Summary
Conhecimento dos mecanismos moleculares subjacentes a transdução de gustativa tem apreciado recentemente avanços significativos, em grande parte devido ao uso de modelos animais. No entanto, a grande diversidade na sensibilidade gustativa e especificidade entre os estudos mamíferos garante no tecido humano. Descrevemos uma técnica de biópsia para coletar células gosto vivos de papilas na língua humana.
Abstract
O sentido do paladar é fundamental para a vida humana. Ele informa o corpo sobre a qualidade dos alimentos que serão ingeridos potencialmente e estimula os processos metabólicos que preparam o tubo digestivo para a digestão. Constante progresso está sendo feito para a compreensão dos eventos bioquímicos e moleculares iniciais subjacentes transdução gosto (para uma revisão, Breslin e Spector, 2008 1). No entanto, o progresso até agora resultou em grande parte a partir de modelos animais. No entanto, uma vez que diferenças marcantes na especificidade do receptor e densidade do receptor variam entre as espécies, a transdução gosto humano só vai ser entendido usando tecido gosto humano. Aqui nós descrevemos uma técnica de biópsia para coletar humana papilas fungiformes, visíveis como estruturas arredondadas rosa anterior, cerca de 0,5 mm de diâmetro que contêm as papilas gustativas. Estas papilas biópsia são usadas para vários fins, incluindo o isolamento de células viáveis bud gosto, hibridização in situ imuno-histoquímica, e, através de técnicas de biologia molecular, a identificação de proteínas específicas do gosto da novela.
Protocol
1. Introdução e Considerações Gerais
O procedimento geral envolve anestesia local de uma área (1 cm 2) pequena da superfície dorsal da língua anterior, seguida da remoção de um número (6-8) de fungiformes (gosto) papilas dessa área anestesiados com uma curva da mola micro -tesoura (McPherson-Vannas tipo # SR 5603, Roboz, Rockville, MD). A retirada fungiformes papilas são de aproximadamente 0,25 mm 3 cada. Há muito pouco não papilas de tecido (gosto) epitelial removida juntamente com cada papila. Forma papilas novo nesta área após 3-5 semanas e recuperar o funcionamento papilas gustativas (Spielman e Brand, observações não publicadas). Não há efeito perceptível no sabor ou sabor dos alimentos após a remoção desta pequena quantidade de material gosto. A partir de estudos que têm contado cada paladar na língua humano adulto, pode-se estimar que a língua humana contém aproximadamente 5.000 papilas gustativas. Nosso procedimento remove a maioria de 20 a 25 deste papilas gustativas (em média, ~ 3,5-4 papilas gustativas fungiformes por papila em humanos) 2, ou cerca de 0,4% do total. Além disso não há nenhuma dor associada com a perda cirúrgica do tecido. Sente-se, é claro, dor leve no local da injeção única, como a agulha entra na língua. Após a anestesia desgastou fora, há um desconforto leve, ocasionalmente, há menos de um dia, mas este desconforto é muito menos do que aquilo que se experimenta depois de acidentalmente "morder" língua queridos.
Ao longo dos últimos anos temos desenvolvido um procedimento alternativo que não inclui anestesia. A técnica para a remoção do tecido é idêntico para ambos. A única diferença no processo é que o cirurgião não está mais confinado a uma área de 1 cm de diâmetro 2, onde a anestesia foi abordada. Vez que ele / ela pode escolher qualquer local na superfície dorsal da língua, onde papilas proeminentes aparecer. O número total de papilas removidos são limitados a 6-8 em ambas as técnicas, com ou sem anestesia Se realizada corretamente, o desconforto da remoção de 6-8 papilas fungiformes gosto é considerado um problema menor quando comparada com a dor associada com a administração de A anestesia local levantamento geral dos indivíduos que foram submetidos a ambos os procedimentos, isto é, com e sem anestesia, mostraram que uma esmagadora maioria de assuntos dispensaria sem anestesia local em todas as biópsias futuro. O cirurgião que desenvolveu esta técnica (AIS) e vários colegas ensinado pelo autor que realizou biópsias sem anestesia, testei-o em si mesmos e testemunhar que o desconforto é temporário e é considerado menor do que a língua é uma mordida. Por fim, dezenas de pessoas que concordaram em ser biopsiadas foram perguntados se estariam dispostos a tentar a remoção de uma papila sem anestesia e, se julgar que ela é muito doloroso a ser realizada a anestesia, concordaram em continuar com a remoção das papilas sem anestesia.
A biópsia todo não deve demorar mais do que 5-10 minutos. Se a anestesia é empregada mais 2-3 minutos é adicionado. Biópsia é normalmente realizado nas primeiras horas da manhã. Antes da biópsia, os voluntários são instruídos a comer uma refeição leve duas horas antes da hora de início agendada. Na biópsia, consentimento informado é obtido. Os critérios de exclusão no momento da biópsia incluem aqueles com doenças crônicas graves, se controlada por medicação ou não (por exemplo, todas as doenças gastrointestinais, doenças neurodegenerativas, câncer, discrasias sangüíneas, alergia aos anestésicos locais, etc) aqueles com freqüência cardíaca acima de 100 ou menos de 60; pressão arterial sistólica maior que 145 ou menos de 100, pressão arterial diastólica superior a 90 ou inferior a 60, eo parecer do cirurgião que o sujeito pode participar do estudo.
Finalmente, é importante considerar que o procedimento de biópsia deve ser realizada no mesmo local onde o tecido será processado para exame desde integridade do tecido é rapidamente perdido como temos freqüentemente observado pelo declínio da qualidade de mRNA. Para minimizar estes problemas o tecido língua deve ser processada o mais rápido possível.
2. Preparação assunto
- O assunto está sentado em uma cadeira de dentista ou um assento com encosto de cabeça.
- Verificação da freqüência cardíaca e pressão arterial no momento da biópsia. Caso a queda assunto fora da faixa de pressão arterial, freqüência cardíaca ou competência oral, o cirurgião recomenda ao assunto que ele / ela fazer nomeação imediata de ver um médico.
- Inspecionar a cavidade bucal para a saúde dos tecidos em geral, com atenção aos indicadores de xerostomia, língua geográfica ou quaisquer lesões na língua. Qualquer assunto mostrando sinais de doença oral, incluindo lesões na língua ou xerostomia estão excluídos do estudo. Instruir o assunto para enxaguar a boca com água para remover todos os detritos do Cavit oraisy. Se necessário, a língua é limpo com um scrapper língua descartável para remover a placa bacteriana ou detritos, o que poderia ser feita para a língua durante a injeção da anestesia. O cirurgião utiliza compressas de gaze estéril em uma mão enluvada para manter a ¼ anterior da língua, uma vez que se estende desde a cavidade oral.
- Se a anestesia for utilizada, uma seringa de tuberculina 1cc com um calibre 28 x ½ agulha 'contendo 0,25 mL de lidocaína (2%) com adrenalina (1:100.000) é injectada lentamente em um site logo abaixo da superfície dorsal da porção anterior da língua . O site de anestesia é distal ao local de coleta para evitar a interferência da lidocaína com estudos posteriores. Para efeito de comparação, a quantidade de lidocaína injetada (0,25 mL) é de cerca de um quarto do valor normalmente dada para o bloqueio do nervo em procedimentos odontológicos (0,8 mL a 1 mL). Após a inserção da agulha, mas antes da injeção do anestésico, aspiração garante que nenhum vaso sanguíneo é atingido. Essa precaução é tomada mesmo que seja anatomicamente improvável que um grande navio será atingido perto da superfície dorsal. As artérias somente na superfície dorsal, as artérias lingual dorsal são pequenos vasos sanguíneos localizados principalmente mais posterior ao terço anterior, onde a colheita ocorre de tecido. As artérias maiores lingual e as veias linguais executado na superfície ventral da língua, muito distante da região dorsal recebendo anestesia 3. A área de 1 cm anestesiados parece ser um pouco pálido em comparação com o tecido circundante. Isto é devido ao inchaço do tecido, uma vez que comprime os vasos sanguíneos pequenos. É também devido ao efeito vasoconstritor da adrenalina. Após cerca de um minuto, uma sonda é usada para testar a área de dormência. Se a área não é insensível, uma segunda injeção (0,1 a 0,2 mL) pode ser dada.
3. Técnica de Remoção de língua Papilas
- O trimestre anterior da língua do assunto está envolto em gaze estéril (Figura 1) e segurou na mão esquerda do cirurgião (se realizar a biópsia com a mão direita). Um canto da gaze é deixada aberta para permitir que o cirurgião para limpar a língua sem saliva. A língua deve ser realizada com firmeza, mas, é claro, não de modo a causar desconforto desnecessário. A ponta do dedo indicador da mão esquerda é colocado sob a língua diretamente sob o local onde a biópsia é realizada. Pressionando o dedo indicador para cima, a língua torna-se esticado sobre a ponta do dedo fazendo as papilas pau para fora para biópsia fácil.
- Critérios para a escolha papilas para biópsia: Taste papilas são facilmente distinguíveis da envolvente filliform papilas pela sua forma e tamanho. Fungiformes papilas são redondos e um pouco isolada da envolvente. Em suas imediações há um espaço circular desprovida de filliform papilas (Figura 2A, setas azuis). Este espaço é cerca de 1 mm de diâmetro. Outra característica distintiva das papilas fungiformes é uma arborização estendida capilar visível no topo da maioria das papilas fungiformes de indivíduos jovens. Apesar de arborização torna mais fácil localizar papilas fungiformes, eles não são necessariamente bons indicadores da existência de papilas gustativas em que papila. Como uma regra começa a colheita em direção à extremidade dianteira e movimenta mais longe da ponta da língua para evitar qualquer sangramento capilar de obscurecer o site da coleção de tecidos próximos.
- Uma vez que uma boa papila foi identificado, uma mola de micro-tesoura (McPherson-Vannas, curvado, de ponta afiada 5 mm, pente, largura da ponta 0,2 mm de comprimento total de 3 "(RS-5603, Roboz) é usado para prendê-lo fora. Para efetivamente usar a tesoura cirúrgica micro não se deve usar a ponta da lâmina para o corte, mas sim, na medida dentro da lâmina quanto possível (Figura 1, imagem ampliada e Figura 3), perto do ponto de intersecção com a lâmina oposto. remoção da papila é conseguido com um movimento de corte da tesoura (Figura 1). Quanto mais dentro das lâminas abrir a papila alvo aparecer, o mais eficaz é o de corte. Cuidados devem ser tomados para que a posição global da tesoura deve ser paralelo com a superfície dorsal da língua.
- Às vezes a língua torna-se seca como o cirurgião está tentando identificar um papilla para remoção. Depois de seco, a capacidade do operador para ver claramente que é uma papila fungiforme se torna mais desafiadora e faz deslizar das lâminas sobre a papila muito difícil. Uma língua excessivamente seco normalmente faz a vara lâmina metálica para a língua fazendo o movimento delicado cirúrgica menos controláveis. Deixar o assunto perto dele / a boca e ter saliva entrar em contato com a superfície da língua ajuda o processo. Excessivamente língua molhada não é bom. Usando o canto da gaze que se usa para manter a língua ajuda neste processo.
- Qualquer sangramento capilar que ocorre é tratada por blotting com gaze estéril. Sangramento geralmente pára dentro de um min poucos utes e não interfere com a colheita de tecidos adicionais. Porque as papilas estendem acima da superfície do epitélio da língua, e apenas a parte superior 3 / 4 de uma papila fungiforme é removido (Figura 2B), que parte do fungiformes mostrando papilas gustativas, pequeno sangramento é esperado.
- Usando um pequeno fórceps Dumont (tipo padrão), as papilas removidos são colocados em tampão Ringer refrigerados básica (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na Piruvato, 20 mM HEPES-Na , pH 7,2; osmolalidade de aproximadamente 305 osmols milli) para as manipulações subsequentes. É imperativo NUNCA pitada da papila entre as lâminas de uma pinça. O tecido é muito frágil e deve ser tratada com extremo cuidado.
- Após a remoção das papilas, o assunto permanece na cadeira por 10-15 minutos. Cada indivíduo é dito para não morder a língua anestesiada, mas para manter sua língua em repouso. Assuntos devem ser visualmente monitorado pelo cirurgião responsável. A anestesia é esperada a se desgastar em cerca de 30-60 minutos. Porque o site da remoção papilas podem ser ligeiramente ferida após a biópsia, eles são instruídos a estar ciente de picantes ou comida quente (temperatura), refrigerantes ou bebidas que são ou extremamente frios ou quentes. Uma outra indicação é dada aos assuntos que qualquer ligeira coloração avermelhada da saliva é normal e deixará após a dissolução do coágulo.
- Assuntos são vistos 30-40 dias após a remoção das papilas para avaliação do local onde as papilas foram removidas. Por isso gosto papilas tempo deveria ter completamente regenerada.
5. Resultados representante
Tecidos coletados podem ser usados para imuno-histoquímica, RT-PCR, hibridização in situ, imagem de cálcio, de fixação de patches e cultura de tecidos. Quando realizada corretamente a aparência das papilas são saudáveis procurando, branco, cerca de 0,5-1 mm de diâmetro (Figura 2B).
Papilas coletados são processados para imuno-histoquímica com base em protocolos já existentes e publicados 4. Um broto sabor típico de uma papila gosto paraformaldehide fixa é mostrado na Figura 4A.
Papilas biópsia também pode ser tratada enzimaticamente 5 a atingir a dissociação das células de gosto. Após a dissociação enzimática, as células podem ser mantidas por até 4 horas em uma placa de Petri umedecida em 4C. Neste estado podem ser usados para uma única célula de PCR (Figura 4B), Ca-imagem, etc
Células mostram uma variedade de formas, muitas sendo delgados e bipolar (Figura 5A e 5B) como seria de esperar de uma célula de gosto. Ao coletar células ou executar Ca-imagem, depois de cerca de 20 minutos sob um microscópio, as células começam a se desenvolver bolhas apoptóticas (Figura 6A e 6B, setas) e muitos deles tornam-se redondas. Usando uma técnica desenvolvida em nosso laboratório, as células foram apanhados individualmente usando um patch pipeta, como mostrado na Figura 5A e 5B.
Como mencionado acima, papilas começam a regredir após 5-8 semanas. Figura 7A mostra a aparência de uma língua onde 8 papilas fungiformes foram retirados do lado esquerdo da língua de um voluntário sem usar anestesia. Aviso n. º 8 ligeira manchas avermelhadas, onde as papilas foram cortou. Sem sangramento é observado após a cirurgia. A imagem atual foi tirada 10 minutos após a biópsia. Figura 7B é uma imagem da língua do mesmo assunto visto 40 dias após a biópsia. Observe todas as papilas têm crescido. Para determinar se as papilas regenerados são funcionais pedimos ao nosso voluntário para concordar com uma segunda biópsia que envolve as papilas exatamente o mesmo. Para identificar corretamente as papilas apropriado estávamos planejando re-colheita, geramos uma grade (Figura 7C) que se encaixa as papilas oito que foram removidos em primeiro lugar e sobrepostos que sobre a língua do voluntário mesmo depois de 40 dias após a biópsia inicial . Ajudado pelo contorno da língua e da distância a partir da margem para a rede, uma vez identificados, foram removidos alguns dos papilas mesma exata e processado-los para imuno-histoquímica. Figura 4A é uma dessas papilas. Observe o esboço de um broto gosto (em amarelo) ea coloração imuno para Fosfolipase Cβ2 (PLCβ2), um tipo de célula gosto 2 transdução associada enzima. Estes dados demonstram que a utilização do procedimento de biópsia, conforme descrito neste documento, as papilas fungiformes regenerar suficientemente em 40 dias para ter também no local provável papilas gustativas funcional.
Figura 1. O trimestre anterior da língua do assunto está envolto em gaze estéril e na mão esquerda do cirurgião. Língua deve ser realizada com firmeza. A imagem ampliada à direita mostra a posição correta da tesoura e da posição da papila em relação à lâmina.
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Figura 2. (A) fungiformes papilas são mostradas com setas azuis. Estes são estruturas arredondadas um pouco isolado do seu entorno e nas suas imediações há um espaço circular desprovida de filliform papilas. (B) papilas fungiformes sabor na ponta da mola micro-tesoura segundos após ter sido removido.
Figura 3. Auto-biópsia de uma papila fungiforme usando um espelho e sem anestesia. A inserção ilustra a posição global da tesoura, que deve ser paralela com a superfície dorsal da língua. Se feito corretamente e atraumaticamente, a anestesia é perdoado por praticamente todos os voluntários.
Figura 4 A. Imuno-histoquímica de um broto gosto. A papila fungiforme visualizado pela óptica Nomarski utilizando anticorpos para Fosfolipase β2 e marcados com proteína fluorescente vermelha. O esboço do broto gosto e algumas células gosto rotulados são mostrados em amarelo. 
B. RT-PCR de um receptor de sabor azedo candidato, ácido Sensoriamento Ion Canal 1 (ASIC1). M = marcador. Pistas de 1 a 4 foram única célula RT-PCR para ASIC1 de quatro voluntários diferentes. Após a coleta, fungiformes papilas foram enzimaticamente dissociada, as células individualmente pegou e expressão de ASIC1 foram feitas. Pistas 2 e 4 tiveram expressão normal de ASIC1.
Figura 5. A. Imagem de células sabor único ser pego usando uma pipeta de patch. A grande célula epitelial é visível no canto inferior esquerdo (5A). Duas células vermelhas do sangue são também visíveis acima da pipeta de patches e atrás do corpo de vidro. A célula gosto é de aproximadamente 30-50 mícrons de comprimento e cerca de 6 mícron de largura. Para referência, um glóbulo vermelho é cerca de 7-8 mícrons de diâmetro. B. mostra uma outra célula receptora gosto cercado por quatro células epiteliais. A célula tem um aspecto nítido sabor.
Figura 6. Imagens A. de células que começou a desenvolver bolhas apoptóticas (fantasma como bolhas rodada anexados à célula gosto, setas). Células B. já não são colhidos quando sua aparência muda conforme mostrado aqui.
Figura 7. A. Dez minutos após a remoção de 8 papilas sabor sem usar anestesia. Os locais cirúrgicos são visíveis como manchas ligeiramente avermelhado. Sem sangramento é notado.
B. A língua mesmo 40 dias após a biópsia. Observe todas as papilas regenerado. Para ajudar a identificar as papilas removido como regrown, uma grade foi criada com o site na figura ao lado direito e deslocou mais de papilas regenerado na imagem do lado esquerdo.
C. As papilas regenerado apareceu no local exato. Colheita papilas novamente a partir deste grupo seguido por imuno-histoquímica demonstrou que as papilas regenerado continha células gosto funcionais (veja a Figura 4A).
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Discussion
Uma vantagem notável a utilização de células humanas é a sua especificidade. O procedimento descrito aqui em detalhes fornece tecido língua para o isolamento de células gosto receptor dos seres humanos. Estas células gosto pode ser usado para estudos moleculares, buscando descobrir moléculas importantes para a transdução de informação, paladar e para os estudos de cálcio imagem que monitoram a atividade das células aos estímulos gosto. Além disso, o tecido língua fornecidas por este procedimento pode ser analisado com técnicas diversas, tais como imunohistoquímica, hibridização in situ, e permite capturar células individuais para procedimentos molecular, tais como Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), incluindo Real Time Quantitative PCR de célula única. Porque este procedimento pode ser realizado em indivíduos cujo sentido do paladar pode ser psicofisicamente avaliados antes da biópsia, é possível obter uma imagem clara dos detalhes moleculares responsáveis por anormalidades do paladar (por exemplo, ver Huque et al. 2009). Este procedimento de biópsia permite a produção de uma preparação de células viáveis e metabolicamente intacta única enriquecida em células de papilas gustativas e, portanto, a capacidade de realizar gravações de patch clamp sobre essas células. Usando esta técnica, estudos futuros poderia não só aumentar a nossa compreensão de transdução gosto processos exclusivos ao homem, mas também os mecanismos moleculares subjacentes a decifrar gosto anormalidades na doença ou medicação induzida por estados e desenvolver esquemas para o tratamento destas anormalidades.
Finalmente, os resultados de nossas observações indicam fortemente que a presença de "buracos", muitas vezes anotado no próximo papilas fungiformes para arborizações e geralmente considerada como poros bud gosto, são, na verdade, não bons indicadores da existência de papilas gustativas. Apenas o que a natureza desses buracos é, ou quais funções eles podem executar, não sabemos.
Em oito anos desde que começamos este procedimento, temos repetidamente coletadas de voluntários de várias dezenas mais de 4000 papilas gustativas. Dois incidência adversos, ambos associados com a anestesia local levou a um inchaço temporário da língua, mas resolvido dentro das próximas 48 horas, sem efeitos adversos. Se feito corretamente, em condições estéreis e atraumática, este método é seguro e eficaz.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH R21 DC03969-01 (para JGB). Agradecemos ao Dr. Fritz Lischka para capturar células sabor único botão, Dr. Tauf Huque para a realização do RT-PCR mostrado na Figura 4B e D. Sr. Bayley e S. Ms. Alarcon para assistência técnica. M. Yanina Pepino é um companheiro apoiado por uma DA07313 NIDAT32 Washington University School of Medicine, St. Louis, MO (Cottler, LB PI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McPherson-Vannas. Curved, sharp cutting edge 5mm. Comb, tip width 0.2 mm overall length 3" | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5603, Roboz | |
| Small Dumont forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4915, Roboz |
References
- Breslin, P. A., Spector, A. C.
- Miller, I. Anatomy of the peripheral taste system. Handbook of Olfaction and Gustation. Doty, R. I., Dekker, M. , Marcel Dekker. New York. 521-547 (1995).
- Figure 12.67. Gray's Anatomy: The Anatomical Basis of Medicine and Surgery. , 38th Edition, Churchill Livingstone. New York. (1995).
- Huque, T., Cowart, B. J., Dankulich-Nagrudny, L., Pribitkin, E. A., Bayley, D. L., Spielman, A., Feldman, I., S, R., Mackler, Sour ageusia in two individuals implicates ion channels of the ASIC and PKD families in human sour taste perception at the anterior tongue. PLoS One. 4 (10), e7347-e7347 (2009).
- MacDonald, J. F., Mody, I., Salter, M. W., Spielman, A. I.
