Biology

विकिरण के बाद γH2AX के स्थानिक वितरण का मूल्यांकन

Published: August 7, 2010 doi: 10.3791/2203

Raja S. Vasireddy^1,2,3, Michelle M. Tang^1,2, Li-Jeen Mah^2,3, George T. Georgiadis², Assam El-Osta^1,3, Tom C. Karagiannis^2,3

¹Epigenetics in Human Health and Disease, BakerIDI Heart and Diabetes Institute, The Alfred Medical Research and Education Precinct, ²Epigenomic Medicine, BakerIDI Heart and Diabetes Institute, The Alfred Medical Research and Education Precinct, ³Department of Pathology, University of Melbourne

Summary

ΓH2AX foci, जो Ser-139 H2AX के डीएनए डबल भूग्रस्त टूटता है के जवाब में phosphorylation निम्नलिखित फार्म का सूक्ष्म विश्लेषण विकिरण जीव विज्ञान में एक अमूल्य उपकरण बन गया है. यहाँ हम मोनो - methylated histone H3 सक्रिय transcribing euchromatin के एक epigenetic मार्कर के रूप में 4 lysine पर एक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया, नाभिक के भीतर विकिरण प्रेरित γH2AX गठन के स्थानिक वितरण का मूल्यांकन.

Abstract

डीएनए डबल भूग्रस्त टूटता है (DSBs) के लिए एक प्रारंभिक आणविक प्रतिक्रिया Ser-139 histone ^H2AX 1,2 के टर्मिनल SQEY आकृति के भीतर अवशेषों की phosphorylation है. H2AX की इस phosphorylation 3-kinase phosphatidyl - inosito (PI3K) प्रोटीन के परिवार, गतिभंग telangiectasia उत्परिवर्तित (एटीएम), डीएनए प्रोटीन kinase उत्प्रेरक सबयूनिट और एटीएम और ³ RAD3 से संबंधित (एटीआर) द्वारा मध्यस्थता है. H2AX की phosphorylated फार्म γH2AX के रूप में संदर्भित, DSB की साइट से chromatin के आसन्न क्षेत्रों के लिए, फैलता है, असतत foci, जो ^{आसानी} से immunofluorecence 3 माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना कर रहे हैं बनाने. विश्लेषण और γH2AX foci के quantitation व्यापक रूप से किया गया है DSB गठन और विशेष रूप से विकिरण के जवाब में और विभिन्न यौगिकों और ^{साइटोटोक्सिक} यौगिकों 4 संशोधित विकिरण की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए की मरम्मत, का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया.

उत्तम और DSBs के इस नोवो डे मार्कर की विशिष्टता संवेदनशीलता को देखते हुए, यह डीएनए और chromatin के संदर्भ में क्षति की मरम्मत की प्रक्रिया में नए अंतर्दृष्टि प्रदान की है. उदाहरण के लिए, विकिरण जीव विज्ञान में केंद्रीय प्रतिमान यह है कि परमाणु डीएनए विकिरण संवेदनशीलता के लिए सम्मान के साथ महत्वपूर्ण लक्ष्य है. वास्तव में, क्षेत्र में आम सहमति काफी हद तक डीएनए नुकसान और मरम्मत के लिए एक सजातीय टेम्पलेट के रूप में chromatin देखने के लिए किया गया है. हालांकि, DSBs के आणविक मार्कर, γ-विकिरण प्रेरित euchromatin और heterochromatin में γH2AX foci गठन में असमानता के रूप में γH2AX का ^{उपयोग} के साथ 5-7 मनाया गया है. हाल ही में, हम एंटीबॉडी के एक पैनल का इस्तेमाल या तो मोनो di या त्रिकोणीय methylated 9 lysine पर histone H3 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) जो विधान heterochromatin और transcriptional मुंह बंद और 4 lysine के epigenetic imprints (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), जो कसकर सक्रिय euchromatic क्षेत्रों transcribing सहसंबद्ध होते हैं, निम्नलिखित ionizing विकिरण ⁸ γH2AX के स्थानिक वितरण की जांच . Chromatin जीव विज्ञान के बारे में प्रचलित विचारों के अनुसार, हमारे निष्कर्ष γH2AX गठन और ^{सक्रिय} प्रतिलेखन 9 के बीच एक करीबी संबंध में संकेत दिया. यहाँ हम पता लगाने और गैर पक्षपाती कोशिकाओं में quantitation γH2AX foci के लिए अन्य epigenetic मार्करों, छवि विश्लेषण और 3 डी मॉडलिंग के साथ एक सह स्थानीयकरण पर विशेष ध्यान देने के साथ हमारे immunofluorescence विधि, प्रदर्शित.

Protocol

सेल तैयारी

मानव erythroleukemic K562 कोशिकाओं RPMI 1640 37 10 (v / v) humidified 5% सीओ ₂ पर्यावरण में% भ्रूण गोजातीय सीरम और 20 मिलीग्राम / मिलीलीटर gentamicin साथ पूरक मध्यम डिग्री सेल्सियस में बड़े हो रहे हैं
लगभग 18 धुंधला हो जाना करने के लिए पहले घंटे तेजी से फॉस्फेट के साथ बढ़ रहा कोशिकाओं ^{(5 x} 10 5 कोशिकाओं / एमएल इष्टतम) (पीबीएस) खारा, ताजा मीडिया और बदले में 37 resuspend buffered धोने डिग्री सेल्सियस, _5% सीओ 2.
Centrifugation द्वारा पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं और 5 मिनट के लिए लगभग 1500 rpm पर धो ताजा मीडिया में resuspend.
कोशिकाओं की गणना और लगभग 5 x 10 ⁵ कोशिकाओं / एमएल सेल घनत्व को समायोजित .

कक्ष एक स्वचालित तरीका है (जैसे Sysmex या 5 से 20 microns के बीच फिल्टर आकार के साथ कल्टर काउंटर) या trypan नीले अपवर्जन पद्धति और एक haemocytometer का उपयोग करके भी गिना सकते हैं. अतिरिक्त कक्षों की संख्या (> 800 कोशिकाओं / ² सेमी) गैर वर्दी धुंधला हो जाना करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

किरणन और immunofluorescence धुंधला

Cytospin क्लिप, फिल्टर कार्ड और स्लाइड उचित लेबलिंग के साथ इकट्ठे.

जब कोडांतरण cytospin तंत्र सुनिश्चित करें कि फिल्टर कार्ड में छेद कीप के साथ मेल खाता है.

या तो γ विकिरण या एक्स - रे (2Gy इस उदाहरण में) के लिए कोशिकाओं बेनकाब.

विकिरण के दौरान foci के गठन को रोकने के लिए, पहले और विकिरण के दौरान 5 से 10 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं रखना.

के बाद विकिरण 37 कोशिकाओं सेते डिग्री सेल्सियस, 5% अपेक्षित समय (पीक γH2AX 30 मिनट 1 घंटे के स्तर के लिए, इस उदाहरण में 1 घंटे) _{के लिए} सीओ 2.

कोशिकाओं को दो बार और ताजा पीबीएस में centrifugation resuspend द्वारा ठंड पीबीएस के साथ धोएं.
प्रत्येक cytospin कीप और स्पिन में 5 मिनट के लिए 500 rpm पर 100 से 150 सेल निलंबन की μL बांटना.
Cytospins से अलग स्लाइड्स और कोशिकाओं को मामूली लगभग 15 मिनट के लिए शुष्क हवा की अनुमति.

कोशिकाओं को पूरी तरह से सूखे के रूप में सेलुलर आकारिकी बिखर सकता है मत करो.

एक hydrophobic कलम के साथ कोशिकाओं के चारों ओर एक चक्र ड्रा.
कमरे के तापमान (आर टी) में 5 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक करें.

हमारे अनुभव में, paraformaldehyde साथ नियतन फिक्सिंग के लिए इथेनॉल या मेथनॉल के साथ बेहतर है. सस्पेंशन कोशिकाओं आरटी पर 5 मिनट के लिए निर्धारण की आवश्यकता है जबकि अब निर्धारण बार (15 से 20 मिनट) पक्षपाती कोशिकाओं के इष्टतम निर्धारण के लिए आवश्यक हैं.

हमें लगता है कि धुंधला हो जाना तुरंत -20 डिग्री सी जो आम तौर पर उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में परिणाम तय स्लाइड्स भंडारण की तुलना में बेहतर परिणाम पैदावार.

कोशिकाओं को प्रत्येक 5 मिनट के लिए दो बार पीबीएस के साथ धोएं.
0.1% ट्राइटन आरटी पर 5 मिनट के लिए 100 एक्स के साथ कोशिकाओं Permeabilize.

बीच - 80 की तुलना में हम आम तौर पर ट्राइटन - एक्स 100 के साथ permeabilized कोशिकाओं में बेहतर संकेतों का पालन. सेल के प्रकार पर निर्भर करता है यह आवश्यक हो permeabilisation समय बदल सकता है. उदाहरण के लिए, K562 कोशिकाओं में permeabilization आरटी पर 5 मिनट के लिए पर्याप्त है जबकि पक्षपाती कोशिकाओं में एक 15 मिनट permeabilization आवश्यक है.

कोशिकाओं पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं.
आरटी में 30 मिनट (3 x 10 मिनट) के लिए 1% BSA में कोशिकाओं को ब्लॉक.

हम अवरुद्ध सीरम (माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में एक ही प्रजाति से व्युत्पन्न) और पीबीएस में गोजातीय सीरम albumin का उपयोग दक्षता की तुलना में. BSA सीरम तुलना में अधिक माध्यमिक एंटीबॉडी के बंधन गैर विशिष्ट कम से कम करने में कुशल था. हम अलग अवरुद्ध बार की तुलना में, रात भर 4 बजे अवरुद्ध डिग्री सेल्सियस 3 से तुलना x 10 मिनट और 3 एक्स कमरे के तापमान पर 20 मिनट अवरुद्ध कदम है, और निर्धारित किया है कि इष्टतम 3 एक्स 10 मिनट के लिए अवरुद्ध था.

प्रत्येक स्लाइड के लिए: प्राथमिक एंटीबॉडी के 50 μL (500 एक 1% BSA में पतला) जोड़ें.

आरटी पर कम पृष्ठभूमि धुंधला में 60 मिनट के परिणामों के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन 4 में एक रात ऊष्मायन की तुलना में डिग्री सेल्सियस

विभिन्न मार्करों दाग एक साथ विभिन्न प्रजातियों (जैसे इस उदाहरण में विरोधी γH2AX और खरगोश माउस विरोधी methylated H3K4) में उठाया एंटीबॉडी का उपयोग.
आरटी पर 90 मिनट के लिए 250 rpm पर एक कमाल मंच पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं.

सभी incubations एक humidified धुंधला गर्त में प्रदर्शन कर रहे हैं.

कोशिकाओं पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं.
50 की μL जोड़ें (1: 1000 में 1% BSA पतला) प्रत्येक स्लाइड के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी.

एक ही स्लाइड पर विभिन्न मार्करों के लिए दाग घ के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोगifferent प्रजातियों (प्राथमिक एंटीबॉडी के अनुसार) विशिष्टता और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य (जैसे विरोधी माउस 488 Alexa (हरा) और Alexa 546 (लाल) के इस उदाहरण में विरोधी खरगोश).

आरटी पर 60 मिनट के लिए 250 rpm पर एक कमाल मंच पर कोशिकाओं को सेते हैं.

यह एक अंधेरे नम लुप्त होती और माध्यमिक एंटीबॉडी के सूखने से बचने के चैम्बर में कोशिकाओं को सेते हैं सिफारिश की है.

कोशिकाओं पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं.
प्रत्येक स्लाइड के लिए (1:500 पीबीएस में पतला) TOPRO-3 के 50 μL जोड़ें.
3X 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ स्लाइड्स धो लें.
स्लाइड से अधिक नमी निकालें और विरोधी फीका समाधान जोड़ें.

यह विरोधी फीका समाधान जोड़ने से पहले पूरी तरह कोशिकाओं सूखी नहीं की सिफारिश की है.

Coverslip, नाखून वार्निश के साथ सील और कमरे के तापमान पर रात भर अंधेरे में स्लाइड्स में छोड़.

यह confocal विशिष्ट # (0.16-19 मोटी microns) 1.5 और स्पष्ट नेल पॉलिश coverslips का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.

जबकि स्लाइड पर रखने coverslip, देखभाल करने के लिए हवाई बुलबुले के गठन से बचने लिया जाना चाहिए.

छवि अधिग्रहण

एक Zeiss LSM510 मेटा confocal खुर्दबीन मानक GFP (हरा, 488 एनएम), PI (लाल 543 एनएम) और दूर लाल नीले (633 एनएम) लेसरों का उपयोग छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

छवियाँ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर बेहतर स्थानिक संकल्प प्रकट करते हासिल कर ली.

चूंकि γH2AX foci के आकार 0.5 μicrons की तुलना में कम हो सकता है, यह z-अक्ष के साथ कम से कम 0.5 μicron कदम आकार के साथ छवियों को प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है.

एक 63 x तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस या तो उच्च या कम बढ़ाई तुलना पसंद है. Foci के लिए इमेजिंग कई कोशिकाओं की गिनती के लिए यह 8 के एक स्कैन गति और 1024 x 1024 पिक्सल की छवि आकार का उपयोग करने के लिए बेहतर है. अलग परमाणु प्रोटीन यह 2048 x 2048 पिक्सल की छवि के आकार के साथ 6 की एक स्कैन गति का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है के बीच स्थानिक संबंध वर्णन करने के लिए.

जब कई चैनलों से इमेजिंग स्कैन लाइन अधिग्रहण एक फ्रेम स्कैन की तुलना में सिफारिश की है. यह विरंजन से बचा जाता है और बेहतर संकल्प हासिल की है. अनुक्रमिक स्कैनिंग के लिए चैनलों के बीच के माध्यम से खून रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है.

Foci गिनती

छवि विश्लेषण और foci गिनती विभिन्न सॉफ्टवेयर संकुल (Metamorph, छवि जम्मू और Imaris inlcuding) का उपयोग किया जा सकता है. foci Metamorph का उपयोग गिनती के लिए प्रक्रिया यहाँ वर्णित है.

या तो फ़ाइल मेनू से सीधे या बिल्ड संख्या ढेर विकल्प का उपयोग करके खोलें γH2AX छवि के ढेर.
मेनू प्रक्रिया जाओ और ढेर गणित चुना.
अधिकतम प्रक्षेपण चुना और शामिल किया विमानों का चयन करें और ठीक क्लिक करें.
एक γH2AX झगड़ा के रूप में जिसके परिणामस्वरूप छवि को बचाओ. फ़ाइल और छवि TOPRO 3 (नीला) खुला.
क्षेत्रों के लिए जाओ और एक क्षेत्र आरेखण उपकरण का चयन करें और क्षेत्रों के नाभिक के चारों ओर आकर्षित.
ΓH2AX झगड़ा छवि पर क्लिक करें और प्रक्रिया मेनू में जाने और morphological फिल्टर का चयन करें.
शीर्ष Hat चुना और एक स्रोत छवि के रूप में γH2AX छवि का चयन करें.
लागू Hat शीर्ष फिल्टर और जिसके परिणामस्वरूप छवि कम और foci तीव्रता में कम भिन्नता शोर के साथ एक द्विआधारी छवि किया जाएगा.

जब शीर्ष Hat मूल्यों को चुनने देखभाल लिया जाना चाहिए. पहले और फिल्टर लागू करने के बाद इष्टतम मूल्यों छवियों के दृश्य तुलना के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.

प्रक्रिया मेनू पर जाएँ और दहलीज छवि का चयन.
समावेशी दहलीज चुनें और कम और उच्च दहलीज मूल्यों का चयन करें.

यह आमतौर पर दहलीज मूल्यों है कि foci संख्या को प्रभावित है. इसलिए, ज्यादा ध्यान जब दहलीज मूल्यों का चयन करने के लिए आवश्यक है. यह सबसे अच्छा गिनती foci γ विकिरण के 2 से कम Gy उजागर करने के लिए कक्षों में अलग दहलीज मूल्यों का उपयोग कर संख्या के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है और तब पुस्तिका गिनती (आंख से) के साथ foci संख्या की तुलना. इष्टतम दहलीज मूल्य है कि एक पृष्ठभूमि का समावेश minimizes और foci के शामिल किए जाने के अधिकतम है.

छवि TOPRO-3 का चयन करें और क्षेत्रों मेनू में जाने और हस्तांतरण क्षेत्रों विकल्प का चयन करें. TOPRPO-3 के रूप में स्रोत छवि और शीर्ष Hat के रूप में गंतव्य का चयन करें और ठीक क्लिक करें.
एक बार परमाणु क्षेत्रों शीर्ष Hat छवि के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं उपाय मेनू में जाने और एकीकृत Morphometry विश्लेषण का चयन करें.
पॉप - अप विंडो का चयन करें स्रोत और क्षेत्र द्वारा छवि शीर्ष Hat उपाय.
का चयन करें सभी क्षेत्रों को मापने के लिए और उपाय पर क्लिक करें शीर्ष Hat छवि में इसी नाभिक के सभी में foci संख्या प्राप्त है.
प्रत्येक क्षेत्र से foci नंबर लॉग डेटा विकल्प का उपयोग करके एक एमएस एक्सेल फ़ाइल में निर्यात किया जा सकता है.

3Dछवियों के पुनर्निर्माण

Metamorph का उपयोग ढेर से एक 3D छवि बनाने के लिए:

ढेर मेनू पर जाएँ और 3 डी पुनर्निर्माण चुनें.
रोटेशन के कोण (जैसे 160 °, 320 °) का चयन करें.
3D पुनर्निर्माण प्रकार के अधिकतम का चयन करें.
रोटेशन के विमान (क्षैतिज या अनुलंब) चुना.
जेड - अंशांकन दूरी चुना.

यह निर्दिष्ट उपयोगकर्ता जेड दूरी (इष्टतम 0.5 μicrons है) का उपयोग बेहतर है.

ठीक चुना करने के लिए एक 3 डी पुनर्निर्माण बनाने.

रेखा विश्लेषण स्कैन

स्कैन लाइन Metamorph का उपयोग विश्लेषण के लिए:

या तो एक एकल विमान छवि या एक खड़ी फ़ाइल खोलें.
उपाय उपकरण सलाखों के आदेश पर जाएँ और स्कैन लाइन विश्लेषण का चयन करें.
सेल भर में एक लाइन ड्रा और यह स्वचालित रूप से लाइन के मार्ग के किनारे प्रतिदीप्ति और प्रत्येक मार्कर की तीव्रता दूरी प्रकट होगा.

विभिन्न chromatin मार्करों के स्थानिक संबंध को स्पष्ट करने के लिए, उदाहरण के लिए, γH2AX foci और histone मेथिलिकरण, यह लाइनें जो क्षेत्रों है कि दोनों घने और इन मार्करों में गरीब हैं अवधि आकर्षित करने के लिए बेहतर है.

प्रतिनिधि डेटा

इस प्रदर्शन का उद्देश्य के लिए हम γH2AX foci और H3K4me के लिए एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया, सक्रिय euchromatin transcribing के एक epigenetic निर्धारक DSBs के स्थानिक वितरण का मूल्यांकन. के रूप में संख्या 1 में दिखाया 2Gy साथ विकिरण के बाद, γH2AX foci क्षेत्रों कि दोनों H3K4me धुंधला के लिए और TOPRO 3 दाग डीएनए (चमकीले सना हुआ डीएनए क्षेत्रों heterochromatin का संकेत कर रहे हैं) के लिए सुस्त थे में मुख्य रूप से गठन.

चित्रा 1. Euchromatin में γH2AX foci विकिरण के जवाब में मुख्य रूप से फार्म. (ए) मानव erythroleukemic K562 कोशिकाओं में γH2AX foci (हरा) के immunofluorescence दृश्य 1 घंटे γ विकिरण के बाद (2 Gy). γH2AX foci H3K4me के संबंध में दिखाए जाते हैं, सक्रिय euchromatin (लाल) transcribing प्रतिनिधित्व. डीएनए TOPRO-3 (नीला) के साथ लेबल है. मर्ज किए गए छवि (नीले, लाल और हरे रंग) γH2AX foci heterochromatic क्षेत्रों से बाहर दर्शाता है. स्कैन लाइन विश्लेषण (प्रतिदीप्ति तीव्रता बनाम दूरी) एक ही विमान में मार्करों के सापेक्ष वितरण इंगित करता है. (बी) मर्ज किए गए छवि के 3 डी पुनर्निर्माण से विभिन्न विमानों पर स्लाइस ऊपर वर्णित है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

परमाणु विज्ञान और इंजीनियरिंग के ऑस्ट्रेलियाई संस्थान का समर्थन स्वीकार किया है. TCK AINSE पुरस्कार के प्राप्तकर्ता था. Epigenomic चिकित्सा लैब राष्ट्रीय स्वास्थ्य और ऑस्ट्रेलिया के चिकित्सा अनुसंधान परिषद (566,559) द्वारा समर्थित है. बायोमेडिकल इमेजिंग विकास लिमिटेड के लिए इस काम के लिए सीआरसी द्वारा वित्त पोषित है, की स्थापना की और ऑस्ट्रेलियाई सरकार ने सहकारी अनुसंधान केंद्र (सीआरसी) कार्यक्रम के अंतर्गत समर्थित. LM मेलबोर्न (मेलबोर्न विश्वविद्यालय) अनुसंधान और बायोमेडिकल इमेजिंग सीआरसी अनुपूरक छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है. मोनाश माइक्रो इमेजिंग के समर्थन (डीआरएस स्टीफन कोड़ी और Iśka Carmichael) इस काम के लिए अमूल्य था.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)	Growth medium	Invitrogen	22400071	RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid
Fetal Bovine Serum (FBS)		Sigma-Aldrich	F2442
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca²⁺ and Mg²⁺)		Invitrogen	17-517Q
Trypan blue		Sigma-Aldrich	T6146	Used to distinguish between live and dead cells.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	EMD Millipore	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
HistoneH3 (Mono-methyl K4)	Primary Antibody	Abcam	AB8895
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11035
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.
Polylysine slides		Menzel-Glaser
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Glaser	CS2250100
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Biosciences	353112
Shandon Cytospin 4		Thermo Fisher Scientific, Inc.
Cytofunnels		Shandon, Inc.
Filter Cards		Shandon, Inc.	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
PAP Pen		Zymed Laboratories, Inc.	008877
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope			Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices