Summary
आणविक स्वाद पारगमन अंतर्निहित तंत्र का ज्ञान हाल ही में उल्लेखनीय प्रगति का आनंद लिया है, काफी हद तक वजह से पशु मॉडल का उपयोग करने के लिए. हालांकि, स्वाद और स्तनधारियों मानव ऊतकों में वारंट अध्ययन के बीच संवेदनशीलता और विशिष्टता में व्यापक विविधता है. हम एक बायोप्सी तकनीक मानव जीभ पर papillae से रहने स्वाद कोशिकाओं को इकट्ठा वर्णन.
Abstract
स्वाद की भावना मानव जीवन के लिए महत्वपूर्ण है. यह खाना है कि संभावित किया जाता हो जाएगा की गुणवत्ता के बारे में शरीर को सूचित और चयापचय प्रक्रियाओं है कि पाचन के लिए भोजनप्रणाली तैयार उत्तेजित करता है. स्थिर प्रगति जल्दी जैव रासायनिक और आणविक स्वाद पारगमन (समीक्षा के लिए, Breslin और स्पेक्टर 1, 2008) अंतर्निहित घटनाओं को समझने की दिशा में किया जा रहा है. हालांकि, तिथि करने के लिए प्रगति पशु मॉडल से बड़े पैमाने पर हुई है. फिर भी, के बाद से रिसेप्टर विशिष्टता और रिसेप्टर घनत्व में चिह्नित मतभेद प्रजातियों के बीच भिन्न, मानव स्वाद पारगमन केवल मानव स्वाद के ऊतकों का उपयोग करके समझा जाएगा. यहाँ हम एक बायोप्सी तकनीक के बारे में 0.5 मिमी व्यास स्वाद वाले मानव fungiform papillae, गोल गुलाबी पूर्वकाल संरचनाओं के रूप में दिखाई एकत्र वर्णन. ये biopsied papillae व्यवहार्य स्वाद कली कोशिकाओं के अलगाव, और स्वस्थानी संकरण immunohistochemistry, में, आण्विक जीव विज्ञान की तकनीकों के माध्यम से, स्वाद विशिष्ट उपन्यास प्रोटीन की पहचान सहित कई प्रयोजनों के लिए उपयोग किया जाता है.
Protocol
1. परिचय और जनरल के लिए विचारणीय बातें
सामान्य प्रक्रिया पूर्वकाल जीभ की पृष्ठीय सतह के एक छोटे से क्षेत्र (1 2 सेमी), (स्वाद) fungiform papillae की संख्या (6-8) है कि anesthetized क्षेत्र से हटाने का उपयोग एक घुमावदार वसंत सूक्ष्म द्वारा पीछा के स्थानीय संज्ञाहरण शामिल - कैंची (प्रकार McPherson - Vannas # 5603 SR, Roboz, रॉकविल, एमडी). हटाया fungiform papillae 0.25 लगभग 3 मिमी प्रत्येक रहे हैं. वहाँ बहुत कम गैर papillae (स्वाद) उपकला प्रत्येक papilla के साथ हटा दिया ऊतक है. 3 से 5 हफ्तों के बाद इस क्षेत्र में नई papillae फार्म और स्वाद कार्य (Spielman और ब्रांड, अप्रकाशित टिप्पणियों) हासिल. स्वाद या स्वाद सामग्री के इस छोटी राशि को हटाने के बाद भोजन के स्वाद पर कोई प्रत्यक्ष प्रभाव है. अध्ययन है कि वयस्क मानव जीभ में व्यक्तिगत स्वाद गिनती है से, यह अनुमान लगाया जा सकता है कि मानव जीभ लगभग 5000 स्वाद कर सकते हैं. हमारी प्रक्रिया को हटा सबसे कम 20 से 25 इन स्वाद (औसत पर, ~ 3,5 करने के लिए 4 fungiform papilla प्रति मानव में स्वाद) 2, या कुल का 0.4% के बारे में में. इसके अलावा वहाँ कोई दर्द इस ऊतक के शल्य चिकित्सा की हानि के साथ जुड़े है. एक पाठ्यक्रम के लगता है, केवल इंजेक्शन साइट में मामूली दर्द, के रूप में सुई जीभ में प्रवेश करती है. बाद संज्ञाहरण से पहना है, वहाँ कभी कभी एक दिन से भी कम समय के लिए हल्के असुविधा है, लेकिन इस परेशानी ज्यादा क्या एक अनुभव के बाद गलती से लोगों जीभ "काट" कम से कम है.
पिछले कई वर्षों से हम एक वैकल्पिक प्रक्रिया है कि संज्ञाहरण शामिल नहीं करता है विकसित किया है. ऊतक को हटाने के लिए तकनीक दोनों के लिए समान है. प्रक्रिया में फर्क सिर्फ इतना है कि कोई सर्जन अब 1 2 सेमी व्यास क्षेत्र है जहां संज्ञाहरण संबोधित किया ही सीमित है. बल्कि s / वह जीभ जहां प्रमुख papillae प्रकट की पृष्ठीय सतह पर किसी भी साइट को चुन सकते हैं. हटा papillae की कुल संख्या दोनों तकनीकों में 6-8 करने के लिए सीमित कर रहे हैं या संज्ञाहरण के बिना अगर ठीक से प्रदर्शन, 6-8 fungiform स्वाद papillae हटाने की बेचैनी एक मुद्दे के कम माना जाता है जब के प्रशासन के साथ जुड़े दर्द के साथ तुलना स्थानीय संज्ञाहरण व्यक्तियों, जो दोनों प्रक्रियाओं लिया की एक सामान्य सर्वेक्षण, यानी, साथ और संज्ञाहरण के बिना पता चला है कि विषयों की एक भारी बहुमत भविष्य की सभी बायोप्सी में स्थानीय संज्ञाहरण के बिना बांटना होगा. सर्जन, जो इस तकनीक (एआईएस) और कई लेखक जो संज्ञाहरण के बिना बायोप्सी प्रदर्शन द्वारा सिखाया सहयोगियों विकसित, यह खुद पर की कोशिश की है और गवाही कि असुविधा अस्थायी है और काट एक जीभ के तुलना में कम माना. अंत में, व्यक्तियों के दर्जनों जो biopsied सहमत हो अगर वे संज्ञाहरण के बिना एक papilla को हटाने की कोशिश करने को तैयार होगा पूछा गया है और अगर वे यह भी दर्दनाक वे संज्ञाहरण गुजरना होगा न्यायाधीश, सभी के लिए बिना papillae को हटाने के साथ जारी रखने के लिए सहमत हो गए हैं संज्ञाहरण.
पूरे बायोप्सी अब 5-10 मिनट से ज्यादा नहीं लेना चाहिए. यदि संज्ञाहरण कार्यरत है एक और 2-3 मिनट जोड़ा जाता है. बायोप्सी आमतौर पर सुबह घंटों में किया जाता है. बायोप्सी से पहले, स्वयंसेवकों अनुसूचित शुरू समय से दो घंटे पहले एक हल्का भोजन खाने के निर्देश दिए हैं. बायोप्सी में, लिखा सूचित सहमति प्राप्त की है. बायोप्सी के समय बहिष्करण मानदंड गंभीर पुरानी बीमारी के साथ उन लोगों में शामिल हैं, चाहे दवा के द्वारा नियंत्रित है या नहीं है (जैसे, किसी भी जठरांत्र रोगों, neurodegenerative रोगों, कैंसर, रक्त dyscrasias, स्थानीय anesthetics एलर्जी, आदि) हृदय की दर के साथ उन से अधिक 100 या 60 से कम, सिस्टोलिक 145 की तुलना में 100 से अधिक या कम दबाव, diastolic रक्तचाप 90 की तुलना में अधिक से अधिक या 60 से कम है, और सर्जन की राय है कि इस विषय के अध्ययन में भाग ले सकता है दबाव.
अंत में, यह महत्वपूर्ण है पर विचार करने के लिए कि बायोप्सी प्रक्रिया एक ही सुविधा है जहां ऊतक परीक्षा के लिए कार्रवाई की जाएगी ऊतक अखंडता के बाद से तेजी के रूप में हम अक्सर mRNA की गिरावट गुणवत्ता द्वारा उल्लेख किया है खो दिया है में बाहर किया जाना चाहिए. इन समस्याओं को कम करने के लिए जीभ ऊतक के रूप में जल्दी संभव के रूप में संसाधित किया जाना चाहिए.
2. विषय तैयारी
- विषय एक दंत कुर्सी या एक headrest के साथ एक सीट में बैठा है.
- बायोप्सी के समय हृदय गति और रक्तचाप की जाँच करें. यदि रक्तचाप, हृदय की दर या मौखिक क्षमता की सीमा के बाहर विषय गिरावट सर्जन विषय है कि वह / वह तत्काल नियुक्ति करने के लिए एक चिकित्सक को देखने के लिए सिफारिश की है.
- Xerostomia, भौगोलिक जीभ या किसी जीभ घावों के संकेतकों के लिए ध्यान के साथ, सामान्य ऊतक स्वास्थ्य के लिए मौखिक गुहा का निरीक्षण किया. कोई जीभ घावों या xerostomia सहित मौखिक रोग के लक्षण, दिखाने के विषय के अध्ययन से बाहर रखा गया है. पानी के साथ मुँह कुल्ला करने के लिए मौखिक cavit से सभी मलबा हटाने विषय आज्ञावाई यदि आवश्यक हो तो जीभ एक डिस्पोजेबल जीभ पट्टिका या मलबा हटाने scrapper, जो जीभ में संज्ञाहरण के इंजेक्शन के दौरान किया जा सकता है के साथ साफ है. सर्जन एक gloved हाथ में बाँझ धुंध पैड का उपयोग करता है करने के लिए जीभ के पूर्वकाल ¼ पकड़ के रूप में इसे मौखिक गुहा से फैली.
- यदि संज्ञाहरण प्रयोग किया जाता है, एक 28 गेज के साथ एक 1cc ट्यूबरक्यूलिन सिरिंज x साढ़े एपिनेफ्रीन (1:100,000) के साथ 0.25 एमएल lidocaine (2%) युक्त सुई धीरे जीभ के पूर्वकाल भाग के पृष्ठीय सतह के नीचे सिर्फ एक साइट में इंजेक्शन . संज्ञाहरण के साइट संग्रह साइट के बाद पढ़ाई के साथ lidocaine के द्वारा हस्तक्षेप से बचने के बाहर का है. तुलना के लिए, lidocaine की राशि इंजेक्शन (0.25 एमएल) के बारे में सामान्य रूप से दंत चिकित्सा प्रक्रियाओं में तंत्रिका ब्लॉक (0.8 एमएल 1 एमएल) के लिए दी गई राशि का एक चौथाई है. सुई की प्रविष्टि के बाद, लेकिन पहले चतनाशून्य करनेवाली औषधि के इंजेक्शन, आकांक्षा सुनिश्चित करता है कि कोई रक्त वाहिका मारा है. इस एहतियात लिया जाता है भले ही यह anatomically संभावना नहीं है कि एक बड़े पोत पृष्ठीय सतह के पास मारा जाएगा है. पृष्ठीय सतह पर केवल धमनियों, पृष्ठीय बहुभाषी धमनियों छोटे रक्त वाहिकाओं मुख्य रूप से अधिक पूर्वकाल तीसरे, जहां ऊतक कटाई होती है पीछे स्थित हैं. बड़ा बहुभाषी धमनियों और बहुभाषी नसों जीभ के ventral सतह पर चलने तक पृष्ठीय 3 संवेदनाहारी प्राप्त क्षेत्र से हटा दिया . 1 सेमी anesthetized क्षेत्र के आसपास के ऊतक के साथ तुलना में थोड़ा पीला होता है. यह ऊतक की सूजन के रूप में यह छोटे से रक्त वाहिकाओं compresses की वजह से है. यह भी एपिनेफ्रीन के vasoconstrictive प्रभाव के कारण है. के बारे में एक मिनट के बाद, एक जांच अकड़ना के लिए इस क्षेत्र परीक्षण के लिए प्रयोग किया जाता है. यदि क्षेत्र में सुन्न नहीं है, एक दूसरे इंजेक्शन (0.1 से 0.2 एमएल) दी जा सकती है.
3. भाषा Papillae निकालना तकनीक
- विषय की जीभ के पूर्वकाल तिमाही बाँझ धुंध में लिपटे है (चित्रा 1) और सर्जन के बाएं हाथ की में आयोजित दहिने हाथ के साथ बायोप्सी प्रदर्शन अगर (). धुंध के एक कोने सर्जन लार के मुक्त जीभ मिटा करने की अनुमति के लिए खुला छोड़ दिया है. जीभ दृढ़ता से आयोजित किया जाना चाहिए है, लेकिन, जाहिर है, नहीं तो के रूप में अनावश्यक परेशानी का कारण. बाएं हाथ की तर्जनी के टिप साइट है जहाँ बायोप्सी प्रदर्शन किया है के तहत सीधे जीभ के नीचे तैनात है. सूचकांक उंगली ऊपर की ओर धक्का, जीभ papillae आसान बायोप्सी के लिए बाहर रहना उंगली की नोक पर फैला हो जाता है.
- बायोप्सी के लिए papillae को चुनने के लिए मानदंड: स्वाद papillae आसपास filliform papillae से उनके आकार और आकार के द्वारा आसानी से अलग पहचाना हैं. Fungiform papillae दौर और आसपास से कुछ अलग हैं. उनके तत्काल आसपास के क्षेत्र में एक परिपत्र filliform papillae (चित्रा 2A, नीले तीर) से रहित अंतरिक्ष है. इस अंतरिक्ष व्यास में 1 मिमी के बारे में है. Fungiform papillae का एक अन्य विशिष्ठ सुविधा एक विस्तारित केशिका arborization सबसे युवा विषयों की fungiform papillae के शीर्ष पर दिखाई है. हालांकि arborization पता लगाने fungiform papillae आसान बनाता है, वे कि papilla में स्वाद के अस्तित्व का अच्छा predictors जरूरी नहीं कर रहे हैं. एक नियम के रूप में सामने के छोर की ओर कटाई शुरू होता है और आगे जीभ की नोक से दूर ले जाता है अगले ऊतक संग्रह के साइट obscuring से किसी भी केशिका खून बह रहा से बचने.
- एक बार एक अच्छा papilla पहचान लिया गया है, एक वसंत सूक्ष्म कैंची (McPherson Vannas, घुमावदार, तेज अत्याधुनिक 5 मिमी, कंघी, टिप चौड़ाई 0.2 मिमी समग्र लंबाई 3 "(5603 रुपये, Roboz) इसे क्लिप बंद किया जाता है. एक काटने के लिए प्रभावी ढंग से सूक्ष्म शल्य कैंची का उपयोग करें ब्लेड की टिप नहीं इस्तेमाल करना चाहिए, संभव के रूप में, बल्कि के रूप में ब्लेड अंदर तक (चित्रा 1, बढ़े हुए छवि और चित्रा 3), चौराहे के बिंदु के करीब विपरीत ब्लेड के साथ. papilla का हटाया जाना एक कैंची के काटने चाल (चित्रा 1) के साथ हासिल की है आगे खुला ब्लेड लक्षित papilla प्रकट होता है अंदर, और अधिक प्रभावी काट रहा है.. ध्यान रखा जाना चाहिए कि कैंची की समग्र स्थिति समानांतर होना चाहिए जीभ की पृष्ठीय सतह के साथ.
- कभी कभी जीभ शुष्क के रूप में सर्जन को हटाने के लिए एक papilla की पहचान करने की कोशिश कर रहा है हो जाता है. एक बार सूखा, ऑपरेटर की क्षमता को स्पष्ट रूप से देखने के लिए जो एक fungiform papilla है और अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाता है और बहुत मुश्किल papilla से अधिक ब्लेड के फिसलने करता है. एक पीढ़ी सूखी जीभ आम तौर पर नाजुक शल्य चाल कम नियंत्रणीय बनाने जीभ धातु ब्लेड छड़ी बनाता है. विषय उसकी / उसके मुँह बंद और जीभ की सतह के साथ संपर्क में आते लार दे प्रक्रिया में मदद करता है. पीढ़ी गीली जीभ भी अच्छा नहीं है. धुंध है कि एक का उपयोग करता है जीभ पकड़ के कोने का उपयोग करना इस प्रक्रिया में मदद करता है.
- कोई केशिका खून बह रहा है कि होती है बाँझ धुंध के साथ सोख्ता द्वारा इलाज किया जाता है. आमतौर पर खून बह रहा एक कुछ मिनट के भीतर बंद हो जाता है utes और अतिरिक्त ऊतक कटाई के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. क्योंकि papillae जीभ के उपकला सतह से ऊपर का विस्तार, और केवल ऊपरी fungiform papilla के 3 / 4 (चित्रा 2B) निकाल दिया जाता है, स्वाद दिखाने fungiform का वह हिस्सा, थोड़ा खून बह रहा है उम्मीद है.
- एक छोटे Dumont संदंश (पैटर्न प्रकार) का उपयोग करना, हटा papillae ठंडा बुनियादी घंटी बफर में रखा जाता है (130 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 CaCl, 1 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी ना - पाइरूवेट, 20 मिमी HEPES - ना , 7.2 पीएच, बाद जोड़तोड़ के लिए ~ 305 milli osmols osmolality). यह आवश्यक है एक संदंश के ब्लेड के बीच papilla कभी चुटकी. ऊतक बहुत नाजुक है और चरम देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए.
- Papillae को हटाने के बाद, दस से पंद्रह मिनट के लिए कुर्सी में विषय बनी हुई है. प्रत्येक विषय उनके anesthetized जीभ पर काट नहीं है, लेकिन बाकी पर अपनी जीभ रख करने के लिए कहा है. विषय नेत्रहीन में भाग लेने के सर्जन के द्वारा निगरानी की जानी चाहिए. संज्ञाहरण के लिए लगभग 30-60 मिनट में बंद पहनने की उम्मीद है. क्योंकि papillae हटाने की साइट थोड़ा गले बायोप्सी के बाद हो सकता है, वे मसालेदार या गर्म भोजन (तापमान), कार्बोनेटेड पेय या पेय है कि या तो बहुत ठंडा या गर्म कर रहे हैं के बारे में पता होना के निर्देश दिए हैं. विषयों के लिए एक और संकेत दिया है कि लार के किसी भी मामूली लाल रंगाई सामान्य है और थक्का के विघटन पर संघर्ष करेंगे.
- विषय 30-40 दिनों जहां papillae हटा दिया गया साइट के मूल्यांकन के लिए papillae को हटाने के बाद देखा जाता है. इस समय स्वाद papillae पूरी तरह से पुनर्जीवित करना चाहिए.
5. प्रतिनिधि परिणाम
स्वस्थानी संकरण, कैल्शियम इमेजिंग, पैच clamping और टिशू कल्चर में एकत्र ऊतक immunohistochemistry, RT-पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जब सही ढंग से प्रदर्शन papillae की उपस्थिति स्वस्थ देख रहे हैं, 0.5-1 व्यास में मिमी (चित्रा 2B) के बारे में सफेद,.
Immunohistochemistry के लिए एकत्र Papillae मौजूदा और प्रकाशित प्रोटोकॉल 4 के आधार पर संसाधित कर रहे हैं. Paraformaldehide तय स्वाद papilla से एक विशिष्ट स्वाद कली चित्रा -4 ए में दिखाया गया है.
Biopsied papillae भी enzymatically 5 कर सकते हैं इलाज किया जा स्वाद कली कोशिकाओं की हदबंदी को प्राप्त करने. Enzymatic पृथक्करण के बाद, कोशिकाओं के लिए बनाए रखा जा सकता है 4C पर एक humidified पेट्री डिश में 4 घंटे के लिए. इस स्थिति में वे एकल कोशिका पीसीआर (4B चित्रा), CA इमेजिंग, आदि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है
कक्ष आकार की एक किस्म, कई पतला और द्विध्रुवी (चित्रा 5A और 5B) किया जा रहा है के रूप में एक स्वाद कली सेल की उम्मीद करेंगे. जब कोशिकाओं को इकट्ठा या Ca - इमेजिंग प्रदर्शन, एक खुर्दबीन के नीचे के बारे में 20 मिनट के बाद, कोशिकाओं को apoptotic blebs (चित्रा 6A और 6B, तीर) और उनमें से कई दौर हो जाते हैं विकसित करने के लिए शुरू. हमारी प्रयोगशाला में विकसित तकनीक का प्रयोग, कोशिकाओं को उठाया गया था व्यक्तिगत रूप से एक पैच विंदुक का उपयोग, के रूप में चित्रा 5A और 5B में दिखाया गया है.
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया, papillae 5 से 8 सप्ताह के बाद regrow शुरू. चित्रा 7A जीभ जहां 8 fungiform papillae बाईं ओर से एक स्वयंसेवक की जीभ हटा दिया गया कोई संज्ञाहरण का उपयोग की उपस्थिति को दर्शाता है. सूचना 8 मामूली लाल धब्बे, जहां papillae बंद snipped थे. कोई खून बह रहा है सर्जरी के बाद मनाया जाता है. वर्तमान छवि बायोप्सी के बाद 10 मिनट लिया गया था. चित्रा 7B ही बायोप्सी के बाद 40 दिनों देखा विषय की जीभ की एक छवि है. सूचना सभी papillae regrown है. यह निर्धारित करने के लिए अगर पुनर्जीवित papillae कार्य कर रहे हैं हम हमारे स्वयंसेवक से पूछा सटीक एक ही papillae शामिल एक दूसरे बायोप्सी के लिए सहमत. सही ढंग से उपयुक्त papillae हम फिर से फसल की योजना बना रहे थे की पहचान करने के लिए, हम (7C चित्रा) ग्रिड है कि 8 papillae है कि पहली जगह में हटा दिया गया और वही स्वयंसेवक की जीभ पर यह 40 दिनों के प्रारंभिक बायोप्सी पोस्ट के बाद आरोपित फिट बैठता उत्पन्न . समोच्च और जीभ के मार्जिन से ग्रिड के लिए दूरी के द्वारा सहायता प्राप्त, एक बार की पहचान की है, हम एक ही सटीक papillae कुछ को हटा दिया है और उन्हें immunohistochemistry के लिए संसाधित. चित्रा 4A इन papillae है. सूचना स्वाद कली (पीले रंग में) और Phospholipase (PLCβ2) Cβ2, एक प्रकार 2 स्वाद सेल transduction जुड़े एंजाइम के लिए immunopositive धुंधला की रूपरेखा. इन आंकड़ों का प्रदर्शन बायोप्सी प्रक्रिया का उपयोग कर के रूप में इस के साथ साथ वर्णित है कि fungiform papillae 40 दिनों से पर्याप्त पुनर्जीवित करने के लिए संभावना कार्यात्मक स्वाद जगह में भी है.
चित्रा 1. विषय की जीभ के पूर्वकाल तिमाही बाँझ धुंध में लिपटे है और सर्जन के बाएं हाथ की में आयोजित की. भाषा मजबूती से आयोजित किया जाना चाहिए. दाईं तरफ बढ़े हुए छवि कैंची और ब्लेड के संबंध में papilla की स्थिति की उचित स्थिति से पता चलता है.
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चित्रा 2. (ए) Fungiform papillae नीले तीर के साथ दिखाया जाता है. ये दौर कुछ उसके आसपास और उनके तत्काल आसपास के क्षेत्र में एक परिपत्र filliform papillae रहित अंतरिक्ष से अलग संरचनाओं हैं. (बी) वसंत की नोक पर Fungiform स्वाद papilla सूक्ष्म कैंची सेकंड बाद इसे हटा दिया गया है.
चित्रा 3. स्वयं एक fungiform एक दर्पण है और कोई संज्ञाहरण का उपयोग papilla के बायोप्सी. इनसेट कैंची की समग्र स्थिति, जो जीभ की पृष्ठीय सतह के साथ समानांतर होना चाहिए दिखाता है. अगर ठीक से और atraumatically किया, संज्ञाहरण के लगभग सभी स्वयंसेवकों द्वारा forgone है.
4 ए चित्रा स्वाद कली के immunohistochemistry. एक fungiform papilla Nomarski एंटीबॉडी का उपयोग प्रकाशिकी द्वारा Phospholipase β2 कल्पना और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग. स्वाद कली और कुछ लेबल स्वाद कोशिकाओं की रूपरेखा पीले रंग में दिखाया जाता है. 
बी एक उम्मीदवार खट्टे स्वाद रिसेप्टर के RT-पीसीआर, एसिड सेंसिंग आयन चैनल 1 (ASIC1). एम = मार्कर. 1 से 4 लेन ASIC1 RT-पीसीआर के लिए एक चार अलग अलग स्वयंसेवकों से सेल थे. संग्रह के बाद, fungiform papillae enzymatically अलग थे, कोशिकाओं व्यक्तिगत उठाया और ASIC1 की अभिव्यक्ति कर रहे थे. 2 और 4 लेन ASIC1 की सामान्य अभिव्यक्ति थी.
चित्रा 5. एकल स्वाद जा रहा है कोशिकाओं की ए छवि उठाया एक पैच पिपेट का उपयोग. एक बड़े उपकला सेल निचले बाएँ कोने (5A) में दिखाई देता है. दो लाल रक्त कोशिकाओं को भी पैच विंदुक ऊपर और कांच बैरल के पीछे दिखाई दे रहे हैं. स्वाद लगभग 30-50 माइक्रोन लंबे और के बारे में 6 माइक्रोन चौड़े सेल है. संदर्भ के लिए, एक लाल रक्त कोशिका व्यास में 7-8 microns के बारे में है. बी चार उपकला कोशिकाओं से घिरा हुआ एक और स्वाद रिसेप्टर सेल से पता चलता है. स्वाद सेल कुरकुरा लग रहा है.
चित्रा 6. कोशिकाओं है कि apoptotic blebs (दौर स्वाद सेल, तीर से जुड़ी blebs तरह भूत) विकसित करने के लिए शुरू की ए छवियाँ. बी कक्ष नहीं रह गया जब उनकी उपस्थिति में परिवर्तन के रूप में यहाँ दिखाया harvested रहे हैं.
7 चित्रा. कोई संज्ञाहरण का उपयोग 8 स्वाद papillae के हटाने के बाद दस मिनट. शल्य साइटों को थोड़ा लाल धब्बे के रूप में दिखाई दे रहे हैं. कोई खून बह रहा देखा है.
बायोप्सी के बाद 40 दिनों एक ही जीभ बी. सूचना सभी papillae पुनर्जीवित. Regrown के रूप में हटा दिया papillae की पहचान में मदद करने के लिए, एक ग्रिड साइट के साथ दाईं ओर चित्र पर बनाया गया था और बाईं ओर छवि पर पुनर्जीवित papillae पर स्थानांतरित कर दिया.
सी. पुनर्जीवित papillae सटीक एक ही स्थान में दिखाई दिया. Papillae फिर फसल काटने वाले यह दिखा दिया कि पुनर्जीवित papillae कार्यात्मक स्वाद कोशिकाओं निहित (4A चित्रा देखें) immunohistochemistry द्वारा पीछा समूह से.
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Discussion
एक करने के लिए मानव कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए उल्लेखनीय लाभ उनकी विशिष्टता है. विस्तार में यहाँ वर्णित की प्रक्रिया मनुष्यों से स्वाद रिसेप्टर कोशिकाओं के अलगाव के लिए जीभ ऊतक प्रदान करता है. ये स्वाद कोशिकाओं के अध्ययन के लिए आणविक इस्तेमाल किया जा सकता है, स्वाद जानकारी के पारगमन के लिए महत्वपूर्ण अणुओं की खोज की मांग है, और कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन कि stimuli करने के लिए स्वाद सेल गतिविधि पर नजर रखने के लिए. इसके अतिरिक्त, इस प्रक्रिया द्वारा प्रदान की जीभ ऊतक immunohistochemistry रूप में स्वस्थानी संकरण में विभिन्न तकनीकों के साथ विश्लेषण किया जा सकता है है, और जैसे पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) रीयल टाइम मात्रात्मक सिंगल सेल पीसीआर सहित, आणविक प्रक्रियाओं के लिए व्यक्ति की कोशिकाओं पर कब्जा करने की अनुमति देता है. क्योंकि इस प्रक्रिया व्यक्तियों भावना स्वाद की जिसका psychophysically बायोप्सी पूर्व मूल्याँकन कर पर किया जा सकता है है, यह आणविक स्वाद असामान्यताएं (उदाहरण के लिए, Huque एट अल देखने के 2009.) के लिए जिम्मेदार विवरण की एक स्पष्ट चित्र प्राप्त करने के लिए संभव है. यह बायोप्सी प्रक्रिया की अनुमति देता है एक व्यवहार्य और metabolically बरकरार एकल कक्ष स्वाद से कोशिकाओं में समृद्ध तैयारी के उत्पादन और इस तरह इन कोशिकाओं पर पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने की क्षमता है. इस तकनीक का उपयोग करना, भविष्य के अध्ययन केवल स्वाद के पारगमन की हमारी समझ में वृद्धि नहीं आदमी के लिए अद्वितीय प्रक्रियाओं लेकिन यह भी समझने आणविक बीमारी या दवा प्रेरित राज्यों और इन असामान्यताओं का इलाज regimens विकसित में स्वाद असामान्यताएं अंतर्निहित तंत्र हो सकता है.
अंत में, हमारी टिप्पणियों के परिणामों को दृढ़ता से संकेत मिलता है कि "छेद की उपस्थिति," अक्सर fungiform papillae करीब arborizations पर उल्लेख किया और आम तौर पर स्वाद कली है pores माना जाता है, वास्तव में, स्वाद के अस्तित्व का अच्छा predictors नहीं बस इन छेद की प्रकृति क्या है, या क्या वे कार्यों प्रदर्शन कर सकते हैं, हम नहीं जानते.
8 वर्षों में के बाद से हम इस प्रक्रिया को शुरू कर दिया है, हम बार बार 4000 स्वाद papillae पर कई दर्जन स्वयंसेवकों से एकत्र किया है. दो प्रतिकूल घटनाओं, दोनों स्थानीय संज्ञाहरण के साथ जुड़े जीभ का एक अस्थायी सूजन का नेतृत्व किया, लेकिन प्रतिकूल प्रभाव के बिना अगले 48 घंटे के भीतर हल. अगर ठीक से किया है, बाँझ और atraumatic शर्तों के तहत, इस विधि सुरक्षित और प्रभावी है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम एनआईएच DC03969 01-R21 (JGB के लिए) द्वारा समर्थित किया गया. हम चित्रा 4B और श्री डी. Bayley और सुश्री एस Alarcon में दिखाया तकनीकी सहायता के लिए RT-पीसीआर के प्रदर्शन के लिए एक स्वाद कली कोशिकाओं, डा. Tauf Huque पर कब्जा करने के लिए डा. फ्रिट्ज Lischka धन्यवाद. एम. Yanina Pepino एक साथी NIDAT32 DA07313 चिकित्सा के वाशिंगटन विश्वविद्यालय के स्कूल, सेंट लुइस, MO (Cottler, पौंड पीआई) द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McPherson-Vannas. Curved, sharp cutting edge 5mm. Comb, tip width 0.2 mm overall length 3" | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5603, Roboz | |
| Small Dumont forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4915, Roboz |
References
- Breslin, P. A., Spector, A. C.
- Miller, I. Anatomy of the peripheral taste system. Handbook of Olfaction and Gustation. Doty, R. I., Dekker, M. , Marcel Dekker. New York. 521-547 (1995).
- Figure 12.67. Gray's Anatomy: The Anatomical Basis of Medicine and Surgery. , 38th Edition, Churchill Livingstone. New York. (1995).
- Huque, T., Cowart, B. J., Dankulich-Nagrudny, L., Pribitkin, E. A., Bayley, D. L., Spielman, A., Feldman, I., S, R., Mackler, Sour ageusia in two individuals implicates ion channels of the ASIC and PKD families in human sour taste perception at the anterior tongue. PLoS One. 4 (10), e7347-e7347 (2009).
- MacDonald, J. F., Mody, I., Salter, M. W., Spielman, A. I.
