تقييم التوزيع المكاني للγH2AX التالية الإشعاعات المؤينة

Summary

وقد أصبح التحليل المجهري للبؤر γH2AX ، والتي تشكل في أعقاب الفسفرة من H2AX في سر - 139 ردا على فواصل المزدوج حبلا الحمض النووي ، وأداة لا تقدر بثمن في مجال البيولوجيا الإشعاعية. المستخدمة هنا نحن جسم مضاد لأحادية ميثليته H3 هيستون في ليسين (4) وعلامة جينية من كروماتين حقيقي بنشاط الاختزال ، لتقييم التوزيع المكاني للتشكيل γH2AX الإشعاع الناجم داخل النواة.

Abstract

استجابة مبكرة الجزيئية في الحمض النووي مزدوج الجديلة (DSBs) هو من بقايا الفسفرة 139 سر داخل المحطة عزر SQEY من ^1،2 H2AX هيستون. وتتوسط هذه الفسفرة من H2AX من فسفاتيديل inosito - 3 - كيناز (PI3K) عائلة من البروتينات ، ورنح توسع الشعيرات تحور (ATM) ، الوحيدات كيناز الحمض النووي من البروتين المحفز وأجهزة الصراف الآلي وRAD3 ذات الصلة ³ (ATR). شكل فسفرته من H2AX ، ويشار إلى γH2AX ، ينتشر في المناطق المتاخمة لونين من موقع جهاز تسوية المنازعات ، وتشكيل بؤر منفصلة ، والتي يمكن رؤيتها بسهولة بواسطة المجهر immunofluorecence ^3. وقد تم تحليل والكميات المستخدمة من بؤر γH2AX على نطاق واسع لتقييم DSB تشكيل وإصلاح ، ولا سيما في الاستجابة للأشعة المؤينة وتقييم مدى فعالية مختلف الإشعاع تعديل المركبات والمركبات السامة للخلايا ^4.

نظرا لخصوصية وحساسية رائعة هذه العلامة دي نوفو من DSBs ، فقد قدمت أفكارا جديدة في عمليات إصلاح الحمض النووي من التلف وفي سياق لونين. على سبيل المثال ، في مجال البيولوجيا الإشعاعية النموذج المركزي هي أن الحمض النووي هو الهدف الحاسم فيما يتعلق حساسية للإشعاع. في الواقع ، فقد تم التوافق العام في الآراء في هذا المجال إلى حد كبير نظرا لونين كقالب متجانسة للإصلاح الحمض النووي من التلف و. ومع ذلك ، مع استخدام علامة γH2AX كما الجزيئي للDSBs ، وجود تفاوت في γ - تشعيع صنع تشكيل بؤر γH2AX في كروماتين حقيقي ومغاير وقد لوحظ ^5-7. في الآونة الأخيرة ، كنا فريقا من الأضداد إما أحادي ، ثنائي أو ثلاثي ميثليته H3 هيستون في ليسين 9 (H3K9me1 ، H3K9me2 ، H3K9me3) والتي هي بصمات جينية من المغاير التأسيسية وإسكات الترانسكربتي ويسين 4 (H3K4me1 ، H3K4me2 ، H3K4me3 ) ، والتي ترتبط بإحكام الاختزال بنشاط مناطق الكروماتين الحقيقي ، والتحقيق في التوزيع المكاني للγH2AX التالية الإشعاعات المؤينة ^8. وفقا للأفكار السائدة بخصوص لونين البيولوجيا وأشارت النتائج التي توصلنا اليها وجود ارتباط وثيق بين تشكيل γH2AX والنسخ النشطة ^9. نحن هنا لدينا وسيلة إثبات المناعي للكشف عن الكميات وبؤر γH2AX غير ملتصقة في الخلايا ، مع التركيز بوجه خاص على الترجمة بالتعاون مع علامات جينية أخرى ، تحليل الصور و 3D النمذجة.

Protocol

إعداد الخلية

1. تزرع الخلايا البشرية erythroleukemic K562 - 1640 في المتوسط ​​RPMI تستكمل مع 10 ٪ (V / V) مصل بقري جنيني و 20 جنتاميسين ملغ / مل في ترطيب البيئة 5 ٪ CO ₂ عند 37 درجة مئوية.
2. ما يقرب من 18 ساعة قبل غسل خلايا تلطيخ المتزايدة باطراد (الأمثل في 5 × ⁵ 10 خلايا / مل) مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ، resuspend في وسائل الإعلام الجديدة والعودة إلى 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO _2.
3. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي في حوالي 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق وresuspend في وسائل الإعلام الجديدة.
4. عدد الخلايا وضبط كثافة الخلية إلى ما يقرب من 5 × ⁵ 10 خلايا / مل.

ويمكن الاعتماد الخلايا إما عن طريق الأسلوب الآلي (على سبيل المثال أو Sysmex عداد كولتر مع حجم تصفية ما بين 5 إلى 20 ميكرون) ، أو باستخدام أسلوب الاستبعاد التريبان الأزرق وhaemocytometer ملف. قد تزيد عدد الخلايا (> 800 خلية / سم ²⁾ تؤدي إلى تلطيخ غير موحدة.

التشعيع وتلطيخ المناعي

1. تجميع مقاطع cytospin ، بطاقات الترشيح والشرائح مع وضع العلامات المناسبة.

عند تجميع جهاز cytospin ضمان ثقب البطاقة تصفية يتزامن مع القمع.

2. كشف الخلايا إما الإشعاع γ أو الأشعة السينية (2Gy في هذا المثال).

لمنع تشكيل بؤر خلال التشعيع ، والحفاظ على الخلايا على الجليد لمدة 5 إلى 10 دقائق قبل وأثناء التشعيع.

تشعيع التالية احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO ₂ للفترة الزمنية المطلوبة (للحصول على مستويات الذروة γH2AX 30 دقيقة إلى 1 ساعة ، 1 ساعة في هذا المثال).

3. غسل الخلايا مرتين مع PBS الباردة بواسطة الطرد المركزي وresuspend في برنامج تلفزيوني جديد.
4. الاستغناء 100-150 ميكرولتر لتعليق كل خلية في قمع cytospin وتدور في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
5. فصل الشرائح من cytospins والسماح للخلايا في الهواء الجاف المعتدل لحوالي 15 دقيقة.

لا تدع خلايا جافة تماما كما التشكل الخلوي قد تتفكك.

6. رسم دائرة حول الخلايا بالقلم مسعور.
7. إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4 ٪ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).

في تجربتنا ، مع تثبيت بارافورمالدهيد متفوقة على التلاعب مع الإيثانول أو الميثانول. تعليق الخلايا تتطلب تثبيت لمدة 5 دقائق في حين أن هناك حاجة RT أوقات أطول التثبيت (من 15 إلى 20 دقيقة) للتثبيت الأمثل للخلايا ملتصقة.

نجد أن تلطيخ غلة على الفور نتائج أفضل من تخزين الشرائح الثابتة في -20 درجة مئوية مما يؤدي عادة في مضان الخلفية عالية.

8. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
9. Permeabilize الخلايا مع 0.1 ٪ تريتون - X 100 في RT لمدة 5 دقائق.

مقارنة توين - 80 نلاحظ عادة أفضل الإشارات في الخلايا permeabilized مع تريتون - X 100. اعتمادا على نوع من الخلايا قد يكون من الضروري تغيير الوقت permeabilisation. على سبيل المثال ، في K562 permeabilization الخلايا لمدة 5 دقائق في حين RT كافية في الخلايا الملتصقة مطلوب permeabilization 15 دقيقة.

10. غسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
11. كتلة الخلايا في جيش صرب البوسنة 1 ٪ لمدة 30 دقيقة (3 × 10 دقيقة) في RT.

قارنا كفاءة حظر استخدام المصل (مشتقة من نفس الأنواع من الأجسام المضادة الثانوية) ، ومصل بقري الزلال في برنامج تلفزيوني. وكان جيش صرب البوسنة أكثر فعالية في تقليل غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة الثانوية بالمقارنة مع المصل. قارنا مختلف أوقات حظر حظر بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مقارنة ب 3 × 10 دقيقة و 3 × 20 دقيقة عرقلة خطوات في درجة حرارة الغرفة ، وقرر أن تمنع لمدة 3 دقائق وكان 10 × الأمثل.

12. إضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (1 : 500 المخفف في 1 ٪ BSA) في كل شريحة.

الحضانة مع الضد RT الابتدائي في 60 دقيقة لتحقيق نتائج في تلوين خلفية انخفاض مقارنة مع الحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

13. وصمة عار على علامات مختلفة في وقت واحد باستخدام الأجسام المضادة التي أثيرت في أنواع مختلفة (مثل الماوس المضادة للγH2AX والأرانب مكافحة ميثليته H3K4 في هذا المثال).
14. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 90 دقيقة في RT على منصة هزاز عند 250 دورة في الدقيقة.

يتم تنفيذ كافة حضانات في حوض تلطيخ مرطب.

15. غسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
16. إضافة 50 ميكرولتر من (1 : 1000 مخففة في جيش صرب البوسنة 1 ٪) على كل شريحة الضد الثانوية.

وصمة عار للعلامات مختلفة على نفس الشريحة استخدام الأجسام المضادة الثانوية مع دifferent خصوصية الأنواع (وفقا للجسم الابتدائي) ومضان الانبعاثات الطول الموجي (مثل مكافحة الماوس اليكسا 488 (الأخضر) والمضادة للأرنب اليكسا - 546 (أحمر) في هذا المثال).

17. احتضان الخلايا لمدة 60 دقيقة في RT على منصة هزاز عند 250 دورة في الدقيقة.

فمن المستحسن لاحتضان الخلايا في الحجرة مظلمة رطبة لتجنب يتلاشى وتجفيف الجسم المضاد الثانوي.

18. غسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
19. إضافة 50 ميكرولتر من (1:500 مخففة في PBS) TOPRO - 3 على كل شريحة.
20. تغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق 3X.
21. إزالة الرطوبة الزائدة من الشرائح وإضافة مكافحة تتلاشى الحل.

فمن المستحسن عدم خلايا جافة تماما قبل أن يضيف لمكافحة تتلاشى الحل.

22. ساترة ، وختم مع طلاء الأظافر وتترك الشرائح بين عشية وضحاها في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

فمن المستحسن استخدام coverslips محددة مبائر # 1.5 (0،16 حتي 19 ميكرون سميكة) وطلاء الأظافر واضحة.

في حين وضع على الشريحة ساترة ، ينبغي الحرص على تجنب تشكيل فقاعات الهواء.

صورة اكتساب

1. ويستخدم مجهر زايس ميتا LSM510 متحد البؤر للحصول على الصور باستخدام معيار GFP (أخضر ، 488 نانومتر) ، PI (الأحمر 543 نانومتر) وأشعة الليزر الحمراء بعيدة (الأزرق 633 نانومتر).

الحصول على الصور باستخدام المجهر مبائر تكشف عن قرار أفضل المكاني.

منذ حجم بؤر γH2AX قد يكون أقل من 0.5 μicrons ، فمن المستحسن للحصول على الصور مع ما لا يقل عن 0.5 حجم μicron خطوة على طول محور Z.

ويفضل الزيت × 63 الغمر الهدف عدسة التكبير مقارنة إما أعلى أو أقل من ذلك. لخلايا التصوير العديد من بؤر العد يفضل استخدام سرعة المسح الضوئي للصورة (8) وحجم من 1024 بكسل 1024 س. لتوضيح العلاقة المكانية بين البروتينات النووية المختلفة فمن المستحسن استخدام سرعة تفحص 6 مع حجم الصورة 2048 × 2048 بكسل.

عند التصوير من خلال قنوات متعددة من المستحسن اقتناء خط مسح مقارنة تفحص الإطار. هذا يتجنب تبيض ويتحقق أفضل قرار. ويستخدم المسح المتسلسل لمنع النزف من خلال بين القنوات.

عد البؤر

يمكن إجراء تحليل الصور والفرز البؤر باستخدام حزم البرامج المختلفة (inlcuding Metamorph ، صورة وJ - Imaris). يوصف إجراء العد البؤر باستخدام Metamorph هنا.

1. فتح مداخن صورة γH2AX إما مباشرة من قائمة ملف أو باستخدام الخيار بناء المداخن الرقم.
2. انتقل إلى القائمة واختار عملية حسابية المكدس.
3. اختار وحدد الحد الأقصى لإسقاط الطائرات التي ينبغي إدراجها وانقر فوق موافق.
4. حفظ الصورة الناتجة بوصفها المشاجرة γH2AX. وفتح ملف TOPRO - 3 (الأزرق) الصورة.
5. انتقل إلى المناطق وحدد أداة رسم المنطقة ، ورسم المناطق حول النواة.
6. انقر على الصورة المشاجرة γH2AX وانتقل إلى القائمة واختيار مرشحات عملية شكلية.
7. اختار الأعلى هات صورة وحدد γH2AX كصورة المصدر.
8. سيتم تطبيق أعلى هات وتصفية الصورة الناتجة تكون الصورة الثنائية مع أقل ضوضاء وخفض التباين في كثافة البؤر.

يجب توخي الحذر عند اختيار أعلى هات القيم. ويمكن الحصول على القيم المثلى من خلال المقارنة البصري للصور قبل وبعد تطبيق المرشحات.

9. انتقل إلى القائمة وحدد صورة عملية العتبة.
10. اختيار عتبة شاملة وتحديد قيم العتبة الدنيا والعليا.

فمن عادة القيم الحدية التي تؤثر على عدد البؤر. ولذلك ، مطلوب الكثير من الاهتمام عند تحديد قيم العتبة. هذا يمكن أن يكون أفضل يتحقق من قبل عدد البؤر العد باستخدام قيم عتبة مختلفة في الخلايا المعرضة لأقل من 2 غراي من الإشعاع γ ومن ثم مقارنة مع أرقام بؤر العد اليدوي (بالعين). قيمة العتبة الأمثل هو الذي يقلل من إدراج الخلفية ويعظم إدراج البؤر.

11. حدد الصورة TOPRO - 3 وانتقل إلى المناطق القائمة وحدد الخيار نقل المناطق. حدد مصدر الصورة كما TOPRPO - 3 ، والوجهة وهات - الأعلى وانقر فوق موافق.
12. حالما يتم نقل مناطق النووية للصورة أعلى هات انتقل إلى القائمة قياس وحدد التحليل المتكامل قياس الأشكال.
13. في إطار منبثق حدد مصدر الصور هات - الأعلى وقياس من حيث المساحة.
14. حدد قياس جميع المناطق وانقر على قياس للحصول على عدد البؤر في كل من النوى في الصورة المقابلة أعلى القبعة.
15. يمكن تصديرها الأرقام بؤر من كل منطقة في ملف MS - Excel باستخدام الخيار سجل البيانات.

3Dإعادة بناء الصور

لإنشاء صورة 3D من كومة باستخدام Metamorph :

1. انتقل إلى القائمة واختيار المكدس إعادة الإعمار 3D.
2. تحديد زاوية دوران (على سبيل المثال 160 درجة و 320 درجة).
3. حدد إعادة الإعمار 3D نوع الأقصى.
4. اختار الطائرة التناوب (أفقي أو عمودي).
5. اختار المسافة Z - المعايرة.

فمن الأفضل لاستخدام المستخدم المحدد Z - مسافة (الأمثل هو 0.5 μicrons).

6. اختار موافق لإنشاء التعمير 3D.

خط مسح تحليل

لتحليل المسح باستخدام خط Metamorph :

1. إما فتح صورة طائرة واحدة أو ملف مكدسة.
2. انتقل إلى الأمر أداة قياس وأشرطة حدد خط تحليل الفحص.
3. رسم خط عبر الخلية ، وهذا سوف يكشف تلقائيا من كثافة مضان والمسافة من كل علامة على طول مسار الخط.

لتوضيح العلاقة المكانية لونين من علامات مختلفة ، على سبيل المثال ، وبؤر γH2AX مثلأيشن هيستون ، فمن الأفضل لرسم خطوط المناطق التي تمتد على حد سواء كثيفة والفقراء في هذه العلامات.

ممثل البيانات

لغرض هذه المظاهرة كنا الأجسام المضادة لبؤر γH2AX وH3K4me ، لتقييم التوزيع المكاني للDSBs إلى محددات جينية من الاختزال بنشاط كروماتين حقيقي. شكلت بؤر γH2AX كما هو مبين في الشكل 1 ، وبعد التعرض لل2Gy ، في الغالب في المناطق التي كانت مملة لكلا تلطيخ H3K4me وصمة عار على الحمض النووي TOPRO - 3 (DNA الملون بألوان زاهية المناطق تدل على المغاير).

الشكل 1. النموذج الغالب في بؤر γH2AX كروماتين حقيقي في الاستجابة للأشعة المؤينة. (أ) التصور المناعي بؤر γH2AX (الأخضر) في الخلايا البشرية erythroleukemic K562 ، 1 ساعة بعد التشعيع - γ (2 غراي). وتظهر بؤر γH2AX فيما يتعلق H3K4me ، تمثل الكتابة بنشاط كروماتين حقيقي (الحمراء). هو المسمى DNA مع TOPRO - 3 (الأزرق). صورة مدمجة (الأزرق والأحمر والأخضر) يدل على الاستبعاد من مناطق بؤر γH2AX heterochromatic. تحليل المسح السطر (المسافة مقابل كثافة مضان) يشير التوزيع النسبي للعلامات في طائرة واحدة. (ب) كما هو موضح في شرائح مختلفة من الطائرات لإعادة الإعمار 3D للصورة المدمجة أعلاه.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)	Growth medium	Invitrogen	22400071	RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid
Fetal Bovine Serum (FBS)		Sigma-Aldrich	F2442
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
Trypan blue		Sigma-Aldrich	T6146	Used to distinguish between live and dead cells.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	EMD Millipore	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
HistoneH3 (Mono-methyl K4)	Primary Antibody	Abcam	AB8895
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11035
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.
Polylysine slides		Menzel-Glaser
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Glaser	CS2250100
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Biosciences	353112
Shandon Cytospin 4		Thermo Fisher Scientific, Inc.
Cytofunnels		Shandon, Inc.
Filter Cards		Shandon, Inc.	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
PAP Pen		Zymed Laboratories, Inc.	008877
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope			Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices