ultrafiltrate 세 볼륨 크게 샘플 무료 바이러스의 수를 줄이기 위해 세균 현탁액에 추가됩니다.
- 세균성 분수는 바이러스가없는 물 500 ML로 희석 세 나누어 150 ML 각 복제 맑은 250ml 폴리 카보 네이트 병에 배치됩니다있다.
3. 바이러스성 생산을위한 접선 흐름 여과 (TFF) 방법 (Weinbauer 외. 2002 윙젯 외. 2005)
TFF는 바이러스 감소 방법에 대한 대안적인 접근 방식을 나타냅니다.
- 위에서 설명한대로 자연 시료의 약 500 ML이 수집됩니다.
- 이 예제는 0.2 - μm의 공칭 기공 크기의 접선 흐름 여과 시스템을 사용 집중되어 있습니다.
- 세균성 분율이 약 10-15 ML로 감소되면, ultrafiltered, 바이러스 무료 물을 추가하고 위와 같이 배포됩니다.
- 복제 병은 환경 챔버를 사용하여 현장 조건에 incubated 수 있습니다.
- 라이트 수준은 빛의 강도를 감소 NET 심사와 푸른 적용된 아크릴 또는 취소 아크릴을 사용하여 표면 조건 변경됩니다.
- 주위 표면 온도는 종종 흐르는 해수 데크 배양기를 사용하여 얻을 수 있습니다.
- 박테리아와 바이러스성 풍부한 견적에 대한 샘플은 cryovials에 추가 2.0-2.5 % 살균 글루 타 알데히드의 최종 농도와 시간을 0에서 찍은 있습니다. 이 샘플은 즉시 액체 질소로 냉동 플래시하고 처리하기 전까지 냉동 저장됩니다.
- 액체 질소를 사용할 수없는 경우, 현미경 슬라이드는 (아래 절차를 참조) 준비하고 즉시 처리할 수 있습니다
- Subsamples은 위에서 설명한 방법으로 적어도 10 시간 동안 매 2.5 시간을 수집하고 있습니다.
- 이 시간에 물을 정량 PCR 분석을 위해 수집될 수 있습니다. 최대 샘플 5 ML하기는 액화 질소에 즉시 플래시 냉동로없이 정착액 에이전트 cryovial에 추가할 수 있습니다.
4. 바이러스성 생산 현미경 (노블 & 퍼먼 1998, 웬 외. 2004)
- 0.02 - μm의 현미경에 대한 필터링하는 냉동 샘플은 얼음에서 해동해야합니다.
- 멸균 물 주식 솔루션 1시 10분을 diluting하여 SYBR 녹색의 주식 솔루션을 준비합니다. 다음 주식 솔루션에서 멸균 물 39 ML에 대한 재고 솔루션의 1mL를 추가하여 작업 솔루션을 준비합니다. 50 % 글리세롤, 50 % 인산이 호수 솔루션을 버퍼 (PBS, 0.05 M 나 2 HPO 4, 0.85 % NaCl, 산도 7.5) 및 P - phenylenediamine의 신선한 2.5 % 주식 솔루션은 또한 시작하기 전에 준비를해야합니다. 4 50 % glycerol/50 % PBS 솔루션을 유지 ° C 및 P - phenylenediam-20에서 오프라인 재고 ° 시작 때까지 어둠 속에 C. 오른쪽 필터링하기 전에 Antifade 솔루션으로 사용되는 0.1 %의 최종 농도 50 % glycerol/50 % PBS로 P - phenylenediamine를 추가합니다.
- 0.45 - μm의 MicronStep, cellulosic 후원 필터의 상단에 0.02 - μm의 Anodisc 필터 25mm를 놓습니다. 완전히 건조까지 20 pKa에 Anodisc과 진공의 상단에 고정 샘플 850 μL를 추가합니다. 플레이스 100 멸균 페트리 접시에 SYBR 그린 작업 솔루션의 μL, 그리고 여전히 진공으로 조심스럽게 SYBR 그린 필터 탑과 장소에서 Anodisc를 제거합니다. 20 분 상온에서 어둠의 샘플을 품어. 조심스럽게 SYBR 그린 솔루션에서 필터를 제거하고 모든 잔류 염료를 제거하는 Kimwipe와 필터의 뒷면 윅. 원하는 경우, 타워에 필터를 반환하고 여분의 얼룩을 씻어하는 필터를 통해 0.02 - μm의 여과 물 또는 멸균 미디어 800 μL까지 전달합니다.
- 현미경 슬라이드에 antifade 솔루션의 작은 방울을 추가하고 위에 덮개 용지를 넣으십시오. 커버 슬립을 제거하고 antifade 솔루션와 젖은 현미경 슬라이드에 말린 필터를 추가합니다. 다시 커버 슬립에 antifade 솔루션의 작은 금액을 추가하고 천천히 그 양식을 수있는 모든 거품을 제거해야하고, 필터의 상단에 배치하십시오.
- 필요가 (이가 변색 방지하기 위해 몇 개월 이내에 사용되며, 바이러스 카운트를 낮춘한다)까지 즉시 -20 ° C에서 슬라이드를 동결
- 바이러스는 다양한 파란색 필터 세트 (λ 예 = 450-490 nm의, λ λ 엠에서 억제 필터 = 510 NM = 510 nm의)와 (과 우리의 경우 Leica DMRXA 현미경) 형광 현미경을 사용하여 열거됩니다. 각 필터는 필터 멤브레인 전체 바이러스의 균등을 보장하기 위해 각 분야의 그리드에서 전체 바이러스를 계량해야하고, 계산보기 최소한 20 필드를합니다.
- 세 독립에서 바이러스 reoccurrence의 평균 가격은 다음 계산하고 표준 편차가 생산 가격에서 결정됩니다 복제합니다.
5. 대표 결과
연구자에 의해 수집된 원시 데이터는 바이러스 풍요의 reoccurrence 속도를 생성하기 위해 최소한의 수학적 처리를 필요로합니다. 본 연구의 결과 기본 데이터 집합은 incubations에서 subsamples에서 바이러스 풍요의 reoccurrence 요금입니다. 이러한 결과는 샘플의 각 바이러스 어번던스 대 시간의 독립 regressions를 형성하고 있습니다. 각 샘플에 대해 개별 incubations이 연구원은 가격뿐만 아니라 변화의 추정 (예 : 표준 편차) (그림 1 참조). 계산할 수있는 세 가지 복제 - incubations을 작성하여 이렇게 하나의 치료 역할
이 과정 중 하나 주의해야 할 점은 바이러스 어번던스 불변의 감소는 바이러스 부담을지고있는 예제에서 호스트 세포의 감소로 연결한다는 것입니다. 소스 (필터없는 해수 또는 호수)와 T = 0 배양 샘플 모두에서 손실, 세균성 풍요의 열거를 상쇄하기 위해서 필요합니다. 이 정보가 손실 세포의 비율을 위해 계정을 사용할 수 있습니다 바이러스 풍부한를 줄이는 과정이 또는 미생물 지역 사회의 모든 구성원에 대한 선택이 아니라고 가정하면,이 요소는 다음 바이러스의 현장 생산 가격 추정하는 데 사용할 수 있습니다 .
그림 1. epifluorescence 현미경을 사용하여 현장 조건에서 10 시간 보육을 통해 입자와 같은 바이러스. 샘플의 생산은 2008 년 9 월 뉴질랜드의 해안에서 피는 식물성 플랑크톤을 통해 수집된되었습니다.
그림 2. 바이러스 생산을 시금위한 워크플로우 프로세스의 개략도 그림.이 과정은 바이러스 무료 물을 생성하는 샘플 물 ultrafiltration 시작합니다. 이 ultrafiltration 시스템을 사용하여 완료됩니다. 미생물 커뮤니티 (감염되지 않은 감염된 세포의 혼합물을 포함) 유지하는 동안 병렬 물 샘플에서는 필터를 통해 전달되는 동일한 사이트 및 무료 바이러스로부터 수집하고 있습니다. 이 커뮤니티는 다음 바이러스 무료로 물에 resuspended 및 현장 조건에 따라 incubated입니다. 바이러스의 reoccurrence 요금은 다음 바이러스 생산 속도를 결정하기 위해 앞으로 10 시간 동안 감시하고 있습니다.
Discussion
바이러스가 해양 미생물 커뮤니티에 영향을 어떻게 이해 핵심 구성 요소는 바이러스 입자가 생성되는 속도를 결정하는 것입니다. abundances이 (빌헬름 & 셔틀 1999 Weinbauer 2004) 대부분의 시스템에서 정적 (자세한 이하)이며, 그 바이러스가 수중 시스템에 신속하게 제거 또는 비 전염성이 렌더링되는 것을 감안할 때 (빌헬름 외. 1998), 다음의 생산 가격이어야합니다 상대 빠른 손실 입자를 교체합니다.
사망률 바이러스는 미생물 커뮤니티 원인이 예측하는 것은 바이러스가 세포를 (이하 "버스트 크기") lyses 때마다 생산 얼마나 많은 바이러스의 지식이 필요합니다. 자연 샘플에서 바이러스 버스트 크기는 크게 다를 수 있습니다. 버스트 크기는 전송 전자 현미경 (예 : Weinbauer & Peduzzi 1994)에 의해 직접적으로 결정하지만, 이것은 항상 실용적이 아닌 주어진 실험실의 기능 넘어 자주하거나 수 있습니다. 그들이 경험적으로 결정되지 않을 수있는 상황에서, lytic 이벤트 당 24 바이러스의 문학 값은 담수 시스템 해양 시스템 34에 사용할 수 있습니다 (파라다 외. 2006). 바이러스 생산의 비율이 나눈 경우, 결과는 매일 바이러스에 의해 파괴 볼륨 당 세포의 풍부이다. 가치를 lysed 미생물 그런 다음 해당 시스템에 대한 바이러스 유도 사망률의 결과 세균성 풍요의 서 주식으로 나눌 수있다 : 기존 추정 범위 몇 %에서 거의 전체 인구와 자주 문제가 시스템의 다른 요소에 의존 (빌헬름 & 메이트슨 2008). 총 사망률의 비율을 확인하려면이 번호는 종종 두 (세포의 50 %가 복제에 가서 세포의 50 %, Weinbauer 2004 년 손실 가정에서 작업) 곱한 것입니다.
되어 양분과 추적 요소 생체 이용율 (예, N, P, 철) 주요 생산성의 속도를 제한하고, 이러한 탄소 유량으로 수중 시스템을 통해,이 과정에서 바이러스 기반의 미생물 사망률의 역할의 이해 수 감안할 때 해양 geochemists에 관심. 몇몇 견적은 지금 (2009. 2008, 히긴스 외. 로우 외) 바이러스가 매일 물 열로 영양 요소의 상당 농도를 공개 제안 존재하고 이러한 요소들이 빠르게 미생물 지역 사회에 의해 동화되는 (Poorvin 동부 표준시 알. 2004 Mioni 외. 2005). 환경에 영양 흐름의 속도는 영양 당 셀 (표시된 "할당량")의 금액에 의해 파괴 세포의 개수를 곱하여 결정하실 수 있습니다. 이 정보는 미생물의 식품 거미줄이 해양 시스템에서 작동하는 방법에 대한 우리의 이해에 중요한 구성 요소를 제공할 수 있습니다.
지속적인 발전 : 연구 그룹의 일련의 현재 노력은 특정 생물이 바이러스 활동에 의해 영향을 방법을 결정하기 위해, 같은, 지역 사회 내의 특정 바이러스를 열거할 수 위의 전략을 채택하고 포함됩니다. 위해이 연구팀은 전체 바이러스 공동체의 추정에 병렬로 특정 바이러스의 그룹이나 가족의 풍부한을 예측할 수있는 정량 중합 효소의 연쇄 반응 (qPCR)를 사용합니다. 결과는 다음 직접 특정 플랑크톤 그룹에 대한 바이러스 사망률, 영양 매출 등 견적을 제공하기 위해 적용됩니다. 이 강력한 새로운 접근 방식은 향후 몇 년 동안 연구자가 바이러스의 생태와 관련된 프로세스에 더 깊게 조사하고, 처음으로, 실험실 시스템의 제약없는 특정 바이러스 호스트 커뮤니티의 상호 작용을 수치하실 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 문서의 출판은 테네시 대학에서 연구의 사무실에서 교부금에 의해 지원되었다. 저자는 이러한 절차를 수정하기 위해 노력하는 학생과 연구자의 이전 세대 주셔서 감사합니다. 연구는 국립 과학 재단 (NSF - 0851113, NSF - 0825405 및 NSF - 0550485)의 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% p-phenylenediamine | Acros Organics | 130575000 | Stock for Antifade |
| Amicon Proflux M12 system | EMD Millipore | N/A | Any ultrafiltration device may be used for this step |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Invitrogen | S-7563 | |
| Helicon S10 30kDa Filter | EMD Millipore | CDUF010LT | |
| Pelicon XL filters 0.22 μm | Fisher Scientific | PXGVPPC50 | |
| GE 0.2 μm PCTE membrane filters (47mm) | Fisher Scientific | 09-732-35 | |
| Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System | EMD Millipore | XX42LSS11 | Other TFF systems may be used for this step |
| 0.45 μm Micronstep, Cellulosic, white plain filters (25mm) | Fisher Scientific | E04WP02500 | |
| GE Whatman 0.02 μm Anodisc filters (25mm) | Fisher Scientific | 68-09-6002 | |
| Leica DMRXA microscope | Any epifluorescence microscope with a blue filter set may be used | ||
| 20L polycarbonate carboys | Fisher Scientific | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5) | Fisher Scientific | BP329-500, S640-500 | |
| 50% Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G151-1 | |
| Corning 2 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-71 | Any cryovials may be used |
| Corning 5 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-74 | Any cryovials may be used |
| 85% H3PO4 | Fisher Scientific | A242-212 | Spiral Membrane storage |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-3 | M12 cleaning |
| Graduated Cylinders | |||
| Isopore 0.8-μm pore-size membrane filter (142mm) | EMD Millipore | ATTP14250 | |
| Millipore Stainless Steel Pressure Filter Holder (142mm) | Fisher Scientific | YY30 090 00 |
References
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