Teknik för att samla Fungiform (smak) papiller från Human Tongue

Summary

Kunskap om molekylära mekanismer som ligger bakom smak transduktion har nyligen haft betydande framsteg, mycket tack vare hjälp av djurmodeller. Men den stora mångfalden i smak sensitivitet och specificitet hos däggdjur teckningsoptioner studier i mänsklig vävnad. Vi beskriver en biopsi tekniken för att samla in celler lever smak från papiller om mänskliga tungan.

Abstract

Den smaksinne är avgörande för mänskligt liv. Den informerar kroppen om kvaliteten på maten som kommer att vara potentiellt intas och stimulerar metaboliska processer som förbereder matsmältningskanalen för matsmältningen. Stadiga framsteg har gjorts för att förstå den tidiga biokemiska och molekylära händelser underliggande smak transduktion (för en översyn, Breslin och Spector, 2008 ^1). Framstegen har dock hittills berodde främst på djurmodeller. Men eftersom stora skillnader i receptor specificitet och receptor tätheten varierar mellan arter, kommer mänskligt smaka transduktion bara förstås genom att använda mänskliga smak vävnad. Här beskriver vi en biopsi tekniken för att samla människor fungiform papiller, syns som runda rosa främre strukturer, ca 0,5 mm i diameter som innehåller smaklökar. Dessa biopsier papiller används för flera syften, inklusive isolering av livskraftiga celler smaklökar, in situ hybridisering, immunohistokemi och genom tekniker för molekylärbiologi, identifiering av smak-specifika nya proteiner.

Protocol

1. Inledning och allmänna överväganden

Det allmänna förfarande innebär lokalbedövning av en liten (1 cm ²⁾ område i dorsal yta främre tungan, följt av borttagning av ett antal (6-8) i fungiform (smak) papiller från det sövda område med hjälp av en böjd fjäder mikro -sax (McPherson-Vannas typ # SR 5603, Roboz, Rockville, MD). Den borttagna fungiform papiller är ungefär 0,25 mm ³ vardera. Det finns mycket lite icke-papiller (smak) epitelvävnad bort tillsammans med varje papilla. Nya papiller form i detta område efter 3 till 5 veckor och återfå fungerande smaklökar (Spielman och Brand, opublicerade observationer). Det finns ingen märkbar effekt på smak eller smak av mat efter avlägsnande av denna lilla mängd smakar material. Från studier som har räknat individuella smaklökar i den vuxna människans tungan, kan man uppskatta att den mänskliga tungan innehåller cirka 5000 smaklökar. Vår procedur avlägsnar högst 20 till 25 av dessa smaklökar (i genomsnitt ~ 3,5 till 4 smaklökar per fungiform papilla i mänskliga) ^2, eller ca 0,4% av den totala. Dessutom finns det ingen smärta i samband med kirurgiska förlust av denna vävnad. Man känner ju lätt smärta vid injektionsstället endast, som nålen går in i tungan. Efter bedövningen väl har avklingat, det är ibland lätt obehag för mindre än en dag, men detta obehag är mycket mindre än vad man upplever efter misstag "bita" de tunga.

Under de senaste åren har vi utvecklat ett alternativt förfarande som inte inkluderar anestesi. Tekniken för vävnad är identisk för båda. Den enda skillnaden i förfarandet är att kirurgen är inte längre begränsad till en 1 cm ² diameter område där bedövningen togs upp. Snarare han / hon kan välja vilken plats på rygg ytan av tungan där framstående papiller visas. Det totala antalet borttagna papiller är begränsade till 6-8 i båda teknikerna, med eller utan bedövning om det utförs korrekt, att obehaget av att ta bort 6-8 papiller fungiform smak anses vara ett mindre problem jämfört med smärta i samband med tillförsel av lokalbedövning En allmän undersökning av individer som genomgick båda förfarandena, dvs med och utan bedövning, visade att en överväldigande majoritet av försökspersonerna skulle avstå utan lokalbedövning i alla framtida biopsier. Kirurgen som utvecklat denna teknik (AIS) och flera kollegor undervisas av författaren som utförde biopsier utan bedövning, har provat det på sig själva och vittnar om att Obehaget är tillfälligt och anses mindre än bita tungan. Slutligen har dussintals personer som samtyckt till att biopsied frågade om de skulle vara villiga att prova bort en papilla utan bedövning, och om de bedömer att det är för smärtsamt att de skulle genomgå narkos, har alla enats om att fortsätta med avskaffandet av papiller utan anestesi.

Hela biopsi bör inte ta längre än 5-10 minuter. Om anestesi är anställd ytterligare 2-3 minuter tillsätts. Biopsi är normalt utförs under morgontimmarna. Innan biopsi, är frivilliga uppdrag att äta en lätt måltid två timmar före utsatt starttid. Vid biopsi, är skriven informerat samtycke erhållas. Uteslutningskriterier vid biopsi är personer med allvarlig kronisk sjukdom, antingen kontrolleras med medicinering eller inte (t.ex. eventuella gastrointestinala sjukdomar, neurodegenerativa sjukdomar, cancer, bloddyskrasi, allergi mot lokalanestetika, etc.) de med puls högre än 100 eller mindre än 60, systoliskt blodtryck högre än 145 eller mindre än 100, diastoliskt blodtryck högre än 90 eller mindre än 60, och yttrandet från kirurgen att ämnet kan delta i studien.

Slutligen är det viktigt att beakta att biopsin förfarande bör genomföras i samma anläggning där vävnad kommer att behandlas för undersökning eftersom vävnaden integritet är snabbt förlorade vi har ofta uppmärksammats av sjunkande kvalitet mRNA. För att minimera dessa problem tungan vävnaden bör behandlas så snart som möjligt.

2. Ämne Förberedelser

1. Ämnet är sittande i en tandläkarstol eller en stol med ett nackstöd.
2. Kontrollera puls och blodtryck vid biopsi. Om ämnet faller utanför intervallet blodtryck, hjärtfrekvens eller muntlig kompetens, rekommenderar kirurgen att ämnet som han / hon omedelbart ta tid för att se en läkare.
3. Inspektera munhålan för allmän vävnad hälsa, med hänsyn till indikatorer av muntorrhet, geografisk tunga eller några tunga skador. Alla föremål som visar tecken på sjukdom i munhålan, inklusive tunga skador eller muntorrhet är uteslutna från studien. Instruera motivet att skölja munnen med vatten för att avlägsna all skräp från den muntliga Cavity. Om det behövs tungan rengörs med en disponibel tunga Scrapper att ta bort plack eller skräp, som skulle kunna utföras i tungan under injektion av anestesi. Kirurgen använder sterila kompress kuddar i en behandskade hand för att hålla den främre ¼ av tungan som sträcker sig från munhålan.
4. Om anestesi används, en 1 ml tuberkulin spruta med en 28 gauge x ½ "nål innehållande 0,25 ml lidokain (2%) med epinefrin (1:100,000) injiceras långsamt i en plats strax under dorsal yta främre delen av tungan . Platsen för anestesi distalt om insamlingsplats för att undvika störningar av lidokain med efterföljande studier. Som jämförelse är mängden lidokain injiceras (0,25 ml) ungefär en fjärdedel av det belopp som normalt ges för nervblockad i tandvård (0,8 ml till 1 ml). Efter införandet av nålen men före injektion av bedövningsmedel, ser strävan att inget blodkärl slås. Detta försiktighetsåtgärder vidtas även om det är anatomiskt osannolikt att ett stort fartyg kommer att slås nära rygg ytan. Den enda artärer på rygg ytan, rygg linguala artärerna är små blodkärl i första hand ligger mer posteriort om främre tredje, där vävnaden skörd inträffar. De större språk artärer och den språkliga vener köra på den ventrala yta av tungan, långt bort från den dorsala området får anestesi ^3. Den 1 cm sövda område verkar vara en aning blek i jämförelse med den omgivande vävnaden. Detta på grund av svullnad av vävnaden som trycker ihop de små blodkärlen. Det är också beror på kärlsammandragande effekten av adrenalin. Efter ungefär en minut är en sond används för att testa området för domningar. Om området inte är förlamad, kan en andra injektion (0,1 till 0,2 ml) ges.

3. Tungan papiller uttagningstekniken

1. Den främre fjärdedel av tunga ämnet är insvept i steril gasbinda (figur 1) och hålls i vänster hand kirurgen (om att utföra biopsin med höger hand). Ett hörn av gasväv lämnas öppen så att kirurgen att torka av tungan fri från saliv. Tungan måste hållas fast, men naturligtvis inte så att det orsakar onödigt obehag. Toppen av pekfingret på vänster hand placeras under tungan direkt under den plats där biopsi utförs. Genom att trycka pekfingret uppåt, blir tungan sträckte sig över toppen av fingret gör papiller sticka ut för enkel biopsi.
2. Kriterier för val av papiller för biopsi: Smak papiller är lätt att skilja från den omgivande filliform papiller genom sin form och storlek. Fungiform papiller är runda och lite isolerad från omgivningen. I deras omedelbara närhet finns en cirkulär yta saknar filliform papiller (Figur 2A, blå pilar). Detta utrymme är ca 1 mm i diameter. Ett annat utmärkande kännetecken för fungiform papiller är en förlängd kapillär arborization syns på toppen av de flesta fungiform papiller för yngre. Även arborization gör lokalisera fungiform papiller lättare, de är inte nödvändigtvis goda prediktorer av förekomsten av smaklökarna i papilla. Som regel en börjar skörda mot fronten och flyttar längre bort från tungspetsen för att undvika kapillära blödningar från fördunklande platsen för nästa vävnaden kollektion.
3. När en bra papilla har identifierats, en fjäder mikro-sax (McPherson-Vännäs, böjd, vass egg 5 mm, kam, spets bredd 0,2 mm total längd 3 "(RS-5603, Roboz) används för att klippa bort det. att effektivt använda mikro-kirurgisk sax man inte bör använda spetsen på bladet för kapning, utan så långt inne i bladet som möjligt (Figur 1, förstorade bilden och figur 3), nära skärningspunkten med det motsatta blad. Borttagning av papilla uppnås med en skärande flytten av sax (Figur 1). längre in i öppna blad de riktade papilla visas är desto effektivare kapning. Försiktighet bör iakttas att den övergripande ställning saxen måste vara parallell med rygg ytan av tungan.
4. Ibland tungan blir torr som kirurgen försöker identifiera en papilla för borttagning. När torrt blir förmågan hos operatören för att tydligt se vilken som är en fungiform papilla mer utmanande och gör glider av bladen över papilla mycket svårt. En alltför torra tungan gör oftast fastnar blad av metall på tungan som gör den känsliga kirurgiska rör sig mindre kontrollerbar. Låta föremål nära hans / hennes mun och har saliv kommer i kontakt med ytan av tungan hjälper processen. Alltför våt tunga är inte bra heller. Använda hörnet av gasväv som man använder för att hålla tungan hjälper till i denna process.
5. Varje kapillär blödning som inträffar behandlas av blotting med steril gasbinda. Blödning oftast stannar inom ett par minuter nuter och inte stör med ytterligare vävnad skörd. Eftersom papiller förlänga ovanför epitelial yta av tungan, och endast den övre 3 / 4 av en fungiform papilla tas bort (Figur 2B),, den del av fungiform visar smaklökarna är liten blödning förväntas.
6. Använd en liten Dumont peang (mönster typ), är de borttagna papiller placeras i kyld grundläggande Ringer buffert (130 mM NaCl, 5 mm KCl, 1 mM CaCl _2, 1 mm MgCl _2, 1 mm Na-Pyruvat, 20 mm HEPES-Na , pH 7,2, osmolalitet på ~ 305 Milli osmols) för senare manipulationer. Det är viktigt att ALDRIG nypa papilla mellan bladen i en tång. Vävnaden är mycket ömtålig och bör hanteras med stor försiktighet.
7. Efter avlägsnande av papiller, förblir ämnet i stolen för tio till femton minuter. Varje ämne är tillsagda att inte bita på sina sövda tungan, men att hålla tungan i vila. Ämnen bör visuellt övervakas av den behandlande kirurgen. Anestesi väntas avta i ca 30-60 minuter. Eftersom platsen för papiller borttagning kan vara något öm efter biopsi, de är instruerade att vara medveten om kryddig eller varma (temperatur) mat, kolsyrade drycker eller drycker som är antingen extremt kallt eller varmt. Ytterligare ett tecken ges till ämnen som alla lätt rödaktig färgning av saliv är normalt och upphör efter upplösning av koagel.
8. Ämnen ses 30-40 dagar efter borttagning av papiller för utvärdering av den plats där papiller togs bort. Vid den här tiden smaka papiller bör ha helt regenereras.

5. Representativa resultat

Tissue in kan användas för immunohistokemi, RT-PCR, in situ hybridisering, kalcium bildbehandling, patch för fastspänning och vävnadsodling. När utförs korrekt utseendet på papiller är friska ut, vit, ca 0,5-1 mm i diameter (Figur 2B).

Papiller samlas in för immunohistokemi behandlas bygger på befintliga och publicerade protokoll ^4. En typisk smak knopp från en paraformaldehide fasta smak papilla visas i figur 4A.

Biopsier papiller kan också enzymatiskt behandlat ⁵ för att uppnå dissociation av celler smaklökar. Efter den enzymatiska dissociation, kan cellerna behållas för upp till 4 timmar i en fuktig petriskål på 4C. I detta tillstånd kan de användas för enskild cell PCR (Figur 4B), Ca-imaging, etc.

Celler visar en mängd olika former, många är smal och bipolär (figur 5a och 5b) som man kan förvänta sig av ett smaklökar cell. När du hämtar celler eller utför Ca-avbildning, efter ca 20 minuter under ett mikroskop, de celler börja utveckla apoptotiska blebs (Figur 6a och 6b, pilar) och många av dem blir runda. Med hjälp av en teknik som utvecklats i vårt labb, var cellerna plockade upp sig med hjälp av en patch-pipett, som visas i figur 5A och 5B.

Som nämnts ovan, papiller börjar återföds efter 5 till 8 veckor. Figur 7a visar utseendet på en tunga där 8 fungiform papiller togs bort från vänster sida en volontär tungan med hjälp av någon anestesi. Kallelse 8 små rödaktiga fläckar, där papiller blev klippt av. Ingen blödning observeras efter operationen. Den nuvarande bilden togs 10 minuter efter biopsi. Figur 7B är en bild av tungan i samma ämne sett 40 dagar efter biopsi. Kallelse alla papiller har växt ut. För att avgöra om den regenererade papiller är funktionella Vi bad våra frivilligt att gå med på en andra biopsi med exakt samma papiller. För att korrekt identifiera lämpliga papiller vi planerade att åter skörd, genererade vi ett rutnät (figur 7C) som passar den 8 papiller som togs bort i första hand och ovanpå det över tungan av samma volontär efter 40 dagar efter första biopsi . Med hjälp av konturen av tungan och avståndet från marginalen till nätet, när identifierade, har vi tagit bort några av exakt samma papiller och bearbetat dem för immunohistokemi. Figur 4A är en av dessa papiller. Lägg märke till konturen av en smaklökar (i gult) och immunopositive färgning av fosfolipas Cβ2 (PLCβ2), en typ 2-smak cell transduktion-associerad enzym. Dessa data visar att med hjälp av biopsi som beskrivs häri, det fungiform papiller regenerera tillräckligt med 40 dagar till har i stället sannolikt funktionella smaklökar.

Figur 1. Den främre fjärdedel av tunga ämnet är insvept i steril gasbinda och höll i vänster hand kirurg. Tungan måste hållas ordentligt. Den förstorade bilden till höger visar rätt position sax och placeringen av papilla i förhållande till bladet.

201/2201fig2.jpg "alt =" Figur 2 "/>
Figur 2. (A) Fungiform papiller visas med blå pilar. Dessa är runda strukturer som något isolerat från sin omgivning och i deras omedelbara närhet finns en cirkulär yta saknar filliform papiller. (B) Fungiform smak papilla på spetsen av våren mikro-sax sekunder efter den har tagits bort.

Figur 3. Själv biopsi av en fungiform papilla med hjälp av en spegel och ingen bedövning. Den infällda bilden visar den totala placeringen av saxar, som måste vara parallell med rygg ytan av tungan. Om det görs på rätt sätt och atraumatically är anestesi avstår från praktiskt taget alla frivilliga.

Figur 4 A. Immunohistokemi av en smak knopp. En fungiform papilla visualiseras genom Nomarski optik att använda antikroppar mot fosfolipas β2 och märkta med röd fluorescerande protein. Konturen av smaklökar och några märkta celler smak visas i gult.

B. RT-PCR för en kandidat syrlig smak receptorn, Acid Sensing Ion Channel 1 (ASIC1). M = markör. Lanes 1 till 4 var enda cell RT-PCR för ASIC1 från fyra olika frivilliga. Efter samlingen var fungiform papiller enzymatiskt dissocierade, tog celler individuellt upp och uttryck ASIC1 gjordes. Lanes 2 och 4 hade normala uttryck för ASIC1.

Figur 5. A. Bild av enstaka smak celler tas upp med hjälp av en patch pipett. En stor epitelceller syns i det nedre vänstra hörnet (5A). Två röda blodkroppar är också synlig ovanför patch pipett och bakom glaset fat. Smaken cellen är ca 30-50 mikrometer lång och ca 6 micron bred. För referens, är en röd blodkropp ca 7-8 mikrometer i diameter. B. visar en annan cell smak receptor omgiven av fyra epitelceller. Smaken cellen är skarp.

Figur 6. A. bilder av celler, som började utvecklas apoptotiska blebs (spöket som runda blebs bifogas smaken cellen, pilar). B. Celler är inte längre skördas när deras utseende förändras som visas här.

Figur 7. A. Tio minuter efter 8 smak papiller med någon bedövning. Den kirurgiska områden syns som något rödaktiga fläckar. Inga blödningar märks.
B. Samma tungan 40 dagar efter biopsi. Kallelse alla papiller regenereras. För att identifiera den borttagna papiller som växt ut, var ett rutnät skapat med plats på höger sida bild och flyttade över den regenererade papiller på vänster sida bilden.
C. Den regenererade papiller dök upp i exakt samma plats. Skörd papiller igen från denna grupp följt av immunhistokemi visat att regenereras papiller som finns funktionella smak celler (se figur 4A).

Discussion

En anmärkningsvärd fördel med att använda mänskliga celler är deras specificitet. Det förfarande som beskrivs här i detalj ger tungan vävnad för isolering av celler smak receptorer från människa. Dessa smaka celler kan användas för molekylära studier och försöker upptäcka molekyler viktigt för transduktion av smak information och kalcium imaging studier som övervakar aktiviteten smak cell till stimuli. Dessutom kan tungan vävnad som detta förfarande analyseras med olika tekniker såsom immunohistokemi, in situ hybridisering, och låter fånga enskilda celler för molekylär förfaranden såsom polymeraskedjereaktion (PCR), däribland Real Time Kvantitativa Single Cell PCR. Eftersom detta förfarande kan utföras på personer vars smaksinne kan psychophysically utvärderas innan biopsi, är det möjligt att få en tydlig bild av de molekylära detaljerna ansvarig för smak avvikelser (se till exempel Huque et al. 2009). Denna biopsi förfarande möjliggör produktion av en livskraftig och metaboliskt intakta enda cellberedningen anrikas i celler från smaklökar och därmed förmågan att utföra inspelningar patch klämma på dessa celler. Med denna teknik kan framtida studier inte bara att öka vår förståelse för smak transduktion processer som är unika för människan men också dechiffrera molekylära mekanismerna bakom smak avvikelser i sjukdom eller medicinering-inducerad stater och utveckla behandlingar för att behandla dessa abnormiteter.

Slutligen, resultaten av våra observationer visar tydligt att närvaron av "hål", ofta noteras på fungiform papiller nära arborizations och allmänt anses vara smaklökar porer, är i själva verket inte bra prediktorer av förekomsten av smaklökarna. Precis vad naturen av dessa hål är, eller vilka funktioner de kan utföra, vet vi inte.

I 8 år sedan vi startade detta förfarande har vi samlat flera gånger från flera dussin frivilliga över 4000 smak papiller. Två negativa incidens, båda förknippade med lokalbedövning ledde till en tillfällig svullnad av tungan, men löst inom de närmaste 48 timmar utan biverkningar. Om det görs på rätt sätt, under sterila och atraumatisk förhållanden, är denna metod säkert och effektivt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McPherson-Vannas. Curved, sharp cutting edge 5mm. Comb, tip width 0.2 mm overall length 3"	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5603, Roboz
Small Dumont forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4915, Roboz