Summary
Omsättningshastigheten av virus i havs-och sötvatten system kan uppskattas genom en minskning och återkommer teknik. De data som möjligt för forskare att sluta andelen virus-medierad mikrobiell dödlighet i akvatiska system.
Abstract
Virus är genomgående komponenter av marina och sötvatten system och är kända för att vara betydande agenter för mikrobiell dödlighet. Utveckla kvantitativa beräkningar av denna process är avgörande när vi sedan kan utveckla bättre modeller av mikrobiella struktur och funktion samt förbättra vår förståelse av hur virus fungerar att ändra vattenlevande biogeokemiska kretsloppen. Viruset minskning Tekniken gör det möjligt för forskare att bedöma i vilken takt viruspartiklar frigörs från endemiska mikrobiella. I korthet är det överflöd av fria (extracellulärt) virus minskat i ett prov, medan den mikrobiella hålls på nära omgivande koncentration. Den mikrobiella inkuberas sedan i avsaknad av fria virus och i vilken takt virus återkommer i urvalet (genom lysering av redan smittade medlemmar i gemenskapen) kan kvantifieras genom epifluorescence mikroskopi eller, i fråga om specifika virus, kvantitativa PCR. Dessa kurser kan sedan användas för att uppskatta graden av mikrobiella dödlighet på grund av virus-lys av celler.
Protocol
1. Ultrafiltrering av havsvatten för att generera "virusfritt" Vatten (Wilhelm & Poorvin 2001)
- Cirka 20L av havsvatten / lakewater samlas så aseptiskt som möjligt.
- Vatten är seriellt Förfiltrerat genom 142-mm polykarbonat 0,8 ìm filter som kan hållas vid -20 ° C i samhället analys. Större porstorlek filter kan användas innan detta steg för mycket produktiva system.
- För att få ultrafiltrerat vatten från en Amicon M12-system (Millipore) ett 30 kDa-cutoff spiral kassett används för att utesluta alla virus, även små RNA-virus.
- Proverna behandlas och koncentrerats till ~ 25% snabbare med ~ 15-16 kPa från mottryck.
- Den återstående urval av ~ 500 ml vatten kommer att innehålla en koncentrerad virus gemenskapen (som kan sparas för andra experiment) medan resterande 19,5 L i virus-fritt vatten kommer att användas för viral produktion analyser.
- Efter varje dag för nyttjande, måste Amicon M12 systemet rengöras för att förhindra skador på membranet i filterpatronen.
- Om du arbetar med havsvatten, skölj membranet ut med minst 6L av Milli-Q vatten följt av en tvättning med 0,1 N NaOH-lösning i 30-45 minuter.
- Återigen spola kassetten med minst 6L av Milli-Q Water.
- När du är klar med M12-systemet bör spiralen cylinderampullen förvaras i en 0.05MH 3 PO 4-lösning vid 4 ° C.
2. Virus Minskning Metod för Viral Produktion (Wilhelm et al. 2002)
- Upp till 500 mL av havsvatten / lakewater provet med både värd och virus erhålls och placeras i en sterifilter enhet med en 0,2-ìm nominella por-storlek låg proteinbindningsgrad och filter (t.ex. Durapore) placeras på den.
- Provet är lätt vakuum pressas på <200 mmHg medan kontinuerligt resuspending provet med en steril överföringspipett hämma den bakteriella celler från att koncentrera på filtret.
- Långsamt tre volymer av ultrafiltrat läggs till bakteriesuspensionen att avsevärt minska antalet fria virus i provet.
- Den bakteriella fraktionen späds till 500 ml med virus-fritt vatten och indelad i tre replikat av 150 ml vardera och placeras i tydliga 250ml polykarbonat flaskor.
3. Tangentiell flow filtration (TFF) Metod för Viral Produktion (Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005)
TFF är ett alternativ till den virala minskningen metoden.
- Cirka 500 ml av naturliga prov samlas in enligt ovan.
- Detta prov är koncentrerad med en 0,2-ìm nominella por-storlek tangentiell systemflöde filtrering.
- När den bakteriella fraktionen reduceras till cirka 10-15 ml, är ultrafiltrerat, virusfritt vatten tillsätts och distribueras som ovan.
- Identiska flaskor inkuberas vid in situ med hjälp av miljö-kammare.
- Ljusnivåer ändras till ytan villkor genom att använda blåtonade akryl eller akryl med screening nätet för att minska ljusstyrkan.
- Omgivande yttemperaturer ofta erhållits med hjälp av en flödande havsvatten däck inkubator.
- Prover för bakterier och virus överflöd uppskattningar är tagna vid tidpunkten 0 med en slutlig koncentration av 2,0 till 2,5% steril glutaraldehyd läggas in cryovials. Dessa prover är flash omedelbart fryses med flytande kväve och förvaras frysta fram bearbetas.
- Om flytande kväve inte är tillgänglig, kan mikroskopi diabilder sammanställas och bearbetas omedelbart (se anvisningarna nedan)
- Delprov samlas in vart 2,5 timmar i minst 10 timmar av den metod som beskrivs ovan.
- Vid denna tid vatten kan samlas in för kvantitativ PCR-analys. Upp till 5 ml av provet kan läggas till en cryovial utan fixativ agent med omedelbar flash frysning i flytande kväve.
4. Viral Produktion Mikroskopi (Noble & Fuhrman 1998, Wen et al. 2004)
- Frysta prover som 0,02-ìm filtreras för mikroskopi ska tinas på is.
- Bered en stamlösning av SYBR Gröna genom att späda 1:10 stamlösningen med sterilt vatten. Nästa, från stamlösningen, förbereda en fungerande lösning genom att tillsätta 1 mL stamlösning till 39 mL sterilt vatten. En 50% glycerol, buffrad 50% fosfat saltlösningar (PBS, 0,05 M Na 2 HPO 4, 0,85% NaCl, pH 7,5) och färsk 2,5% stamlösning av p-fenylendiamin bör också vara beredd innan du börjar. Håll 50% glycerol/50% PBS-lösning vid 4 ° C och p-phenylenediamine lager vid -20 ° C i mörker tills start. Precis innan filtrering lägga till p-fenylendiamin till 50% glycerol/50% PBS till en slutlig koncentration på 0,1% som ska användas som Antifade lösningen.
- Placera en 25 mm 0,02-ìm Anodisc filter på toppen av en 0,45-ìm MicronStep, cellulosa uppbackning filter. Tillsätt 850 mikroliter av den fasta prov till toppen av Anodisc och vakuum vid 20 pKa tills det är helt torkat. Häll 100 mikroliter av SYBR Gröna arbetar lösning till en steril petriskål och med vakuum fortfarande på, försiktigt bort Anodisc från filtret tornet och plats på SYBR Green. Inkubera proverna i mörker vid rumstemperatur i 20 minuter. Ta försiktigt bort filtret från SYBR gröna lösningen och veke baksidan av filtret med en Kimwipe att ta bort alla rester av färg. Om så önskas, återgå filtret till tornet och gå upp till 800 mikroliter av 0,02-ìm filtrerat vatten eller steril media genom filtret för att skölja bort överflödig färg.
- Lägg en liten droppe antifade lösning på ett objektglas och lägg ett täckglas ovanpå. Ta bort locket glida och lägga den torkade filtret till objektglas våta med antifade lösningen. Återigen, tillsätt en liten mängd antifade lösning på täckglas och långsamt placera den på toppen av filtret och se till att få bort eventuella luftbubblor som kan bildas.
- Omedelbart frysa bilderna vid -20 ° C tills det behövs (dessa bör användas inom ett par månader för att förhindra blekning och sänkt virus räknas)
- Virus räknas upp med hjälp av fluorescensmikroskopi (i vårt fall en Leica DMRXA mikroskop) med ett stort blått filter som (λ Ex = 450 till 490 nm, λ EM = 510 nm med en dämpning filter vid λ = 510 nm). Varje filter kommer att ha minst 20 områden som räknas visa, och se till att kvantifiera den totala virus från varje fält rutnät att säkerställa en jämn spridning av virus över filtret membran.
- Genomsnitt andelen virus upprepning från de tre oberoende replikat sedan beräknas och en standardavvikelse bestäms utifrån produktionstakten.
5. Representativa resultat
De uppgifter som samlats in av forskaren kräver minimalt matematisk bearbetning för att generera återfall andelen virus överflöd. Den primära uppgifter som följer av denna studie är den återkommer andelen virus överflöd i delprov från inkubationer. Dessa resultat bildar oberoende regressionsanalys av viruset överflöd vs tid för varje prov. För varje prov individen inkubationer fungera som en behandling, så genom att fylla tre likadana-inkubationer forskaren kan beräkna priser samt en uppskattning av variation (t.ex. standardavvikelse) (se figur 1.)
En nackdel med denna process är att minskningen av viruset överflöd undantagslöst leder till en minskning i den mottagande cellerna i provet som bär på viruset bördan. För att kompensera denna förlust, uppräkning av bakteriell överflöd från både källan (ofiltrerade havsvatten eller sjövatten) och T = 0 inkubering prov är nödvändiga. Denna information kan användas för att redovisa den andel av förlorade celler: under förutsättning att processen med att minska virus överflöd är inte selektiv för eller emot några medlemmar av den mikrobiella Denna faktor kan sedan användas för att beräkna in situ produktionstakten av virus .
Figur 1. Produktionen av virusliknande partiklar över en 10 timmars inkubation vid in situ-förhållanden med epifluorescence mikroskopi. Prover samlades in under en växtplankton blommar utanför Nya Zeeland i september 2008.
Figur 2. Schematisk beskrivning av arbetsflödet processen för testmetoder för virus produktion. Processen börjar med ultrafiltrering av prov vatten för att generera virus-fritt vatten. Detta är klar med en ultrafiltrering system. Parallellt vattenprover tas från samma plats och den fria virus passerar genom ett filter, medan den mikrobiella (som innehåller en blandning av infekterade och icke-infekterade celler) behålls. Denna gemenskap är då suspenderade i viruset gratis vatten och inkuberas i in situ-förhållanden. Den återkommer graden av virus är då övervakas under de kommande 10 timmarna för att bestämma andelen virus produktion.
Discussion
En viktig komponent i förståelsen av hur virus påverkar marina mikrobiella samhällen är att bestämma i vilken takt viruspartikeln produceras. Med tanke på att abundances är (mer eller mindre) statiskt i de flesta system (Wilhelm & Suttle 1999, Weinbauer 2004), och att virus tas bort eller gjorts icke-infektiösa snabbt i akvatiska system (Wilhelm et al. 1998), då produktionstakten måste relativt snabba att ersätta förlorade partiklar.
Uppskattning av dödlighet virus orsakar att den mikrobiella kräver en kunskap om hur många virus produceras varje gång ett virus lyserar en cell (den "burst storlek"). Virus brast storlekar i naturliga prover kan variera kraftigt. Burst storlekar kan avgöras direkt av transmissionselektronmikroskopi (t.ex. Weinbauer & Peduzzi 1994), men detta är ofta inte klarar av ett visst laboratorium eller inte alltid praktiskt. I situationer där de inte kan empiriskt fastställas kan litteraturen värden på 24 virus per lytisk omständigheter användas för marina system och 34 för sötvatten system (Parada et al. 2006). Om graden av virus produktionen delat med detta nummer, är resultatet det överflöd av celler per volym förstörs av virus på en daglig basis. Mikroberna lyserade värde kan sedan delas med den stående beståndet av bakteriell överflöd resulterar i inducerade virus dödligheten för systemet i fråga: befintliga uppskattningarna varierar från några få procent till nästan hela befolkningen och är ofta beroende av andra faktorer i systemet i fråga (Wilhelm & Matteson 2008). För att bestämma andel av den totala dödligheten detta nummer är ofta multipliceras med två (arbetar från antagandet att 50% av cellerna fortsätta att reproducera och 50% av cellerna försvinner, Weinbauer 2004).
Med tanke på att näringsämnen och spårämnen biotillgänglighet (t.ex. N, P, Fe) kan begränsa graden av primär produktivitet, och som sådan kolflöde via akvatiska system och förståelse för betydelsen av virus-driven mikrobiell dödligheten i denna process har blivit av intresse för marina geokemister. Flera uppskattningar finns nu som tyder på virus släppa en betydande koncentration av näringsämnen till vattnet på daglig basis (Rowe et al. 2008, Higgins et al. 2009) och att dessa element är snabbt assimileras av den mikrobiella (Poorvin et al. 2004, Mioni et al. 2005). Graden av näringsämnen flux för miljön kan bestämmas genom att multiplicera antalet celler förstörs av mängden näringsämnen per cell (betecknas "kvoter"). Denna information kan ge en kritisk komponent för förståelsen av hur mikrobiella näringsväven fungerar i akvatiska system.
Pågående utveckling: Nuvarande insatser av en rad forskargrupper innebära att anpassa ovanstående strategi att räkna upp specifika virus i samhället och som sådan, för att avgöra hur specifika organismer påverkas av virus aktivitet. För att göra detta använder forskarna den kvantitativa polymeraskedjereaktion (qPCR) för att uppskatta mängden av specifika virus grupper eller familjer parallellt med uppskattningar av de totala viruset gemenskapen. Resultaten är sedan direkt användas för att ge skattningar av viruset dödlighet, näringsomsättning, etc för vissa plankton grupper. Denna kraftfulla nya metod kommer att låta forskare under de kommande åren att gräva mycket djupare in i processerna i samband med ekologi av virus och för första gången, att kvantifiera interaktioner av specifika virus-värd samhällen bortom de begränsningar av laboratorie-system.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Publiceringen av denna artikel stöddes av ett bidrag från Office of Research vid University of Tennessee. Författarna tackar den tidigare generationen av studenter och forskare som har arbetat för att förfina dessa förfaranden. Forskningen har finansierats med bidrag från National Science Foundation (NSF-0.851.113, NSF-0.825.405 och NSF-0.550.485).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% p-phenylenediamine | Acros Organics | 130575000 | Stock for Antifade |
| Amicon Proflux M12 system | EMD Millipore | N/A | Any ultrafiltration device may be used for this step |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Invitrogen | S-7563 | |
| Helicon S10 30kDa Filter | EMD Millipore | CDUF010LT | |
| Pelicon XL filters 0.22 μm | Fisher Scientific | PXGVPPC50 | |
| GE 0.2 μm PCTE membrane filters (47mm) | Fisher Scientific | 09-732-35 | |
| Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System | EMD Millipore | XX42LSS11 | Other TFF systems may be used for this step |
| 0.45 μm Micronstep, Cellulosic, white plain filters (25mm) | Fisher Scientific | E04WP02500 | |
| GE Whatman 0.02 μm Anodisc filters (25mm) | Fisher Scientific | 68-09-6002 | |
| Leica DMRXA microscope | Any epifluorescence microscope with a blue filter set may be used | ||
| 20L polycarbonate carboys | Fisher Scientific | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5) | Fisher Scientific | BP329-500, S640-500 | |
| 50% Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G151-1 | |
| Corning 2 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-71 | Any cryovials may be used |
| Corning 5 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-74 | Any cryovials may be used |
| 85% H3PO4 | Fisher Scientific | A242-212 | Spiral Membrane storage |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-3 | M12 cleaning |
| Graduated Cylinders | |||
| Isopore 0.8-μm pore-size membrane filter (142mm) | EMD Millipore | ATTP14250 | |
| Millipore Stainless Steel Pressure Filter Holder (142mm) | Fisher Scientific | YY30 090 00 |
References
- Higgins, J. L., Kudo, I., Nishioka, J., Tsuda, A., Wilhelm, S. W. The response of the virus community to a mesoscale iron fertilization in the sub-Arctic Pacific Ocean. Deep-Sea Res II. 56, 2788-2795 (2009).
- Mioni, C. E., Poorvin, L., Wilhelm, S. W. Virus and siderophore-mediated transfer of available Fe between heterotrophic bacteria: characterization using a Fe-specific bioreporter. Aquat Microb Ecol. 41, 233-245 (2005).
- Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Parada, V., Herndl, G., Weinbauer, M. G. Viral burst size of heterotrophic prokaryotes in aquatic systems. J Mar Biol Assoc U K. 86, 613-621 (2006).
- Poorvin, L., Rinta-Kanto, J. M., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. Viral release of Fe and its bioavailability to marine plankton. Limnol Oceanogr. 49, 1734-1741 Forthcoming.
- Rowe, J. M., Saxton, M. A., Cottrell, M. T., DeBruyn, J. M., Berg, G. M., Kirchman, D. L., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. Constraints on virus production in the Sargasso Sea and North Atlantic. Aquat Microb Ecol. 52, 233-244 (2008).
- Weinbauer, M. G. Ecology of prokaryotic viruses. FEMS Microbiol Rev. 28, 127-181 (2004).
- Weinbauer, M. G., Peduzzi, P. Frequency, size and distribution of bacteriophages in different marine morphotypes. Mar Ecol Prog Ser. 108, 11-20 (1994).
- Weinbauer, M. G., Winter, C., Hö, fle, G, M. Reconsidering transmission electron microscopy based estimates of viral infection of bacterioplankton using conversion factors derived from natural communities. Aquat Microb Ecol. 27, 103-110 (2002).
- Wen, K., Ortmann, A. C., Suttle, C. A. Accurate estimation of viral abundance by epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 70, 3862-3867 (2004).
- Wilhelm, S. W., Brigden, S. M., Suttle, C. A. A dilution technique for the direct measurement of viral production: a comparison in stratified and tidally mixed coastal waters. Microb Ecol. 43, 168-173 (2002).
- Wilhelm, S. W., Matteson, A. R. Freshwater and marine virioplankton: a brief overview of commonalities and differences. Freshw Biol. 53, 1076-1089 (2008).
- Wilhelm, S. W., Poorvin, L. Quantification of algal viruses in marine samples. Paul, J. H. , Academic Press. London, UK. 53-66 (2001).
- Wilhelm, S. W., Suttle, C. A. Viruses and nutrient cycles in the sea. Bioscience. 49, 781-788 (1999).
- Wilhelm, S. W., Weinbauer, M. G., Suttle, C. A., Jeffrey, W. H. The role of sunlight in the removal and repair of viruses in the sea. Limnol Oceanogr. 43, 586-592 (1998).
- Winget, D. M., Williamson, K. E., Helton, R. R., Wommack, K. E. Tangential flow diafiltration: an improved technique for estimation of virioplankton production. Aquat Microb Ecol. 41, 221-232 (2005).
