Summary
Текучесть кадров вирусов в морских и пресноводных систем может быть оценена по сокращению и повторение техники. Данные позволяют исследователям сделать вывод о темпах вирус-опосредованной микробной смертности в водных системах.
Abstract
Вирусы широко распространены компонентов морских и пресноводных систем, а, как известно, значительные средства микробного смертности. Разработка количественных оценок этого процесса является критическим, как мы можем разработать более эффективные модели микробного сообщества структуру и функции, а также продвижения нашего понимания того, как вирусы работы для изменения водных биогеохимических циклов. Техника вирус сокращении позволяет исследователям оценить скорость, с которой вирусные частицы выходят из эндемичных микробного сообщества. Короче говоря, обилие свободного (внеклеточного) вирусов снижается в образце в то время как микробного сообщества поддерживается на уровне около окружающей концентрации. Микробного сообщества затем инкубировали в отсутствие свободных вирусов и скорость, с которой вирусы повторяться в образце (через лизис уже инфицированных членов общины) может быть количественно epifluorescence микроскопии, или, в случае конкретных вирусах, количественные ПЦР. Эти показатели могут быть использованы для оценки скорости микробного смертности от вируса-опосредованного лизиса клеток.
Protocol
1. Ультрафильтрация морской воды для генерации "вирусов" Вода (Wilhelm & Poorvin 2001)
- Примерно 20L морской воды / lakewater собирают в виде стерильных насколько это возможно.
- Вода серийно prefiltered через 142-мм поликарбоната 0,8 мкм фильтры, которые могут храниться при температуре -20 ° С для сообщества анализа. Фильтры большего размера пор могут быть использованы, прежде чем этот шаг для очень производительных систем.
- Для получения ультрафильтрации воды из системы Amicon M12 (Millipore) 30 кДа-обрезания спираль используется картридж, чтобы исключить все вирусы, даже небольшие РНК-содержащих вирусов.
- Образцы обрабатываются и концентрируется на ~ 25% скорости ~ 15-16 кПа противодавления.
- Остальные образца ~ 500 мл воды будет содержать сосредоточены сообщество вирусов (которые могут быть сохранены для других экспериментов), а остальные 19,5 л вирусов вода будет использоваться для вирусных анализов производства.
- После каждого дня использования, Amicon M12 система должна быть очищена, чтобы предотвратить повреждение мембраны фильтра.
- Если вы работаете с морской водой, промыть мембраны с по крайней мере 6L Милли-Q водой с последующим промыванием 0,1 N NaOH раствор на 30-45 минут.
- Снова промойте картридж, по крайней мере 6L Милли-Q воды.
- При завершении работы с M12 системы, спираль картридж должен храниться в 0.05MH 3 PO 4 решения при 4 ° C.
2. Вирус методе редукции для вирусного производства (Wilhelm и соавт. 2002)
- До 500 мл морской воды / lakewater образца с хозяина и вирусы получается и помещен в блок sterifilter с 0,2-мкм номинальная пор по размерам низким белком-связывающий фильтра (например, Durapore), размещенные на нем.
- Образец мягко вакуум давление на <200 мм рт.ст. в то время как постоянно суспендирования образца с помощью стерильной пипетки передачи для подавления бактериальных клеток сосредоточиться на фильтре.
- Медленно три тома ультрафильтрата добавляются в бактериальной суспензии значительно сократить количество свободных вирусов в исследуемом образце.
- Бактериальная фракция разбавляют обратно до 500 мл с вирусом без воды и разделить на три повторов 150 мл каждая и находятся в открытом 250мл бутылки из поликарбоната.
3. Тангенциального потока фильтрации (TFF) Метод Вирусный Производство (Weinbauer и соавт. 2002, Winget и соавт. 2005)
TFF представляет альтернативный подход к вирусным методом сокращения.
- Около 500 мл природном образце собирается, как описано выше.
- Этот образец концентрированного использованием 0,2-мкм номинальная пор по размерам тангенциальной системой фильтрации потока.
- При бактериальных фракция снижается примерно до 10-15 мл, ультрафильтрации, вирусов, добавляют воду и распространяется как указано выше.
- Повторить бутылки инкубируют при на месте условий с использованием температурных камер.
- Свет уровни изменяются условия на поверхности с помощью синего оттенка акрила или прозрачного акрила с экранированием сети, чтобы уменьшить интенсивность света.
- Температура окружающей среды поверхности часто получают с помощью морской воды течет палубе инкубатора.
- Образцы для бактериальных и вирусных оценки обилия берутся в момент времени 0 с конечной концентрации 2,0-2,5% стерильного глутаральдегида добавлены в криопробирки. Эти образцы сразу же глубокой заморозки жидким азотом и хранят в замороженном виде, пока обрабатываются.
- Если жидкий азот недоступен, микроскопия слайды могут быть подготовлены и обработаны немедленно (см. процедуру ниже)
- Подвыборки собираются каждые 2,5 часа, по крайней мере 10 часов по методике, описанной выше.
- В это время вода может быть собрана для количественного анализа ПЦР. До 5 мл образца могут быть добавлены к криопробирку без каких-закрепителя, с немедленным замораживания вспышки в жидком азоте.
4. Вирусный микроскопии Производство (Noble & Фурман 1998, Вэнь соавт. 2004)
- Замороженные образцы должны быть 0.02-мкм фильтром для микроскопии должна быть талой на льду.
- Подготовка исходного раствора SYBR Green путем разбавления 1:10 маточного раствора стерильной водой. Далее, из маточного раствора, готовят рабочий раствор, добавляя 1 мл исходного раствора до 39 мл стерильной воды. 50% глицерина, 50% фосфатного буфера солевых растворов (PBS, 0,05 М Na 2 HPO 4, 0,85% NaCl, рН 7,5) и свежие 2,5% маточного раствора р-фенилендиамин также должны быть подготовлены до начала. Держите 50% glycerol/50% PBS растворе при 4 ° С и р-phenylenediamINE акции при температуре -20 ° С в темноте до запуска. Прямо перед фильтрации добавить р-фенилендиамин на 50% glycerol/50% PBS до конечной концентрации 0,1% для использования в качестве Antifade решение.
- Место 25 мм 0.02-мкм Anodisc фильтр в верхней части 0,45-мкм MicronStep, целлюлозный фильтр поддержку. Добавить 850 мкл установленного образца в начало Anodisc и вакууме при 20 рКа до полного высыхания. Разместить 100 мкл SYBR Green рабочего раствора в стерильную чашку Петри и, с вакуумным еще включен, осторожно удалите Anodisc из фильтра башни и разместить на SYBR Green. Инкубируйте образцы в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут. Осторожно выньте фильтр из раствора SYBR зеленый и фитиль задней фильтр с Kimwipe чтобы удалить остатки красителя. При желании, вернуть фильтр башню и пройти до 800 мкл 0.02-мкм фильтрованной воды или стерильной СМИ через фильтр, чтобы смыть избыток пятно.
- Добавить небольшую каплю antifade решение стекло микроскопа и место покровное стекло сверху. Снимите крышку скольжения и добавить сушеный фильтр стекло микроскопа мокрым antifade решение. Опять же, добавить небольшое количество antifade решение покровным стеклом и медленно поместите его в верхней части фильтра, убедившись в том, чтобы избавиться от любых пузырей, которые могут образовывать.
- Сразу же заморозить слайды при температуре -20 ° С до необходимой (это должно быть использовано в течение нескольких месяцев, чтобы предотвратить выцветание и опустил вирус отсчетов)
- Вирусы перечисляются с помощью флуоресцентной микроскопии (в нашем случае микроскоп Leica DMRXA) с широкой голубой набор фильтров (λ = Ex 450 до 490 нм, λ Em = 510 нм с фильтром подавления при λ = 510 нм). Каждый фильтр будет иметь не менее 20 полей зрения считается, убедившись, что количественно общего вирусов из каждого поля сетки для обеспечения равномерного распространения вирусов через мембранный фильтр.
- Усредненные ставки вируса повторения из трех независимых повторяет, затем рассчитывается и стандартное отклонение определяется из норм выработки.
5. Представитель Результаты
Сырых данных, собранных исследователем требует минимальной математической обработке для получения повторного темпами вирус изобилии. Первичного набора данных в результате данного исследования является повторение темпами вирус изобилии в подвыборки из инкубации. Эти результаты образуют самостоятельные регрессии вируса изобилии в зависимости от времени для каждого из образцов. Для каждого образца отдельных инкубации выступать в качестве одного лечения, поэтому, выполнив три одинаковых-инкубации исследователь может рассчитать ставки, а также оценка изменения (например, стандартное отклонение) (см. Рисунок 1).
Одно предостережение этого процесса является то, что сокращение вирус неизменным изобилие приводит к сокращению клеток хозяина в образце, что являются носителями вируса бремя. Чтобы компенсировать эту потерю, перечисление бактериальных изобилии от обоих источников (нефильтрованного морской или озерной воды) и Т = 0 инкубации образца необходимо. Эта информация может быть использована для учета процент клеток теряется: если предположить, что процесс сокращения вирус изобилие не является избирательным за или против любого членов микробного сообщества, этот фактор может быть использован для оценки на месте дебит вирусов .
Рисунок 1. Производство вирус-подобных частиц в течение 10 часов инкубации при температуре на месте условий с использованием epifluorescence микроскопии. Образцы были собраны во время цветения фитопланктона у берегов Новой Зеландии в сентябре 2008 года.
Рисунок 2. Принципиальная схема процесса работы потока для опробования вирус производства. Процесс начинается с ультрафильтрации пробы воды для генерации вирусов воды. Это завершены использованием ультрафильтрации системы. Параллельно проб воды собираются в том же месте и бесплатный вирусов пропускают через фильтр в то время как микробного сообщества (содержащий смесь зараженных и незараженных клеток) сохраняется. Это сообщество затем ресуспендировали в воде вирусов и инкубировали при на месте условий. Повторения скорость вирусов является то контролироваться на ближайшие 10 часа для определения ставок вируса производства.
Discussion
Важным компонентом в понимании того, как вирусы влияния морских микробных сообществ, чтобы определить скорость, с которой вирусной частицы образуются. Учитывая, что распространенность являются (более или менее) статическое в большинстве систем (Wilhelm & Сатл 1999, Weinbauer 2004), и, что вирусы удаляются или оказываемых неинфекционных быстро в водных системах (Wilhelm и соавт. 1998), затем темпы производства должны быть относительно быстрыми темпами, чтобы заменить потерянные частиц.
Оценка смертности вирусы вызывают на микробное сообщество требует знания того, как многие вирусы создаются каждый раз, когда вирус лизирует клетки ("взрыв размере"). Вирус взрыв размеров в природных образцах может сильно варьироваться. Съемки размеры могут быть определены непосредственно методом просвечивающей электронной микроскопии (например, Weinbauer & Peduzzi 1994), но это часто выходят за пределы возможностей данной лаборатории или не всегда практично. В ситуациях, когда они не могут быть определены эмпирически, литературе значения от 24 вирусов на литические события может быть использован для морских систем и 34 для пресноводных систем (Парада соавт. 2006). Если скорость вирус производства делится на это число, то результат будет обилие клеток на объем уничтожены вирусов на ежедневной основе. Микробы лизировали значение может быть разделен на акции стояли бактериальных изобилии в результате чего вирус индуцированной смертности для рассматриваемой системы: существующий диапазон оценки от нескольких процентов до почти всего населения и часто зависят от других факторов в рассматриваемой системы (Wilhelm & Мэттесон 2008). Чтобы определить процент от общей смертности в это число часто умножается на два (рабочий из предположения, что 50% клеток продолжают воспроизводить и 50% клеток теряются, Weinbauer 2004).
Учитывая, что питательных веществ и микроэлементов биодоступность (например, N, P, Fe) может ограничить скорость первичной продуктивности, и как таковой потока углерода через водные системы, и понимание роли вируса управляемой микробной смертности в этом процессе стало представлять интерес для морских геохимиков. Некоторые оценки в настоящее время существуют вирусы, которые предполагают освобождение значительной концентрации питательных элементов обратно в толще воды на ежедневной основе (Rowe и соавт. 2008, Хиггинс и соавт. 2009) и что эти элементы быстро усваивается микробного сообщества (Poorvin и др. др.. 2004, Mioni и соавт. 2005). Скорость потока в питательной среде может быть определена путем умножения количества клеток разрушены количество питательных В на ячейку (обозначается «квоты»). Эта информация может обеспечить важный компонент нашего понимания того, как микробные пищевые цепи функцию через водные системы.
Текущие события: Текущие усилия ряда исследовательских групп включают адаптацию выше стратегии перечислить конкретные вирусы в рамках сообщества и, таким образом, чтобы определить, как конкретные организмы находятся под влиянием вирусной активности. Для этого исследователи используют количественные полимеразной цепной реакции (КПЦР) для оценки обилия отдельных групп вирусов или семей, параллельно с оценками общего сообщества вируса. Затем результаты непосредственно применяться для получения оценок вируса смертности, питательных оборот и т.д. для конкретных групп планктона. Этот мощный новый подход позволит исследователям в ближайшие годы копать гораздо глубже в процессах, связанных с экологией вирусов и, в первый раз, дать количественную оценку взаимодействия конкретных вирусов принимающих общин за ограничений систем лаборатории.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Публикация этой статьи была поддержана грантом Управления исследований при Университете штата Теннесси. Авторы выражают благодарность предыдущему поколению студентов и исследователей, которые работали для уточнения этих процедур. Работа выполнена при поддержке грантов от Национального научного фонда (NSF-0851113, NSF-0825405 и NSF-0550485).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% p-phenylenediamine | Acros Organics | 130575000 | Stock for Antifade |
| Amicon Proflux M12 system | EMD Millipore | N/A | Any ultrafiltration device may be used for this step |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Invitrogen | S-7563 | |
| Helicon S10 30kDa Filter | EMD Millipore | CDUF010LT | |
| Pelicon XL filters 0.22 μm | Fisher Scientific | PXGVPPC50 | |
| GE 0.2 μm PCTE membrane filters (47mm) | Fisher Scientific | 09-732-35 | |
| Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System | EMD Millipore | XX42LSS11 | Other TFF systems may be used for this step |
| 0.45 μm Micronstep, Cellulosic, white plain filters (25mm) | Fisher Scientific | E04WP02500 | |
| GE Whatman 0.02 μm Anodisc filters (25mm) | Fisher Scientific | 68-09-6002 | |
| Leica DMRXA microscope | Any epifluorescence microscope with a blue filter set may be used | ||
| 20L polycarbonate carboys | Fisher Scientific | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5) | Fisher Scientific | BP329-500, S640-500 | |
| 50% Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G151-1 | |
| Corning 2 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-71 | Any cryovials may be used |
| Corning 5 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-74 | Any cryovials may be used |
| 85% H3PO4 | Fisher Scientific | A242-212 | Spiral Membrane storage |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-3 | M12 cleaning |
| Graduated Cylinders | |||
| Isopore 0.8-μm pore-size membrane filter (142mm) | EMD Millipore | ATTP14250 | |
| Millipore Stainless Steel Pressure Filter Holder (142mm) | Fisher Scientific | YY30 090 00 |
References
- Higgins, J. L., Kudo, I., Nishioka, J., Tsuda, A., Wilhelm, S. W. The response of the virus community to a mesoscale iron fertilization in the sub-Arctic Pacific Ocean. Deep-Sea Res II. 56, 2788-2795 (2009).
- Mioni, C. E., Poorvin, L., Wilhelm, S. W. Virus and siderophore-mediated transfer of available Fe between heterotrophic bacteria: characterization using a Fe-specific bioreporter. Aquat Microb Ecol. 41, 233-245 (2005).
- Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Parada, V., Herndl, G., Weinbauer, M. G. Viral burst size of heterotrophic prokaryotes in aquatic systems. J Mar Biol Assoc U K. 86, 613-621 (2006).
- Poorvin, L., Rinta-Kanto, J. M., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. Viral release of Fe and its bioavailability to marine plankton. Limnol Oceanogr. 49, 1734-1741 Forthcoming.
- Rowe, J. M., Saxton, M. A., Cottrell, M. T., DeBruyn, J. M., Berg, G. M., Kirchman, D. L., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. Constraints on virus production in the Sargasso Sea and North Atlantic. Aquat Microb Ecol. 52, 233-244 (2008).
- Weinbauer, M. G. Ecology of prokaryotic viruses. FEMS Microbiol Rev. 28, 127-181 (2004).
- Weinbauer, M. G., Peduzzi, P. Frequency, size and distribution of bacteriophages in different marine morphotypes. Mar Ecol Prog Ser. 108, 11-20 (1994).
- Weinbauer, M. G., Winter, C., Hö, fle, G, M. Reconsidering transmission electron microscopy based estimates of viral infection of bacterioplankton using conversion factors derived from natural communities. Aquat Microb Ecol. 27, 103-110 (2002).
- Wen, K., Ortmann, A. C., Suttle, C. A. Accurate estimation of viral abundance by epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 70, 3862-3867 (2004).
- Wilhelm, S. W., Brigden, S. M., Suttle, C. A. A dilution technique for the direct measurement of viral production: a comparison in stratified and tidally mixed coastal waters. Microb Ecol. 43, 168-173 (2002).
- Wilhelm, S. W., Matteson, A. R. Freshwater and marine virioplankton: a brief overview of commonalities and differences. Freshw Biol. 53, 1076-1089 (2008).
- Wilhelm, S. W., Poorvin, L. Quantification of algal viruses in marine samples. Paul, J. H. , Academic Press. London, UK. 53-66 (2001).
- Wilhelm, S. W., Suttle, C. A. Viruses and nutrient cycles in the sea. Bioscience. 49, 781-788 (1999).
- Wilhelm, S. W., Weinbauer, M. G., Suttle, C. A., Jeffrey, W. H. The role of sunlight in the removal and repair of viruses in the sea. Limnol Oceanogr. 43, 586-592 (1998).
- Winget, D. M., Williamson, K. E., Helton, R. R., Wommack, K. E. Tangential flow diafiltration: an improved technique for estimation of virioplankton production. Aquat Microb Ecol. 41, 221-232 (2005).
