Summary
Знание молекулярных механизмов, лежащих вкусовой трансдукции в последнее время пользуются значительные успехи, в значительной степени в связи с использованием животных моделей. Тем не менее, широкое разнообразие по чувствительности и специфичности вкуса у млекопитающих ордера исследования в тканях человека. Мы опишем метод биопсии собирать живые клетки вкус от сосочков на человеческом языке.
Abstract
Чувство вкуса имеет решающее значение для жизни человека. Он информирует орган о качестве продуктов питания, которые будут потенциально внутрь и стимулирует обменные процессы, которые готовят желудочно-кишечного тракта для переваривания пищи. Устойчивый прогресс на пути к пониманию ранних биохимических и молекулярных событий, основной вкус трансдукции (для обзора, Бреслин и Спектор, 2008 1). Однако прогресс на сегодняшний день в значительной степени результатом животных моделях. Тем не менее, поскольку заметные различия в специфичности рецептора и плотность рецепторов отличаться для разных видов человеческой трансдукции вкус быть поняты только с помощью ткани человека вкус. Здесь мы опишем технику биопсии для сбора человека fungiform сосочков, видны как округлые розовые передних структурах, около 0,5 мм в диаметре, которые содержат вкусовые рецепторы. Эти биопсию сосочков используются для нескольких целей, включая изоляцию жизнеспособных клеток почки вкус, на месте гибридизация, иммуногистохимии, а через методы молекулярной биологии, выявление вкусо-специфических белков романа.
Protocol
1. Введение и общие соображения
Общая процедура включает в себя местную анестезию небольшой (1 см 2) области дорсальной поверхности передней языке, с последующим удалением числа (6-8) из fungiform (вкус) сосочки от наркоза области с помощью изогнутого весной микро -ножницы (McPherson-Vannas типа # SR 5603, Roboz, Роквилл, штат Мэриленд). Удалена fungiform сосочки около 0,25 мм 3 каждый. Существует очень мало, не сосочками (вкус) эпителиальные ткани удаляется вместе с каждым сосочка. Новая форма сосочков в этой области после 3-х до 5 недель и восстановить функционирование вкусовые рецепторы (Шпильман и Бранд, неопубликованные данные). Существует не оказывает заметного влияния на вкус и аромат пищи после удаления этого небольшого количества вкус материала. Из исследований, в которых учитываются отдельные вкусовые рецепторы во взрослом человеческом языке, то можно предположить, что человеческий язык содержит около 5000 вкусовых рецепторов. Наша процедура удаляет не более 20 по 25 из этих вкусовых рецепторов (в среднем ~ 3,5 до 4 вкусовые рецепторы на fungiform сосочка в человеческом) 2, или около 0,4% от общей суммы. Кроме того нет боли, связанные с хирургическими потеря этой ткани. Чувствуется, конечно, небольшая боль в месте инъекции, только, как игла входит в язык. После анестезии стерлась, есть небольшой дискомфорт иногда меньше чем за день, но этот дискомфорт значительно меньше, чем то, что человек испытывает после случайного "кусаться" те, языком.
За последние несколько лет мы разработали альтернативную процедуру, которая не включает анестезию. Техника для удаления ткани одинакова для обоих. Единственное различие в процедуре является то, что хирург не ограничивается 1 см 2, диаметр области, где анестезия была адресована. Скорее он / она может выбрать любой сайт на дорсальной поверхности языка, где видные сосочков появляются. Общее число удаленных сосочков ограничиваются 6-8 в обоих методах, с или без анестезии Если выполнены должным образом, дискомфорт удаления 6-8 fungiform вкус сосочков считается менее важной проблемой, по сравнению с болью, связанной с администрирование местной анестезией общего обследования лиц, которые прошли обе процедуры, то есть с учетом и без анестезии, показали, что подавляющее большинство субъектов бы обойтись без местной анестезии во всех будущих биопсии. Хирург, который разработал эту технику (АИС) и несколько его коллег учил автора, который выполняется биопсия без анестезии, испытал на себе и засвидетельствовать, что дискомфорт носит временный характер и считается менее, чем язык кусать своих. Наконец, десятки лиц, давших согласие на биопсию было предложено, если они были бы готовы попробовать удаления одного сосочка без анестезии, и если они сочтут, что слишком тяжело они будут подвергаться анестезии, все согласились, чтобы продолжить удаление без сосочков анестезии.
Весь биопсия не должна продолжаться более 5-10 минут. Если анестезия применяется еще 2-3 минут добавляется. Биопсия, как правило, проводятся в утренние часы. Перед биопсией, добровольцы поручено съесть легкую пищу за два часа до назначенного времени. При биопсии, письменное информированное согласие получено. Критерии исключения во время биопсии включают те с серьезными хроническими заболеваниями, независимо от того контролируется лекарство или нет (например, какой-либо желудочно-кишечных заболеваний, нейродегенеративных заболеваний, рака, патологическими изменениями крови, аллергии на местные анестетики и т.д.) те, с ЧСС больше 100 или меньше, чем 60; систолическое артериальное давление выше 145 или менее 100; диастолического артериального давления более 90 или менее 60, а по мнению хирурга, что субъект может принять участие в исследовании.
Наконец, важно учитывать, что процедура биопсии должны осуществляться в тех же местах, где ткань будет обработан на экспертизу так целостности тканей быстро потеряли как мы не раз отмечали снижение качества мРНК. Чтобы минимизировать эти проблемы языка ткани должны быть обработаны как можно быстрее.
2. Тема подготовки
- Предмет сидит в стоматологическом кресле или сиденье с подголовником.
- Проверьте частоту сердечных сокращений и артериальное давление во время биопсии. В случае, если предметом выпадают из диапазона артериального давления, частоты сердечных сокращений или устной компетенции, хирург рекомендует предмет, который он / она делает непосредственный прием к врачу.
- Осмотрите полость рта для общего состояния здоровья ткани, с вниманием к показателям сухость во рту, географический язык или язык поражений. Любой предмет, признаки болезни полости рта, в том числе язык поражений или сухость во рту, исключены из исследования. Поручить подлежат прополоскать рот водой, чтобы удалить все загрязнения из ротовой Cavity. При необходимости язык очищается с одноразовыми забияка язык, чтобы удалить налет и мусор, которые могут быть реализованы в языке во время введения наркоза. Хирург использует стерильные марлевые прокладки в перчатке держать переднюю четверть язык, как она распространяется из полости рта.
- Если анестезия применяется, 1cc шприц туберкулин с 28 калибр х ½ "игла содержит 0,25 мл лидокаина (2%) с адреналином (1:100000) медленно вводят в одном месте чуть ниже верхней поверхности передней части языка . Сайт анестезия дистальнее семейства узлов, чтобы избежать помех от лидокаина с последующими исследованиями. Для сравнения, количество лидокаин вводят (0,25 мл) составляет примерно одну четверть суммы обычно дается для нервных блока в стоматологических процедур (0,8 мл до 1 мл). После введения иглы, но до введения анестезии, стремление гарантирует, что ни кровеносный сосуд поражен. Эта мера предосторожности принимается даже если это анатомически маловероятно, что крупное судно будет нанесен близко к спинной поверхности. Только артерии на дорсальной поверхности спинного языках артерии мелких кровеносных сосудов в первую очередь расположен более кзади от передней трети, где ткань уборки происходит. Чем больше языков артерий и вен языках работать на вентральной поверхности языка, далекие от спинной области получения анестезии 3. 1 см под наркозом области, кажется, немного бледно в сравнении с окружающей тканью. Это связано с отеком тканей, как он сжимает мелкие кровеносные сосуды. Кроме того, из-за сосудосуживающего влияния адреналина. Примерно через минуту, датчик используется для проверки области для онемение. Если область не онемели, второй инъекции (0,1 до 0,2 мл) могут быть даны.
3. Язык Техника удаления Сосочки
- Передней четверти языком субъекта, завернутый в стерильную марлю (рис. 1) и держат в левой руке хирурга (при выполнении биопсии с правой руки). Один угол марли остается открытым, чтобы хирург стереть язык без слюны. Язык должен быть прочно удерживается, но, конечно, не настолько, чтобы вызвать ненужные дискомфорт. Кончик указательного пальца левой руки находится под язык непосредственно в том месте, где биопсии. При нажатии на указательный палец вверх, язык становится натянутой на кончике пальца решений сосочки торчат для легкой биопсии.
- Критерии выбора сосочков для биопсии: Вкус сосочки легко отличить от окружающих filliform сосочки по форме и размеру. Fungiform сосочки круглая и несколько изолированы от окружающих. В непосредственной близости от них есть круговая пространстве, лишенном filliform сосочков (рис. 2А, синие стрелки). Это пространство составляет около 1 мм в диаметре. Другой отличительной особенностью fungiform сосочков расширенной капиллярной разветвление видна на вершине самой fungiform сосочков молодых субъектов. Хотя разветвление делает поиск fungiform сосочков легче, они не всегда хорошие предсказатели существование вкусовые рецепторы в том, что сосочка. Как правило, человек начинает уборки в сторону переднего конца и двигается дальше от кончика языка, чтобы избежать капиллярного кровотечения из скрывая сайт следующей коллекции тканей.
- После хорошего сосочка был идентифицирован, весной микро-ножницы (McPherson-Vannas, изогнутые, острые режущей кромки 5 мм, расчески, наконечник шириной 0,2 мм, общая длина 3 "(РС-5603, Roboz) используется, чтобы отсечь его. Для эффективного использования микро-хирургических ножниц не стоит использовать кончик лезвия для резки, а, скорее, насколько внутри лезвия возможно (рис. 1, увеличенное изображение и рисунок 3), недалеко от пересечения с противоположной лезвия. Удаление сосочка достигается с одной режущей ход ножницы (рис. 1). дальнейшего внутри открытого лезвия целевых сосочка кажется, более эффективным является резки. Следует позаботиться о том, что общее положение ножниц должны быть параллельны с дорсальной поверхности языка.
- Иногда язык становится сухим, как хирург пытается определить сосочка для удаления. После высыхания, способность оператора четко видеть которая сосочка fungiform становится более сложной и делают скольжение лезвия над сосочками очень трудно. Чрезмерно сухой язык обычно делает палку металлическое лезвие, чтобы язык делает тонкие хирургические двигаться менее управляемым. Сдача тему закрыть его / ее рот и слюна вступают в контакт с поверхности языка помогает процессу. Слишком влажный язык является не очень хорошо. Использование углу марли которые можно использовать для проведения язык помогает в этом процессе.
- Любой капиллярного кровотечения, которое имеет место трактуется промокательной стерильной марлей. Кровотечение обычно прекращается в течение нескольких минут Утес и не вмешивается в дополнительной уборке ткани. Потому что сосочки возвышаются над эпителиальной поверхности языка, и только верхние 3 / 4 от fungiform сосочка удаляется (рис. 2В), что часть fungiform показывает вкусовые рецепторы, небольшое кровотечение не ожидается.
- С помощью небольшой Дюмон щипцы (Pattern тип), удалены сосочки находятся в охлажденном основные буфера Ringer (130 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2, 1 мМ Na-Пируват, 20 мМ HEPES-Na , рН 7,2; осмоляльности ~ 305 osmols милли) для последующих манипуляций. Крайне важно, чтобы НИКОГДА щепотку сосочка между лопастями щипцов. Ткани очень хрупкие и следует обращаться с крайней осторожностью.
- После удаления сосочков, субъект остается в кресле в течение десяти-пятнадцати минут. Каждый предмет сказано не кусать их под наркозом язык, но и сохранить свой язык в покое. Субъекты должны быть визуально контролируется лечащим хирургом. Анестезия, как ожидается, стираться примерно 30-60 минут. Поскольку сайт сосочков удаление может быть немного болит после биопсии, они поручили быть в курсе острой или горячей (температура) пища, газированные напитки или напитки, которые являются либо очень холодной или горячей. Еще одним свидетельством уделяется предметам, что любой незначительный красноватое окрашивание слюны является нормальным и прекращается после растворения сгустка.
- Субъекты видны 30-40 дней после удаления сосочков для оценки сайта, где сосочки были удалены. К этому времени сосочки вкусом должны иметь полностью регенерировать.
5. Представитель Результаты
Ткань собранных могут быть использованы для иммуногистохимического, RT-PCR, в гибридизация, кальция изображений, патч зажим и тканевой культуры. При правильном выполнении появление сосочки здоровый, белый, около 0,5-1 мм в диаметре (рис. 2В).
Сосочки, собранных для иммуногистохимии обрабатываются на основе существующих и опубликованных протоколов 4. Типичный бутон вкус от paraformaldehide фиксированной вкус сосочка показан на рисунке 4A.
Биопсию сосочки также можно рассматривать ферментативно 5, обеспечить диссоциации клеток вкусовой рецептор. После ферментативной диссоциации, клетки могут сохраняться до 4 часов в увлажненной чашку Петри на 4C. В этом состоянии они могут быть использованы для одной ячейки ПЦР (рис. 4В), Са-изображений, и т.д.
Клетки показать разнообразие форм, многие из которых были стройными и биполярное (5А и 5Б рис), как и следовало ожидать ячейки бутон вкус. При сборе клетки или при выполнении Са-изображениями, примерно через 20 минут под микроскопом, клетки начинают развиваться апоптоза пузырьков (рис. 6А и 6Б, стрелки) и многие из них становятся круглыми. Использование методики, разработанной в нашей лаборатории, клетки были подобраны индивидуально с использованием патч-пипетки, как показано на рис 5А и 5Б.
Как уже упоминалось выше, сосочки начать расти после 5 до 8 недель. Рис 7A демонстрирует появление языка, где 8 fungiform сосочки были сняты с левой стороны языка добровольца без использования анестезии. Обратите внимание, 8 небольшие красноватые пятна, где сосочки были отрезал. Нет кровотечение наблюдается после операции. Настоящий снимок был сделан через 10 минут после биопсии. Рис 7B является образ языка на ту же тему видел через 40 дней после биопсии. Обратите внимание на все сосочки имеют отросших. Чтобы определить, регенерированного сосочки функциональных мы попросили добровольно согласиться на вторую биопсию с участием точно такой же сосочков. Чтобы правильно определить соответствующие сосочков мы планировали повторно урожая, мы получили сетку (рис. 7), что соответствует 8 сосочками, которые были удалены в первую очередь, и накладывается его на язык одного и того же добровольца через 40 дней после первичной биопсии . С помощью контура язык и расстояние от края к сетке, когда-то определили, мы удалили несколько из точно такой же сосочков и обработанные им для иммуногистохимии. Рис 4A является одним из этих сосочков. Обратите внимание на контуры вкусовой рецептор (желтый цвет) и иммунопозитивных окрашивание на фосфолипазы Cβ2 (PLCβ2), 2-го типа вкус ячейки трансдукции связанного фермента. Эти данные показывают, что использование процедуры биопсии, как здесь описано, сосочки fungiform регенерировать достаточно на 40 дней, также на место вероятно функциональных вкусовые рецепторы.
Рисунок 1. Передней четверти языком субъекта, завернутый в стерильную марлю и держат в левой руке хирурга. Язык должен быть прочно удерживается. Увеличенное изображение справа показывает правильное положение ножниц и положение сосочка по отношению к лезвию.
201/2201fig2.jpg "ALT =" Рисунок 2 "/>
Рисунок 2. (А) Fungiform сосочков показаны синими стрелками. Эти круглые структур несколько изолирована от окружающих его, и в непосредственной близости от них есть круговая пространстве, лишенном filliform сосочков. (B) Fungiform вкус сосочков на кончике весной микро-ножницы секунд после того, как были удалены.
Рисунок 3. Я биопсии сосочка fungiform с помощью зеркала и без анестезии. На вставке показана общая положение ножниц, которые должны быть параллельно с дорсальной поверхности языка. Если все сделано правильно и атравматически, анестезия упущенных практически все добровольцы.
Рисунок 4 А. Immunohistochemistry из вкусовой рецептор. Fungiform сосочка визуализируются с помощью оптики Номарского с использованием антител к β2 фосфолипазы и помеченные красный флуоресцентный белок. Контур бутона вкус и несколько меченых клеток вкус показаны желтым цветом. 
Б. RT-PCR кандидата кислый рецепторов вкуса, Acid зондирования ионный канал 1 (ASIC1). M = маркер. Дорожки с 1 по 4 были одной клетки-ПЦР для ASIC1 из четырех добровольцев. После сбора, fungiform сосочки были ферментативно диссоциированных, клетки индивидуально подобранный и выражение ASIC1 было сделано. Дорожки 2 и 4 были нормальные выражения ASIC1.
Рисунок 5. А. изображения одиночных клеток вкус их подобрали использования патча пипетки. Больших эпителиальных клеток видна в левом нижнем углу (5А). Два красных кровяных клеток видны также выше патч пипетки и за стеклом баррель. Вкус ячейки составляет примерно 30-50 мкм в длину и около 6 микрон в ширину. Для справки, красные клетки крови составляет около 7-8 мкм в диаметре. Б. показывает другую ячейку вкусовых рецепторов, окруженный четырьмя эпителиальных клеток. Вкус клетка выглядит четким.
Рисунок 6. А. Изображения клетки, которые начали развиваться апоптоза пузырьков (призрак, как круглые пузырьки придает вкус клетку, стрелки). В. Клетки больше не собираться после их появления изменений, как показано здесь.
Рисунок 7. А. Через десять минут после удаления 8 вкус сосочков без использования анестезии. Хирургических сайтов видны как слегка красноватые пятна. Нет кровотечение заметили.
Б. же язык через 40 дней после биопсии. Обратите внимание на все сосочков регенерировать. Чтобы помочь определить удалены сосочков, как отросших, сетка была создана с сайта на фото справа стороне и перешла регенерации сосочков на левом изображении стороны.
С. регенерации сосочков появился в том же месте. Сбор сосочков раз из этой группы следует иммуногистохимии показали, что регенерация сосочков, содержащихся функциональных клеток вкус (см. рисунок 4А).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Заметным преимуществом использования человеческих клеток является их специфичность. Процедура, описанная здесь подробно обеспечивает язык ткани для изоляции вкус рецепторных клеток от людей. Эти вкусовые клетки могут быть использованы для молекулярных исследований, стремясь обнаружить молекулы важно для трансдукции вкуса информации, а для кальция изображений исследования, которые контролируют деятельность вкус ячейки на раздражители. Кроме того, язык ткани предоставляемые этой процедуры могут быть проанализированы с различных методов, таких как иммуногистохимия, на месте гибридизация и позволяет захватывать отдельные ячейки для молекулярных процедуры, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), в том числе в режиме реального времени Количественные Single Cell ПЦР. Поскольку эта процедура может быть выполнена на людей, чье чувство вкуса можно psychophysically оценивается до биопсии, можно получить четкое представление о молекулярной детали отвечают за вкус аномалии (см., например, Huque и соавт. 2009). Эта процедура биопсии позволяет производить жизнеспособные и метаболически нетронутыми одного препарата, клетка обогащенные клетки вкусовых рецепторов и, следовательно, способность выполнять записи патч зажим на эти клетки. Используя эту технику, будущие исследования могут не только увеличить наше понимание вкуса трансдукции процессы уникальны для человека, но и расшифровать молекулярные механизмы, лежащие вкус нарушений при болезни или лекарственные препараты-индуцированных состояний и развития схемы для лечения этих патологий.
Наконец, результаты наших наблюдений убедительно свидетельствуют о том, что наличие "дыр", часто отмечается на fungiform сосочков близко к arborizations и вообще считается поры вкусовой рецептор, являются, по сути, а не хорошие предсказатели существование вкуса. Только то, что природа этих отверстий, или то, что функции, которые они могут выполнять, мы не знаем.
В 8 лет, как мы начали эту процедуру, мы уже не раз собираются из нескольких десятков добровольцев более 4000 вкус сосочков. Два неблагоприятных заболеваемости, как связанные с местной анестезией привело к временной отек языка, но решен в течение ближайших 48 часов без побочных эффектов. Если все сделано правильно, в стерильных условиях и атравматической, этот метод является безопасным и эффективным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH R21 DC03969-01 (в JGB). Мы благодарим д-р Фриц Lischka для захвата одной вкусовой рецептор клеток, доктором Tauf Huque для проведения ПЦР показано на рисунке 4В и г-н Д. Бейли и г-жа С. Аларкон для оказания технической помощи. М. Янина Пепино является членом поддерживается NIDAT32 DA07313 Вашингтон школы медицины университета в Сент-Луисе, штат Миссури (Cottler, Л. П.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McPherson-Vannas. Curved, sharp cutting edge 5mm. Comb, tip width 0.2 mm overall length 3" | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5603, Roboz | |
| Small Dumont forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4915, Roboz |
References
- Breslin, P. A., Spector, A. C. Mammalian taste perception. Curr Biol. 26 (4), R148-R155 (2008).
- Miller, I. Anatomy of the peripheral taste system. Handbook of Olfaction and Gustation. Doty, R. I., Dekker, M. , Marcel Dekker. New York. 521-547 (1995).
- Figure 12.67. Gray's Anatomy: The Anatomical Basis of Medicine and Surgery. , 38th Edition, Churchill Livingstone. New York. (1995).
- Huque, T., Cowart, B. J., Dankulich-Nagrudny, L., Pribitkin, E. A., Bayley, D. L., Spielman, A., Feldman, I., S, R., Mackler, Sour ageusia in two individuals implicates ion channels of the ASIC and PKD families in human sour taste perception at the anterior tongue. PLoS One. 4 (10), e7347-e7347 (2009).
- MacDonald, J. F., Mody, I., Salter, M. W., Spielman, A. I. Patch-clamping of taste cells in mouse. Experimental Cell Biology of Taste and Olfaction. Spielman, A. I., Brand, J. G. , CRC Press. Boca Raton, FL. 329-332 (1995).
