Summary
微观分析γH2AX灶,形成以下丝氨酸139磷酸化H2AX在DNA双链断裂,已成为辐射生物学中的一个非常宝贵的工具。在这里,我们使用一种抗体,单甲基化的组蛋白H3赖氨酸4作为一个积极抄写常染色质的表观遗传标记,以评估辐射诱导γH2AX形成的细胞核内的空间分布。
Abstract
早期的分子反应,DNA双链断裂(DSB的)磷酸化的SER - 139内的组蛋白H2AX 1,2终端SQEY图案的残留。 H2AX的磷酸化介导的磷脂,inosito 3 -激酶(PI3K)的蛋白质家族,共济失调毛细血管扩张症(ATM)的突变,DNA -蛋白激酶催化亚基,ATM和相关RAD3(ATR)的3。 H2AX的磷酸化形式,简称为γH2AX,蔓延到邻近地区的染色质的DSB网站,形成离散灶,很容易由3 immunofluorecence显微镜可视化。分析和定量γH2AX灶已被广泛用于评估DSB的形成和修复,特别是在电离辐射和评估各种修改化合物和细胞毒素化合物4辐射的功效, 。
鉴于这种双链断裂从头标志的精美的特异性和灵敏度,它在染色质中的DNA损伤和修复的过程提供新的见解。例如,在辐射生物学中心的范例是核DNA与放射敏感性的关键目标。事实上,在该领域的普遍共识在很大程度上被认为染色均匀的模板为DNA损伤与修复。然而,与γH2AX作为分子标记,DNA双链断裂,在γ射线照射,诱导γH2AX灶在常染色质和异染色质的形成悬殊的使用已被观察到5-7。最近,我们使用的抗体面板,无论是单,双或三甲基化组蛋白H3赖氨酸9(H3K9me1,H3K9me2,H3K9me3)后生印记构异染色质和转录沉默和赖氨酸4(H3K4me1,H3K4me2,H3K4me3 ),这是密切相关的积极抄写常染色质区域,调查γH2AX的空间分布, 电离辐射8。按照当时的想法,关于染色质生物学,我们的研究结果表明γH2AX的形成和活跃转录9之间的密切相关。在这里,我们展示了非贴壁细胞中γH2AX灶的检测和定量的免疫方法,特别注重与其他的表观遗传标记,图像分析和三维建模与合作本地化。
Protocol
细胞制备
- 人红白血病K562细胞生长在10%(V / V)饱和湿度5%的CO 2环境中的胎牛血清和20毫克/毫升的庆大霉素的RPMI - 1640补充介质在37 ° C。
- 染色前约18小时,洗指数生长的细胞(5 × 10 5细胞/毫升是最优的)用磷酸盐缓冲液(PBS),悬浮在新媒体和返回到37 ° C,5%的CO 2。
- 两次用PBS离心洗涤细胞,在5分钟的转速约1500,并重新悬浮在新鲜的媒体。
- 计数细胞并调整细胞密度约为5 × 10 5细胞/ ml。
细胞可以算作一个自动化的方法(如过滤器的大小5至20微米之间的希森美康或库尔特计数器),或通过台盼蓝排除方法和血球。过量的细胞数(> 800细胞/厘米2),可能会导致非均匀染色。
辐照和免疫荧光染色
- cytospin剪辑,过滤器卡和幻灯片的组装与适当的标签。
当装配cytospin仪器,确保漏斗过滤卡孔重合。
- 使细胞或γ-辐射或X射线(在这个例子中2Gy)。
为了防止在照射病灶的形成,为5至10分钟之前和期间照射细胞置于冰上。
以下照射细胞在37℃,5%的CO 2所需的时间(峰γH2AX水平的30分钟至1小时,在这个例子中的1小时)。
- 用冷PBS清洗细胞两次离心悬浮在新鲜PBS。
- 在5分钟500转100到150μL的细胞悬液,免除到每个cytospin漏斗和自旋。
- 从cytospins分隔的幻灯片,让细胞适度空气干燥约15分钟。
不要让细胞完全干燥细胞形态可能瓦解。
- 周围的细胞具有疏水笔绘制一个圆。
- 4%多聚甲醛在室温(RT)5分钟,修复细胞。
根据我们的经验,与多聚甲醛固定是优于乙醇或甲醇固定。悬浮细胞需要固定在室温下5分钟,而贴壁细胞的最佳固定需要较长的固定时间(15至20分钟)。
我们发现,染色立即产生更好的效果,比储存在-20 ° C,通常在高背景荧光固定的幻灯片。
- 用PBS清洗细胞两次,每次5分钟。
- 通透细胞,用0.1%TRITON - X的RT 100 5分钟。
吐温80相比,我们通常观察与Triton X - 100通透细胞更好的信号。根据细胞类型,它可能需要改变的permeabilisation时间。例如,在K562细胞在室温下5分钟的通透性是足够的,而在15分钟的贴壁细胞通透需要。
- 洗涤细胞用PBS三次,每次5分钟。
- 座在室温为30分钟(3 × 10分钟)的1%BSA的细胞。
我们比较使用血清(二级抗体的同一品种产生)和牛血清白蛋白的PBS阻断效率。 BSA是在最大限度地减少非特异性二次抗体结合更有效率相比,血清。我们比较了不同的阻断时间,一夜之间堵在4 ° C相比,3 × 10分钟和3 × 20分钟的阻塞在室温下的步骤,并确定为3 × 10分钟的阻塞是最佳的。
- 每张幻灯片添加50μL初级抗体(1:500 1%BSA稀释)。
孵育过夜抗体在室温为60分钟,结果减少背景染色的潜伏期比4 ° C。
- 染色不同的标记,同时使用在不同的物种(如鼠抗γH2AX和兔抗在这个例子中的甲基化H3K4)提出的抗体。
- 在室温为90分钟,在250 RPM摇摆平台上小学抗体孵育。
所有孵化加湿染色槽。
- 洗涤细胞用PBS三次,每次5分钟。
- 加入50μL(1:1000稀释在1%BSA)二级抗体,以每张幻灯片。
染色同一张幻灯片上的不同标记,使用二次抗体与Different种属特异性(抗体)和荧光发射波长(如抗鼠Alexa的488(绿色)和抗兔Alexa的- 546(红色)在这个例子中)。
- 在室温为60分钟,在250 RPM摇摆平台上培养的细胞。
建议在黑暗潮湿的会议厅,避免褪色和干燥的二级抗体孵育的细胞。
- 洗涤细胞用PBS三次,每次5分钟。
- 每张幻灯片添加50μL(1:500 PBS稀释)TOPRO - 3。
- 3X 5分钟,用PBS冲洗幻灯片。
- 从幻灯片中删除多余的水分和添加防褪色的解决方案。
这是建议,没有完全晾干后方可加入防褪色的解决方案的细胞。
- 盖玻片,指甲油密封和离开幻灯片在黑暗中过夜,在室温。
这是推荐使用的具体盖玻片焦#1.5(0.16-19微米厚)和透明指甲油。
在幻灯片上放置盖玻片,应小心,以避免形成气泡。
图像采集
- 蔡司LSM510元共聚焦显微镜是用来获取图像,使用标准GFP(绿色,488纳米),PI(红色543纳米)和远红光(蓝色633纳米)的激光。
图片收购,使用共聚焦显微镜,揭示了更好的空间分辨率。
由于γH2AX灶的大小可能会低于0.5μicrons,它是建议获得至少0.5μicron沿Z轴的步长大小的图像。
一个63 ×油浸物镜相比或高或低放大倍率是首选。对于成像许多灶计数细胞,最好是使用8个扫描速度和图像尺寸1024 × 1024像素。为了说明不同,它是建议使用2048 × 2048像素图像的大小为6扫描速度的核蛋白质的空间之间的关系。
当来自多个渠道的成像相比,一帧扫描线扫描收购建议。这就避免了漂白和更好的分辨率达到。顺序扫描是用来防止渠道之间的流血。
佛慈计数
图像分析和灶计数,可以使用各种套装软件(计有Metamorph,图像- J和Imaris)。这里描述灶使用Metamorph计数程序。
- 无论是直接从文件菜单,或通过建立数堆栈选项打开γH2AX形象栈。
- 转到进程“菜单,并选择堆栈算术。
- 选择了最大的投影,选择要包含的飞机,并单击“确定”。
- 保存作为γH2AXTIFF图像。文件,并打开TOPRO - 3(蓝色)的图像。
- 进入的地区,选择一个区域的绘图工具画原子核周围的地区。
- γH2AXTIFF图像处理菜单,并选择形态滤波器。
- 选择顶帽子,并选择γH2AX图像作为源图像。
- 应用自顶帽子过滤器和由此产生的图像将是一个二进制图像灶强度,低噪音和减少变异。
顶帽子值时,应注意选择。最优值,可以得到图像的视觉对比前后应用过滤器。
- 前往处理菜单,并选择阈值图像。
- 选择包容性阈值和选择较低和较高的阈值。
它通常是影响癌灶数目的阈值。因此,选择阈值时,需要十分重视。这可以最好地实现计数灶使用不同的阈值值在细胞暴露于γ辐射低于2 Gy的,然后比较与人工计数(眼),疫源地号码。最优阈值是一个最小化背景的包容性和最大限度地提高列入灶。
- 选择TOPRO - 3的形象和地区菜单,并选择转移地区选项。选择TOPRPO - 3的源图像和顶帽子的目标,并单击确定。
- 一旦核地区转移到了顶帽子的形象去测量菜单,并选择综合形态计量学分析。
- 在弹出窗口中选择源图像顶帽子和按面积的措施。
- 选择测量上衡量各地区,各获得所有相应的核顶帽子的形象灶数量。
- 疫源地从每个区域的数字可以被导出到一个MS - Excel文件,使用日志数据的选项。
3D图像重建
要创建一个三维图像,从使用Metamorph栈:
- 转到堆栈菜单选择三维重建。
- 选择旋转的角度(如160 °,320 °)。
- 选择类型最大的三维重建。
- 选择旋转平面(水平或垂直)。
- 选择的Z -校准距离。
最好是使用用户指定的Z轴的距离(最佳为0.5μicrons)。
- 选择确定以创建一个三维重建。
线扫描分析
对于线扫描分析,使用Metamorph:
- 打开一个单一的平面图像或堆放文件。
- 转到测量工具栏“命令,选择线扫描分析。
- 整个单元格中画一条线,这将自动显示每个标记的荧光强度和距离沿行的路径。
为了澄清各种染色标记的空间关系,例如,γH2AX灶和组蛋白甲基化,这是可取的画线,跨越地区,都是密集的差,在这些标记。
具有代表性的数据
对于这个演示的目的,我们利用抗体来γH2AX灶和H3K4me,双链断裂的空间分布来评价一个积极抄写常染色质的表观因素。如图1所示,与2Gy照射后γH2AX灶形成,主要为H3K4me染色和DNA染色TOPRO - 3(鲜艳染色的DNA区域指示异)沉闷的地区。
图1。γH2AX灶形式在常染色质主要在电离辐射。 (一)人红白血病K562细胞的免疫可视化γH2AX灶(绿色),1小时后,γ射线照射(2戈瑞)。 γH2AX灶有关H3K4me,代表积极抄写常染色质(红色)。 DNA标记TOPRO - 3(蓝色)。合并后的图像(蓝色,红色和绿色)演示了从排斥异色地区γH2AX灶。线扫描分析(荧光强度与距离)表示在一个平面上的标记相对分布。 (二)在不同的飞机从合并后的图像三维重建片上面所述。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
澳大利亚核科学与工程学院的支持,是公认的事实。 TCK的是AINSE奖项的收件人。表观医学实验室是支持由国家卫生和澳大利亚的医学研究理事会(566559)。这项工作是由“儿童权利公约”,生物医学成像发展有限公司,建立和下的澳大利亚政府S合作研究中心(CRC)计划的支持。 LM是由墨尔本研究所(墨尔本大学)和生物医学成像的华润补充奖学金支持。莫纳什显微成像(DRS斯蒂芬科迪ISKA卡迈克尔)的支持是这项工作的宝贵。
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640) | Growth medium | Invitrogen | 22400071 | RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | ||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Used to distinguish between live and dead cells. | |
Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | EMD Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
HistoneH3 (Mono-methyl K4) | Primary Antibody | Abcam | AB8895 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11035 | |
TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. |
ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. |
Polylysine slides | Menzel-Glaser | |||
Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Glaser | CS2250100 | |
Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Biosciences | 353112 | |
Shandon Cytospin 4 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | |||
Cytofunnels | Shandon, Inc. | |||
Filter Cards | Shandon, Inc. | 353025 | ||
Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
PAP Pen | Zymed Laboratories, Inc. | 008877 | ||
Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm. | ||
Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
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