Evaluatie van de ruimtelijke verdeling van γH2AX volgende ioniserende straling

Summary

Microscopische analyse van γH2AX foei, welke vorm na de fosforylatie van H2AX op Ser-139 in reactie op DNA dubbelstrengs breuken, is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in straling biologie. Hier hebben we gebruik gemaakt van een antilichaam aan mono-gemethyleerde histon H3 op lysine 4 als een epigenetische marker van actief transcriberen euchromatin, om de ruimtelijke verdeling van de straling-geïnduceerde γH2AX formatie binnen de kern te evalueren.

Abstract

Een vroege moleculaire respons op DNA dubbel-breuken (DSB) is fosforylering van de Ser-139 residu in de terminal SQEY motief van de histon H2AX ^1,2. Deze fosforylatie van H2AX wordt gemedieerd door de fosfatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) familie van eiwitten, ataxie telangiectasia gemuteerd (ATM), DNA-eiwit kinase katalytische subeenheid en ATM en RAD3-gerelateerde (ATR) ^3. De gefosforyleerde vorm van H2AX, aangeduid als γH2AX, verspreidt naar aangrenzende regio's van chromatine van de site van de DSB, de vorming van discrete foei, die makkelijk kunnen worden gevisualiseerd door immunofluorecence microscopie ^3. Analyse en kwantificering van γH2AX foci is op grote schaal gebruikt om de DSB vorming en reparatie, in het bijzonder in reactie op ioniserende straling en voor het evalueren van de effectiviteit van verschillende straling wijzigen verbindingen en cytotoxische verbindingen ⁴ te evalueren.

Gezien de uitstekende specificiteit en gevoeligheid van deze de novo marker van DSB, heeft zij nieuwe inzichten in de processen van DNA-schade en herstel in het kader van chromatine. Bijvoorbeeld, in de biologie straling van de centrale paradigma is dat de kern-DNA is de kritische doelgroep met betrekking tot de stralingsgevoeligheid. Inderdaad, de algemene consensus in het veld grotendeels aan chromatine te zien als een homogene sjabloon voor DNA-schade en reparatie. Echter, met het gebruik van γH2AX als moleculaire marker van DSB's, een ongelijkheid in γ-straling-geïnduceerde γH2AX brandpunten vorming in euchromatin en heterochromatine waargenomen ^5-7. Onlangs hebben we gebruik gemaakt van een panel van antilichamen tegen zowel mono-, di-of tri-gemethyleerd histon H3 op lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3), die epigenetische sporen van constitutieve heterochromatine en transcriptionele zwijgen en lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), die nauw gecorreleerd actief transcriberen euchromatic regio's, de ruimtelijke verdeling van γH2AX onderzoeken volgende ioniserende straling ^8. In overeenstemming met de heersende ideeën over chromatine biologie, onze bevindingen wezen op een nauwe correlatie tussen de γH2AX vorming en actieve transcriptie ^9. Hier laten we zien onze immunofluorescentie methode voor de detectie en kwantificering van γH2AX foci in niet-hechtende cellen, met een bijzondere nadruk op co-lokalisatie met andere epigenetische merkers, beeldanalyse en 3D-modellering.

Protocol

Celpreparaat

1. Menselijke erythroleukemic K562 cellen worden gekweekt in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum en 20 mg / ml gentamicine in een bevochtigde 5% CO _2-omgeving bij 37 ° C.
2. Ongeveer 18 uur voorafgaand aan de kleuring wassen exponentieel groeiende cellen (optimaal bij 5 x 10 ⁵ cellen / ml) met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), opnieuw in suspensie in verse media en terug te keren naar 37 ° C, 5% CO _2.
3. Was de cellen twee keer met PBS door centrifugeren bij ongeveer 1500 rpm gedurende 5 minuten en resuspendeer in verse media.
4. Tellen cellen en stel de celdichtheid tot ongeveer 5 x 10 ⁵ cellen / ml.

Cellen kunnen worden geteld door een geautomatiseerde methode (bijvoorbeeld Sysmex of Coulter counter met filter grootte van tussen de 5 tot 20 micron) of met behulp van de trypan blauw uitsluiting methode en een hemocytometer. Extra aantal cellen (> 800 cellen / cm ²⁾ kan leiden tot niet-uniforme vlekken.

Bestraling en immunofluorescentiekleuring

1. Monteer Cytospin clips, filter-kaarten en dia's met de juiste etikettering.

Bij het monteren van de Cytospin apparaat ervoor te zorgen dat het gat in de filter-kaart valt samen met de trechter.

2. Expose cellen om ofwel γ-straling of X-stralen (2Gy in dit voorbeeld).

Om te voorkomen dat de vorming van foci tijdens de bestraling, houden de cellen op ijs gedurende 5 tot 10 minuten voorafgaand aan en tijdens de bestraling.

Na bestraling Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO ₂ voor de vereiste tijd (voor piek-γH2AX levels 30 minuten tot 1 uur, 1 uur in dit voorbeeld).

3. Twee keer Was de cellen met koude PBS door centrifugeren en resuspendeer in verse PBS.
4. Verdeel 100 tot 150 pi van de celsuspensie in elk Cytospin trechter en draaien op 500 rpm gedurende 5 minuten.
5. Scheid de dia's van cytospins en laat de cellen tot matig droge lucht voor ongeveer 15 minuten.

Niet laten cellen volledig droog als cellulaire morfologie kunnen desintegreren.

6. Teken een cirkel rond de cellen met een hydrofobe pen.
7. Fix cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).

In onze ervaring, fixatie met paraformaldehyde superieur is aan de bevestiging met ethanol of methanol. Suspensie-cellen nodig fixatie gedurende 5 minuten bij RT terwijl langere fixatietijden (15 tot 20 minuten) zijn nodig voor een optimale fixatie van het aanklevende cellen.

We vinden dat de vlekken onmiddellijk betere resultaten oplevert dan het opslaan van de vaste dia's bij -20 ° C, die doorgaans resulteert in hoge achtergrond fluorescentie.

8. Twee keer wassen van de cellen met PBS gedurende 5 minuten elk.
9. Permeabilize de cellen met 0,1% Triton-X 100 bij RT gedurende 5 minuten.

In vergelijking met Tween-80 hebben we meestal beter kijken signalen in cellen gepermeabiliseerd met Triton-X 100. Afhankelijk van het celtype kan het nodig zijn om de permeabilisation tijd te wijzigen. Bijvoorbeeld, in K562 cellen permeabilisatie gedurende 5 minuten bij RT voldoende is terwijl in hechtende cellen een 15 minuten permeabilisatie is vereist.

10. Was de cellen drie keer met PBS gedurende 5 minuten elk.
11. Blok cellen in 1% BSA voor 30 minuten (3 x 10 minuten) bij RT.

We vergeleken het blokkeren efficiëntie met serum (afgeleid van dezelfde soort als de secundaire antilichamen) en runder serum albumine in PBS. BSA efficiënter was in het minimaliseren van niet-specifieke binding van secundaire antilichamen in vergelijking met serum. We vergeleken verschillende blokkeren tijden, 's nachts blokkeren bij 4 ° C in vergelijking met 3 x 10 minuten en 3 x 20 minuten te blokkeren stappen bij kamertemperatuur, en bepaald dat het blokkeren van voor 3 x 10 minuten optimaal was.

12. Voeg 50 ul van de primaire antilichaam (1: 500 verdund in 1% BSA) aan elke dia.

Incubatie met de primaire antistof bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten resulteert in een verminderde achtergrondkleuring in vergelijking met een overnacht incubatie bij 4 ° C.

13. Om vlek verschillende merkers tegelijk gebruiken antilichamen die zijn opgewekt in verschillende soorten (bijvoorbeeld een muis anti-γH2AX en konijn anti-gemethyleerde H3K4 in dit voorbeeld).
14. Incubeer met primaire antilichamen gedurende 90 minuten bij KT op een schommelende platform bij 250 rpm.

Alle incubaties worden uitgevoerd in een vochtige vlekken trog.

15. Was de cellen drie keer met PBS gedurende 5 minuten elk.
16. Voeg 50 ul van (1: 1000 verdund in 1% BSA) secundair antilichaam aan elke dia.

Om vlek voor de verschillende markeringen op dezelfde dia te gebruiken secundaire antilichamen met dAllerlei mensen soortspecificiteit (volgens de primaire antilichaam) en fluorescentie-emissie golflengte (bijv. anti-muis Alexa 488 (groen) en anti-konijn Alexa-546 (rood) in dit voorbeeld).

17. Incubeer cellen gedurende 60 minuten bij RT op een schommelende platform bij 250 rpm.

Het wordt aanbevolen om cellen te incuberen in een donkere vochtige kamer om te voorkomen dat vervagen en drogen van het secundaire antilichaam.

18. Was de cellen drie keer met PBS gedurende 5 minuten elk.
19. Voeg 50 ul van (1:500 verdund in PBS) TOPRO-3 aan elke dia.
20. Was de dia's met PBS voor 3x 5 minuten.
21. Overmaat aan vocht verwijderen uit dia's en voeg anti-fade oplossing.

Het wordt aanbevolen niet naar de cellen drogen voor het toevoegen van anti-fade oplossing.

22. Dekglaasje, afdichting met nagellak en laat dia's 's nachts in het donker bij kamertemperatuur.

Het wordt aanbevolen om confocale specifieke dekglaasjes # 1.5 (0.16 tot 19 micron dik) en heldere nagellak te gebruiken.

Terwijl het plaatsen van de dekglaasje op dia, moet ervoor worden getroffen om de vorming van luchtbellen te voorkomen.

Beeldacquisitie

1. Een Zeiss LSM510 Meta confocale microscoop wordt gebruikt om beelden met behulp van de standaard GFP (groen, 488 nm), PI (rood 543 nm) en ver rood (blauw 633 nm) lasers te verwerven.

Beelden die met behulp van een confocale microscoop zichtbaar betere ruimtelijke resolutie.

Aangezien de grootte van γH2AX foci kan lager zijn dan 0,5 μicrons, is het raadzaam om beelden te verwerven met ten minste een 0,5 μicron stapgrootte langs de Z-as.

Een 63 x olie-immersie objectief heeft de voorkeur ten opzichte van een hogere of lagere vergroting. Voor beeldvorming van veel cellen voor het tellen van foci is het beter het gebruik van een scansnelheid van 8 en beeldgrootte van 1024 x 1024 pixels. Ter illustratie van de ruimtelijke relatie tussen de verschillende nucleaire eiwitten is het raadzaam om een ​​scan snelheid van 6 te gebruiken met beeldgrootte van 2048 x 2048 pixels.

Bij de beeldvorming van meerdere kanalen een line scan overname wordt aanbevolen ten opzichte van een frame te scannen. Dit voorkomt bleken en een betere resolutie wordt bereikt. Sequentiële scanning wordt gebruikt om te bloeden te voorkomen door tussen de kanalen.

Foci tellen

Beeldanalyse en haarden geteld kan worden uitgevoerd met behulp van diverse software pakketten (onder wie Metamorph, Beeld-J en Imaris). De procedure voor het tellen van brandpunten gebruiken Metamorph wordt hier beschreven.

1. Open γH2AX image stacks rechtstreeks vanuit het menu Bestand of met behulp van het buildnummer stacks optie.
2. Ga naar het menu Proces en koos stack rekenen.
3. Kies Maximale projectie en selecteer de vliegtuigen die moeten worden opgenomen en klik op OK.
4. Sla het resulterende beeld als een γH2AX Tiff. bestand en open de TOPRO-3 (blauw) afbeelding.
5. Ga naar de regio's en selecteer een regio tekengereedschap en teken de regio's rond kernen.
6. Klik op de γH2AX Tiff afbeelding en ga naar proces-menu en selecteer morfologische filters.
7. Kies Top-Hat en selecteer γH2AX beeld als een bron beeld.
8. Van toepassing zijn Top-Hat-filter en de resulterende beeld zal een binair beeld met minder ruis en minder variatie in de haarden intensiteit.

Voorzichtigheid is geboden bij het kiezen van Top-Hat waarden. Optimale waarden kunnen worden verkregen door visuele vergelijking van beelden voor en na het toepassen van filters.

9. Ga naar het proces-menu en selecteer drempel beeld.
10. Kies inclusief drempel en selecteer de lagere en hogere drempelwaarden.

Het is meestal de drempel waarden die foci nummer beïnvloeden. Daarom is veel aandacht nodig bij het selecteren van drempelwaarden. Dit kan het beste worden bereikt door het tellen van brandpunten nummer met behulp van verschillende drempelwaarden in de cellen blootgesteld aan minder dan 2 Gy γ-straling en vervolgens foci cijfers vergelijken met de handmatige telling (per oog). De optimale drempelwaarde is degene die het opnemen van achtergrond minimaliseert en maximaliseert de inclusie van foci.

11. Kies de TOPRO-3 afbeelding en ga naar de regio's menu en selecteer de overdracht regio optie. Selecteer de bron beeld als TOPRPO-3 en de bestemming als Top-Hat en klik op OK.
12. Zodra de nucleaire regio's worden overgebracht naar de Top-Hat afbeelding gaat u naar de maatregel menu en selecteer Integrated morfometrie Analysis.
13. In het pop-up venster te selecteren bronafbeelding-Top-Hat en meet per gebied.
14. Selecteer meten alle regio's en klik op maat om de brandpunten nummer te verkrijgen in alle kernen van de overeenkomstige in de Top-Hat beeld.
15. De brandpunten cijfers van elke regio kunnen worden geëxporteerd naar een MS-Excel-bestand met behulp van de log-data optie.

3Dde reconstructie van beelden

Voor het maken van een 3D-beeld van een stapel met Metamorph:

1. Ga naar de stapel menu en kies 3D-reconstructie.
2. Selecteer de hoek van de rotatie (bijvoorbeeld 160 °, 320 °).
3. Selecteer de 3D-reconstructie type-maximum.
4. Kies het vlak van rotatie (horizontaal of verticaal).
5. Koos voor de Z-kalibratie afstand.

Het is beter om de gebruiker opgegeven gebruik van Z-afstand (optimaal is 0,5 μicrons).

6. Kies OK om een ​​3D-reconstructie te maken.

Lijn scan analyse

Voor de line scan analyse met behulp van Metamorph:

1. Open ofwel een enkel vlak afbeelding of een gestapelde bestand.
2. Ga naar de maatregel werkbalken opdracht en selecteer line scan analyse.
3. Teken een lijn over de cel en dit zal de fluorescentie-intensiteit en de afstand van elke merkdraad automatisch laten zien langs het pad van de lijn.

Licht te werpen op de ruimtelijke relatie van de verschillende chromatine markers, bijvoorbeeld, γH2AX foci en histon-methylatie, is het beter om lijnen die de regio's die zowel dicht en armen in deze merkers omvatten trekken.

Representatieve gegevens

Voor de toepassing van deze demonstratie gebruikten we antilichamen tegen γH2AX foci en H3K4me, om de ruimtelijke verdeling van de DSB's evalueren om een ​​epigenetische determinant van actief transcriberen euchromatin. Zoals weergegeven in figuur 1, na bestraling met 2Gy, γH2AX brandpunten gevormd voornamelijk in regio's die saai waren voor zowel de H3K4me kleuring en voor de DNA vlek TOPRO-3 (fel gekleurde DNA-regio's zijn een indicatie van heterochromatine).

Figuur 1. ΓH2AX foci vorm voornamelijk in euchromatin in reactie op ioniserende straling. (A) Immunofluorescentie visualisatie van γH2AX foci (groen) in menselijke erythroleukemic K562 cellen, 1 uur na γ-bestraling (2 Gy). γH2AX foci worden getoond in relatie tot H3K4me, die actief transcriptie euchromatin (rood). DNA wordt gelabeld met TOPRO-3 (blauw). De samengevoegde afbeelding (blauw, rood en groen) toont de uitsluiting γH2AX brandpunten van heterochromatic regio's. De lijn scan analyse (fluorescentie-intensiteit versus afstand) geeft de relatieve verdeling van de markers in een enkel vlak. (B) Slices op verschillende vlakken van de 3D-reconstructie van de samengevoegde afbeelding hierboven beschreven.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)	Growth medium	Invitrogen	22400071	RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid
Fetal Bovine Serum (FBS)		Sigma-Aldrich	F2442
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
Trypan blue		Sigma-Aldrich	T6146	Used to distinguish between live and dead cells.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	EMD Millipore	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
HistoneH3 (Mono-methyl K4)	Primary Antibody	Abcam	AB8895
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11035
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.
Polylysine slides		Menzel-Glaser
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Glaser	CS2250100
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Biosciences	353112
Shandon Cytospin 4		Thermo Fisher Scientific, Inc.
Cytofunnels		Shandon, Inc.
Filter Cards		Shandon, Inc.	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
PAP Pen		Zymed Laboratories, Inc.	008877
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope			Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices