Summary
Die Fluktuationsrate von Viren in Meer-und Süßwasser-Systeme können durch eine Reduktion und Wiederholung Technik geschätzt werden. Die Daten können die Forscher Raten von Virus-vermittelte mikrobielle Sterblichkeit in aquatischen Systemen zu schließen.
Abstract
Viren sind allgegenwärtig Komponenten von Meeres-und Süßwasser-Systemen und sind dafür bekannt, entscheidende Akteure für mikrobielle Sterblichkeit. Entwicklung von quantitativen Schätzungen dieses Prozesses ist entscheidend, wie wir dann entwickeln kann bessere Modelle von mikrobiellen Gemeinschaft Struktur und Funktion sowie unser Verständnis davon, wie Viren Arbeit für Wasserorganismen biogeochemischen Kreisläufe verändern. Das Virus Reduzierung Technik ermöglicht es den Forschern, die Geschwindigkeit, mit der Viruspartikel aus der endemischen mikrobiellen Gemeinschaft freigegeben werden, zu schätzen. Kurz gesagt, ist die Fülle von freien (extrazellulären) Viren in einer Probe reduziert, während der mikrobiellen Gemeinschaft in der Nähe von Umgebungs-Konzentration aufrechterhalten wird. Die mikrobielle Gemeinschaft wird dann in der Abwesenheit von freien Viren und die Geschwindigkeit, mit der Viren wiederholen in der Probe (durch die Lyse von bereits infizierten Mitgliedern der Gemeinschaft) kann durch Epifluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden oder, im Falle von bestimmten Viren, quantitative inkubiert PCR. Diese Preise können dann verwendet werden, um die Rate der mikrobiellen Sterblichkeit aufgrund von Virus-vermittelten Zell-Lyse zu schätzen.
Protocol
1. Ultrafiltration von Meerwasser zu "Virus-free" Water (Wilhelm & Poorvin 2001) generieren
- Etwa 20L Meerwasser / Seewasser ist aseptisch wie möglich gesammelt werden.
- Wasser ist seriell über 142-mm Polycarbonat 0,8 um Filter, die bei -20 ° C für Community-Analyse aufbewahrt werden kann vorgefiltert. Größere Porengröße Filter können vor diesem Schritt für sehr produktiv eingesetzt werden.
- Um ultrafiltriertes Wasser aus einem Amicon M12-System (Millipore) ein 30 kDa-Cutoff-Spirale Patrone verwendet, um alle Viren auszuschließen ist, auch kleine RNA-Viren.
- Die Proben werden aufbereitet und konzentriert bei ~ 25% Geschwindigkeit, mit ~ 15-16 kPa der Gegendruck.
- Die restlichen Stichprobe von ca. 500 ml Wasser wird eine konzentrierte Virus Gemeinde (die auch für andere Experimente gespeichert werden), während die restlichen 19,5 l von Virus-freies Wasser wird für die virale Produktion Assays verwendet werden enthalten.
- Nach jedem Tag verwenden, muss der Amicon M12-System gereinigt werden, um Schäden an der Membran der Filterkartusche zu verhindern.
- Wenn Sie mit Meerwasser arbeiten, spülen Sie die Membran mit mindestens 6L von Milli-Q Wasser, gefolgt von einem Waschen mit 0,1 N NaOH-Lösung für 30-45 Minuten.
- Wieder spülen Sie die Kartusche mit mindestens 6L von Milli-Q Wasser.
- Wenn Sie fertig sind mit dem M12-System, sollte die Spirale Patrone in einem 0.05MH 3 PO 4-Lösung bei 4 ° C gelagert werden
2. Virus Reduction Method für Viral Production (Wilhelm et al. 2002)
- Bis zu 500 mL des Meerwassers / Seewasser Probe mit Host-und Viren gewonnen und in einem sterifilter Gerät mit einem 0,2-um nominal Porengröße niedrigen Protein-bindenden Filter (zB Durapore) auf ihn gesetzt.
- Die Probe wird vorsichtig auf <200 mmHg Druck Vakuum während kontinuierlich Resuspendieren der Probe mit einer sterilen Transferpipette um bakterielle Zellen, die aus der Konzentration auf den Filter zu hemmen.
- Langsam drei Bände Ultrafiltrat sind die Bakteriensuspension hinzugefügt, um deutlich zu reduzieren die Anzahl der freien Viren in der Probe.
- Die bakterielle Fraktion wird auf 500 ml mit Virus-freies Wasser verdünnt und gliedert sich in drei Wiederholungen von je 150 ml und sind in klar 250ml Polycarbonat-Flaschen gelegt.
3. Tangential Flow Filtration (TFF)-Methode für Viral Production (Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005)
TFF stellt einen alternativen Ansatz zur viralen Abbau-Methode.
- Etwa 500 ml natürlichen Probe gesammelt, wie oben beschrieben.
- Diese Probe wird konzentriert mit einem 0,2-um nominal Porengröße Tangentialflussfiltration System.
- Wenn die bakterielle Fraktion auf ca. 10-15 ml reduziert ist, wird ultrafiltriert, Virus-freies Wasser aufgenommen und verteilt wie oben.
- Die Parallelproben Flaschen sind bei in-situ-Bedingungen mit Klimakammern inkubiert.
- Lichtverhältnisse sind Oberflächenbeschaffenheit mit blau getöntem Acryl-oder Plexiglas mit Screening-net, um die Lichtintensität zu verringern verändert.
- Ambient Oberflächentemperaturen sind oft durch eine fließende Meerwasser Deck Inkubator erhalten.
- Beispiele für bakterielle und virale Schätzungen sind zur Zeit 0 mit einer Endkonzentration von 2,0-2,5% sterile Glutaraldehyd in Kryoröhrchen hinzu genommen. Diese Proben werden sofort mit flüssigem Stickstoff eingefroren Blitz und tiefgefroren gelagert bis zur Verarbeitung.
- Wenn flüssigem Stickstoff ist nicht verfügbar, kann Objektträger vorbereitet und sofort verarbeitet (siehe weiter unten)
- Teilproben sind alle 2,5 Stunden für mindestens 10 Stunden gesammelt durch die oben beschriebene Methode.
- In dieser Zeit kann Wasser für die quantitative PCR-Analyse gesammelt werden. Bis zu 5 ml der Probe kann zu einem Kryoröhrchen ohne Fixiermittel mit sofortiger Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff hinzugefügt werden.
4. Viral Produktion Microscopy (Noble & Fuhrman 1998, Wen et al. 2004)
- Eingefrorene Proben zu 0,02-um für die Mikroskopie gefiltert werden sollten, auf Eis aufgetaut werden.
- Bereiten Sie eine Stammlösung von SYBR Green durch Verdünnen der Stammlösung 1:10 mit sterilem Wasser. Als nächstes wird aus der Stammlösung, bereiten eine funktionierende Lösung durch Zugabe von 1 ml der Stammlösung auf 39 ml sterilem Wasser. Eine 50% Glycerin, gepufferte 50% Phosphat Salzlösungen (PBS, 0,05 M Na 2 HPO 4, 0,85% NaCl, pH 7,5) und frische 2,5% Stammlösung von p-Phenylendiamin sollte auch vor Beginn vorbereitet werden. Halten Sie die 50% glycerol/50% PBS-Lösung bei 4 ° C und die p-phenylenediamine Lager bei -20 ° C im Dunkeln bis zum Start. Rechts vor dem Filtern hinzufügen p-Phenylendiamin, die 50% glycerol/50% PBS auf eine Endkonzentration von 0,1% als Antifade Lösung eingesetzt werden.
- Legen Sie eine 25 mm 0,02-um Anodisc Filter auf einem 0,45-um MicronStep, Zellulose Zusatzfilter. Add 850 ul der festen Probe auf der Oberseite des Anodisc und Vakuum bei 20 pKa, bis sie vollständig getrocknet. Legen Sie 100 ul SYBR Green funktionierende Lösung zu einer sterilen Petrischale und mit dem Vakuum noch auf, entfernen Sie vorsichtig die Anodisc aus dem Filter Turm und auf dem SYBR Green. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Filter von der SYBR Green-Lösung und Docht der Rückseite des Filters mit einem Kimwipe um alle restlichen Farbstoff zu entfernen. Falls gewünscht, geben Sie den Filter auf den Turm und passieren bis zu 800 ul von 0,02-um gefiltertes Wasser oder sterile Medien durch den Filter zu spülen überschüssige Fleck.
- Fügen Sie einen kleinen Tropfen Antifade Lösung auf einen Objektträger und legen Sie ein Deckglas auf. Entfernen Sie das Deckglas und fügen Sie die getrockneten Filter auf den Objektträger mit dem nassen Antifade Lösung. Auch eine kleine Menge von Antifade Lösung für das Deckglas und langsam setzen Sie ihn auf dem Filter, so dass Sie keine loszuwerden Blasen bilden können.
- Unmittelbar Einfrieren der Objektträger bei -20 ° C bis zum Gebrauch (diese innerhalb von wenigen Monaten verwendet werden sollten, um zu verhindern Ausbleichen und senkte Virus zählt)
- Viren sind aufgezählt mittels Fluoreszenz-Mikroskopie (in unserem Fall eine Leica DMRXA Mikroskop) mit einem breiten blauen Filter-Set (λ Ex = 450 bis 490 nm, λ Em = 510 nm mit einem Entstörfilter bei λ = 510 nm). Jeder Filter wird mindestens 20 Gesichtsfelder gezählt, so dass Sie insgesamt Viren aus jedem Feld Grid zu quantifizieren, um eine gleichmäßige Verteilung der Viren über die Filtermembran zu gewährleisten.
- Gemittelte Raten von Virus Wiederauftreten von den drei unabhängigen repliziert werden dann berechnet und eine Standardabweichung von der Produktionsrate bestimmt.
5. Repräsentative Ergebnisse
Die Rohdaten des Forschers gesammelt erfordert nur minimale mathematische Verarbeitung, um eine Rückkehr Raten von Virus Fülle zu erzeugen. Der primäre Datensatz aus dieser Studie ist die Wiederholung Raten von Virus Fülle in der Teilproben aus den Inkubationen. Diese Ergebnisse bilden unabhängige Regressionen von Virus Fülle vs Zeit für jede der Proben. Für jede Probe die einzelnen Inkubationen als eine Behandlung zu handeln, so durch Ausfüllen drei Wiederholungskäfige-Inkubationen der Forscher können Preise sowie eine Schätzung der Variation (z. B. Standardabweichung) (siehe Abbildung 1). Berechnen
Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die Reduktion der Virus-Hülle und Fülle unveränderlich zu einer Reduktion in den Wirtszellen in der Probe, die das Virus tragen Last werden, führt. Zum Ausgleich dieses Verlustes Aufzählung der bakteriellen Hülle und Fülle sowohl von der Quelle (ungefilterte Meerwasser oder Seewasser) und T = 0 Inkubation Probe notwendig sind. Diese Informationen können zur Berücksichtigung der Anteil der Zellen verloren verwendet werden: Unter der Annahme, dass der Prozess der Verringerung Virus Fülle nicht selektiv für oder gegen alle Mitglieder der mikrobiellen Gemeinschaft, dieser Faktor kann dann verwendet werden, um die in-situ-Erzeugung von Viren zu schätzen .
Abbildung 1. Die Produktion von Virus-ähnlichen Partikeln über einen 10 Stunden Inkubation bei in-situ-Bedingungen mit Epifluoreszenzmikroskopie. Die Proben wurden während einer Phytoplankton gesammelt blühen vor der Küste von Neuseeland im September 2008.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Workflow-Prozess zur Bestimmung Virus-Produktion. Der Prozess beginnt mit der Ultrafiltration von Wasser auf Probe Virus-freies Wasser zu erzeugen. Dies ist fertig mit einer Ultrafiltrationsanlage. In parallel Wasserproben aus dem gleichen Ort und die freie Viren durch einen Filter geleitet gesammelt, während der mikrobiellen Gemeinschaft (mit einer Mischung von infizierten und nicht infizierten Zellen) wird beibehalten. Diese Gemeinschaft wird dann in das Virus freies Wasser resuspendiert und unter in situ Bedingungen. Die Wiederholung von Viren wird dann für die nächsten 10 Stunden überwacht werden, um Raten von Virus-Produktion zu bestimmen.
Discussion
Eine kritische Komponente in das Verständnis, wie Viren marinen mikrobiellen Gemeinschaften Einfluss auf die Rate, mit der Viruspartikel produziert bestimmen. Da die Häufigkeiten sind (mehr oder weniger) statischen in den meisten Systemen (Wilhelm & Suttle 1999, Weinbauer 2004), und die Viren werden entfernt oder erbrachten nicht-infektiösen schnell in aquatischen Systemen (Wilhelm et al. 1998), dann Produktionsraten werden muss relativen schnellen zu ersetzen verloren Partikel.
Die Schätzung der Sterblichkeit Viren verursachen, um die mikrobielle Gemeinschaft erfordert ein Wissen darüber, wie viele Viren sind jedes Mal ein Virus Lyse einer Zelle ("burst size") produziert. Virus Burst Größen in natürlichen Proben kann stark variieren. Burst Größen können direkt durch Transmissionselektronenmikroskopie (zB Weinbauer & Peduzzi 1994) ermittelt werden, aber das ist oft über die Fähigkeiten eines bestimmten Labor oder nicht immer praktisch. In Situationen, in denen sie nicht empirisch ermittelt werden können, kann der Literatur Werte von 24 Viren pro lytische Veranstaltung für marine Systeme und 34 für Süßwasser-Systemen verwendet werden (Parada et al. 2006). Wenn die Rate der Virus-Produktion durch diese Zahl geteilt wird, ist das Ergebnis der Fülle der Zellen pro Volumen, die durch Viren auf einer täglichen Basis zerstört. Die Mikroben lysiert Wert kann dann durch die ständigen Bestand von bakteriellen Überfluss führt das Virus induzierte Mortalität für das System in Frage unterteilt werden: die bestehenden Schätzungen reichen von wenigen Prozent auf fast der gesamten Bevölkerung und sind oft abhängig von anderen Faktoren in das System in Frage (Wilhelm & Matteson 2008). Um zu bestimmen, der Anteil der Gesamtmortalität diese Zahl wird oft von zwei (Arbeitstitel von der Annahme aus, dass 50% der Zellen weiter zu vervielfältigen und zu 50% der Zellen gehen verloren, Weinbauer 2004) multipliziert.
Da die Nährstoff-und Spurenelement Bioverfügbarkeit (zB N, P, Fe) kann die Rate der primären Produktivität zu begrenzen, und als solche Kohlenstoffflusses durch aquatischen Systemen, und das Verständnis der Rolle von Viren-driven mikrobielle Sterblichkeit in diesem Prozess hat sich von Interesse für marine Geochemiker. Mehrere Schätzungen gibt es heute darauf hindeuten, Viren Freisetzung eine signifikante Konzentrationen von Nährstoffen zurück in die Wassersäule auf einer täglichen Basis (Rowe et al. 2008, Higgins et al. 2009) und dass diese Elemente sind schnell durch die mikrobielle Gemeinschaft assimiliert (Poorvin et al. 2004, Mioni et al. 2005). Die Rate der Nährstoff-Fluss in die Umwelt kann durch Multiplikation der Anzahl der Zellen durch die Menge an Nährstoffen pro Zelle (bezeichnet "Quoten") zerstört bestimmt werden. Diese Informationen können eine wichtige Komponente, um unser Verständnis, wie mikrobielle Nahrungsnetze Funktion in aquatischen Systemen.
Laufende Entwicklungen: Die gegenwärtigen Bemühungen durch eine Reihe von Arbeitsgruppen beinhalten die Anpassung der oben genannten Strategie auf spezifische Viren innerhalb der Gemeinde aufzählen und als solche zu bestimmen, wie bestimmte Organismen durch Virus-Aktivität beeinflusst werden. Dazu nutzen die Forscher quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), um die Fülle von spezifischen Viren Gruppen oder Familien in parallel Schätzung an die Schätzungen der Gesamtkosten der Virus-Community. Die Ergebnisse werden dann direkt angewendet Schätzungen des Virus Sterblichkeit, Nährstoffhaushalt, etc für bestimmte Plankton Gruppen. Diese leistungsstarke neue Ansatz erlaubt es den Forschern in den kommenden Jahren viel tiefer graben in die Prozesse mit der Ökologie von Viren assoziiert, und zum ersten Mal, um die Wechselwirkungen von spezifischen Virus-Wirt-Gemeinden außerhalb der Grenzen des Labor-Systeme zu quantifizieren.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Veröffentlichung dieses Artikels wurde durch einen Zuschuss aus dem Office of Research an der University of Tennessee unterstützt. Die Autoren danken der vorherigen Generation von Studenten und Forschern, die daran gearbeitet, diese Verfahren zu verfeinern können. Forschung wurde durch Zuschüsse der National Science Foundation (NSF-0851113, NSF-0825405 und NSF-0550485) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% p-phenylenediamine | Acros Organics | 130575000 | Stock for Antifade |
| Amicon Proflux M12 system | EMD Millipore | N/A | Any ultrafiltration device may be used for this step |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Invitrogen | S-7563 | |
| Helicon S10 30kDa Filter | EMD Millipore | CDUF010LT | |
| Pelicon XL filters 0.22 μm | Fisher Scientific | PXGVPPC50 | |
| GE 0.2 μm PCTE membrane filters (47mm) | Fisher Scientific | 09-732-35 | |
| Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System | EMD Millipore | XX42LSS11 | Other TFF systems may be used for this step |
| 0.45 μm Micronstep, Cellulosic, white plain filters (25mm) | Fisher Scientific | E04WP02500 | |
| GE Whatman 0.02 μm Anodisc filters (25mm) | Fisher Scientific | 68-09-6002 | |
| Leica DMRXA microscope | Any epifluorescence microscope with a blue filter set may be used | ||
| 20L polycarbonate carboys | Fisher Scientific | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5) | Fisher Scientific | BP329-500, S640-500 | |
| 50% Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G151-1 | |
| Corning 2 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-71 | Any cryovials may be used |
| Corning 5 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-74 | Any cryovials may be used |
| 85% H3PO4 | Fisher Scientific | A242-212 | Spiral Membrane storage |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-3 | M12 cleaning |
| Graduated Cylinders | |||
| Isopore 0.8-μm pore-size membrane filter (142mm) | EMD Millipore | ATTP14250 | |
| Millipore Stainless Steel Pressure Filter Holder (142mm) | Fisher Scientific | YY30 090 00 |
References
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