Summary
DNA二本鎖切断に対する応答のSer - 139のH2AXのリン酸化に続いてフォームγH2AX巣、、の顕微鏡分析は、放射線生物学における非常に貴重なツールとなっています。ここでは、核内の放射線誘発γH2AX形成の空間分布を評価するために、積極的に転写ユークロマチンのエピジェネティックマーカーとしてリジン4でモノメチル化ヒストンH3に対する抗体を使用。
Abstract
DNA二本鎖切断（DSB）の初期の分子応答は、ヒストンH2AXの1,2の端子SQEYモチーフ内のセリン- 139残基のリン酸化である。 H2AXのこのリン酸化は、ホスファチジル- inosito 3 -キナーゼ（PI3K）タンパク質のファミリー、毛細血管拡張性運動失調変異（ATM）、DNA -プロテインキナーゼ触媒サブユニットとATMとRAD3関連（ATR）3によって仲介される。 γH2AXと呼ばれるH2AXのリン酸化形態は、、immunofluorecence顕微鏡3で簡単に可視化する離散的な病巣を形成する、DSBのサイトからクロマチンの隣接地域に広がっています。 γH2AX巣の分析と定量は、広く、特に電離放射線に応答して化合物と細胞毒性化合物4を修正する様々な放射線の有効性を評価するため、DSBの形成と修復を評価するために使用されています。
DSBがこのデノボマーカーの絶妙な特異性と感度を考えると、それはクロマチンの文脈におけるDNA損傷と修復のプロセスに新たな洞察を提供しています。例えば、放射線生物学の中心的なパラダイムは、核DNAは、放射線感受性に関する重要なターゲットであるということです。確かに、フィールドの一般的なコンセンサスは、主としてDNA損傷と修復のための均質なテンプレートとしてクロマチンを表示することであった。しかし、DSBが分子マーカー、ユークロマチンとヘテロクロマチンにおけるγ-照射誘起γH2AX巣の形成における格差としてγH2AXの使用5-7観察されている。最近、我々はモノ、どちらジ - または構成的ヘテロクロマチンと転写サイレンシングとリシン4のエピジェネティックな痕跡であるリジン9時、トリメチル化ヒストンH3（H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3）（H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3に対する抗体のパネルを使用）、しっかりと電離放射線8次のγH2AXの空間分布を調査するために、真正染色質領域を転写積極的に相関している。クロマチン生物学に関する現行の考え方に準拠して、我々の調査結果はγH2AX形成し、活発に転写9の間の密接な相関関係を示した。ここでは、他のエピジェネティックなマーカーと共局在、画像解析と3D -モデリングに特に焦点を当て、非接着細胞のγH2AX病巣の検出および定量のための私達の免疫蛍光法を示しています。
Protocol
細胞の準備
- ヒト赤白血病K562細胞は37℃、加湿5％CO 2環境で10％（v / v）のウシ胎児血清および20 mg / mlのゲンタマイシンを添加したRPMI - 1640培地℃で栽培されています
- 染色前の約18時間37に新鮮な培地と引き換えに再懸濁さ生理食塩水（PBS）、リン酸緩衝と指数関数的に成長している細胞（5 × 10 5細胞/ mlで最適な）洗浄° C、5％CO 2。
- 5分間で約1500rpmで遠心分離によって二回PBSで細胞を洗浄し、新鮮な培地に再懸濁します。
- 細胞をカウントし、約5 × 10 5細胞/ mlに細胞密度を調整する。
細胞は自動化された方法（例えばシスメックスまたは5〜20ミクロンの間のフィルタサイズはコールターカウンター）またはトリパンブルー排除法とhaemocytometerを使用するかのいずれかをカウントすることができます。細胞の過剰な数が（> 800細胞/ cm 2）不均一な染色につながる可能性があります。
照射と免疫蛍光染色
- 適切なラベリングでサイトスピンクリップ、フィルタのカードとスライドを組み立てます。
サイトスピン装置を組み立てるときにフィルタカードに穴が漏斗と一致することを確認してください。
- γ線またはX線（この例では2Gy）のどちらかに細胞をさらす。
照射中の巣の形成を防止するために、前へと照射中、5〜10分間氷上で細胞を維持する。
以下の照射は、37℃で細胞をインキュベート° C、5％に必要な時間（ピークγH2AXレベル30分〜1時間、この例では1時間）のためのCO 2。
- 新鮮なPBSで遠心分離と再懸によって冷PBSで細胞を2回洗浄する。
- 5分間500rpmで各サイトスピン漏斗とスピンに細胞懸濁液100〜150μLを分注する。
- cytospinsからスライドを分離し、細胞が適度に約15分間風乾します。
細胞は細胞形態が崩壊する可能性があるため、完全に乾燥させないでください。
- 疎水性のペンで細胞の周りに円を描きます。
- 室温（RT）で5分間、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定する。
我々の経験では、パラホルムアルデヒドで固定、エタノールまたはメタノールで固定に優れています。長い固定時間（15〜20分）は、接着細胞の最適な固定のために必要とされるのに対し、浮遊細胞は、室温で5分間固定を必要とする。
我々は、その染色がすぐに一般的に高いバックグラウンドの蛍光をもたらす-20℃で固定されたスライドを格納するよりもよい結果が得られます見つける。
- 各5分間PBSで細胞を2回洗浄する。
- 0.1パーセント、5分間室温でトリトンX - 100で細胞を透過処理。
のTween - 80に比べて我々は通常、トリトンX - 100で透過性細胞におけるより良いシグナルを観察。細胞の種類によってはそれがpermeabilisationの時間を変更する必要があります。付着細胞で15分の透過処理が必要とされるのに対し、例えば、K562細胞では、室温で5分間透過化は十分です。
- 各5分間、細胞をPBSで3回洗浄する。
- 室温で30分（3 × 10分）のための1％BSAで細胞をブロックする。
我々は、血清（二次抗体と同じ種に由来）とPBSのウシ血清アルブミンを使用して、ブロッキング効率を比較した。 BSAは血清に比べて二次抗体の非特異的結合を最小限に抑えることで、より効率的であった。我々は、室温で一晩℃で3に比べて× 10分、3 × 20分間のブロッキングのステップ4で、ブロッキング、異なるブロッキング時間を比較し、3 × 10分間ブロックして最適であると判断した。
- 各スライドに：一次抗体50μL（500 1％BSAで希釈した1）を追加します。
4℃で一晩インキュベーションに比べて減少したバックグラウンド染色で60分の結果℃、RTで一次抗体とインキュベート
- 別のマーカーを染色するために、同時に別の種（この例では、例えばマウス抗γH2AXとウサギ抗メチル化H3K4）で産生された抗体を使用してください。
- 250rpmでロッキングプラットフォーム上で室温で90分間一次抗体でインキュベートする。
すべてのインキュベーションは加湿染色トラフで実施されています。
- 各5分間、細胞をPBSで3回洗浄する。
- 50μLの追加（1：1000は、1％BSAで希釈した）二次抗体を各スライドに。
同じスライド上の別のマーカーに染色するには、dと二次抗体を使用してくださいifferent種特異性（一次抗体に応じて）と蛍光発光波長（例えば抗マウスアレクサ488（緑）および抗ウサギこの例では、アレクサ- 546（赤））。
- 250rpmで振盪プラットフォーム上でRTで60分間細胞をインキュベートする。
それは二次抗体の退色や乾燥を避けるために暗い湿室で細胞をインキュベートすることをお勧めします。
- 各5分間、細胞をPBSで3回洗浄する。
- 各スライドに50μL（PBSで希釈1:500）TOPRO - 3を追加。
- 3X 5分間PBSでスライドを洗浄します。
- スライド上の過剰な水分を取り除くと耐フェードソリューションを追加します。
それは完全にアンチフェードソリューションを追加する前に、細胞を乾燥しないことをお勧めします。
- カバースリップ、マニキュアとシールし、室温で暗所で一晩スライドを残す。
それは、共焦点特定のカバースリップ＃1.5（厚さ0.16〜19ミクロン）と明確なマニキュアを使用することをお勧めします。
スライドにカバースリップを配置しながら、ケアは気泡の形成を避けるために注意すべきである。
画像の取得
- ツァイスLSM510メタ共焦点顕微鏡は、標準のGFP（緑色、488 nmの）、PI（赤色543 nm）と（青色633nmの）はるかに赤色レーザーを使用して画像を取得するために使われます。
画像は、より良い空間分解能を明らかに共焦点顕微鏡を用いて取得した。
γH2AX病巣の大きさが0.5μicronsより低くなる場合がありますので、Z軸に沿って少なくとも0.5μicronのステップサイズで画像を取得することをお勧めします。
63 ×油浸対物レンズは、どちらかより高いまたはより低い倍率と比較して好ましい。イメージング多くの細胞のための病巣が、それをカウントするためのスキャン8の速度と1024 × 1024ピクセルの画像サイズを使用することが好ましい。異なる核タンパク質間の空間的関係を説明するために、それは2048 × 2048ピクセルの画像サイズで6のスキャン速度を使用することをお勧めします。
複数のチャネルからの画像は、ラインスキャンの買収は、フレームのスキャンと比較することをお勧めされている場合。これは、漂白し、より良い分解能が達成される回避。シーケンシャルスキャンは、チャネル間を通してブリードを防止するために使用されます。
カウント巣
画像解析と巣のカウントは、様々なソフトウェアパッケージを（Metamorph、画像- JとImarisをinlcuding）を使用して実行できます。 Metamorphを使用して、巣のカウントのための手順はここで説明されています。
- 直接ファイルメニューから、またはビルド番号のスタックオプションを使用してγH2AXの画像スタックを開きます。
- メニューを処理するために移動して、スタック演算を選んだ。
- 最大投影を選択し、含まれる平面を選択し、[OK]をクリックします。
- γH2AXTIFFのような結果の画像を保存します。 TOPRO - 3（青）画像を提出して開きます。
- 地域に移動し、地域の描画ツールを選択し、原子核の周りの領域を描きます。
- γH2AXのTIFF画像をクリックし、プロセスのメニューに移動し、モフォロジーフィルタを選択します。
- トップハットを選択し、ソースイメージとしてγH2AXイメージを選択します。
- トップハットフィルタと結果の画像を適用するには、巣の強度のノイズが少ないと低変動とのバイナリイメージになります。
トップハットの値を選択する際には注意が必要です。最適な値は、前とフィルタ適用後の画像を視覚的に比較することによって得ることができる。
- プロセスのメニューに移動し、しきい値のイメージを選択します。
- 包括的なしきい値を選択し、より低く、高いしきい値]を選択します。
それは一般的に巣の数に影響を与えるしきい値です。しきい値を選択する際にそのため、非常に注意が必要です。これは、最高のγ線照射とその後の下が2 Gyに曝露した細胞で異なるしきい値を使用してカウント巣の数は手動カウント（目で）と病巣数を比較することによって達成することができます。最適なしきい値は、背景のインクルードを最小限にし、巣の包含を最大化するものです。
- TOPRO - 3画像を選択して、地域のメニューに移動し、転送領域]オプションを選択します。 TOPRPO - 3のようなソースイメージとトップハットのような目的地を選択し、[OK]をクリックします。
- 核の領域は、トップハットの画像に転送されると測定のメニューに移動してIntegrated形態計測分析を選択します。
- ポップアップウィンドウで、地域によって、ソースイメージ - トップハットとメジャーを選択します。
- すべての領域を測定し、トップハットの画像に対応する核のすべてで巣の数を取得するための措置をクリックし選択してください。
- 各地域から巣の番号は、ログ- dataオプションを使用してMS - Excelファイルにエクスポートすることができます。
3D画像再構成
Metamorphを使用してスタックから3D画像を作成するには：
- スタックメニューに移動し、3D再構築を選択します。
- 回転の角度（例えば160℃、320℃）を選択します。
- 3次元再構成型最大]を選択します。
- 回転面（水平または垂直）を選んだ。
- Z -調整距離を選びました。
それは、（最適な0.5μicronsである）Z -距離指定されたユーザーを使用することが好ましい。
- 3次元再構成を作成するために[OK]を選びました。
ラインスキャン分析
Metamorphを使用して、ラインスキャン解析のための：
- 単一平面のイメージまたはスタックファイルのいずれかを開きます。
- コマンドを測定するツールバーに移動し、ラインスキャンの分析を選択します。
- 細胞全体に線を引くとこれが自動的に線のパスに沿って各マーカーの蛍光強度との距離を明らかにする。
様々なクロマチンのマーカーの空間的関係を明らかにするために、例えば、γH2AX巣とヒストンメチル化は、それはこれらのマーカーに密集し、貧しい人々の両方ある地域にまたがる線を描画するのが好ましい。
代表的なデータ
このデモンストレーションの目的のために我々はγH2AX巣に対する抗体を使用し、積極的にユークロマチンを転写するのエピジェネティックな決定要因にDSBが空間分布を評価するために、H3K4meする。として2Gyで照射後、図1に示すように、γH2AX病巣は両方H3K4me染色のためにとTOPRO - 3染色DNA（明るく染色されたDNA領域のヘテロクロマチンの指標である）のための鈍いした地域で主に形成。
図1。γH2AX巣の形は主にユークロマチンの電離放射線への返信です。 （A）ヒト赤白血病細胞K562のγH2AX病巣（緑）、γ線照射（2 Gy）を1時間後の免疫蛍光可視化する。 γH2AX病巣は、積極的にユークロマチン（赤）を転写表す、H3K4meに関連して示されています。 DNAはTOPRO - 3（青）で標識されている。マージされた画像（青、赤と緑）は、ヘテロクロマチン領域から除外γH2AX病巣を示しています。ラインスキャン分析（蛍光強度対距離）は、単一平面内のマーカーの相対的な分布を示している。上記のマージされた画像の3D再構成とは異なる面での（B）のスライス。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
オーストラリア原子科学技術学会のサポートが認められています。 TCKはAINSE賞を受賞しました。エピ医学研究所は、国立保健オーストラリアの医学研究評議会（566559）でサポートされています。この作品は、オーストラリア政府の共同研究センター（CRC）プログラムの下で設立され、サポートされている医学開発株式会社、のためのCRCによって運営されている。 LMは、メルボルン研究所（メルボルン大学）と医学のCRCの補助金によってサポートされています。モナッシュマイクロイメージング（博士スティーブンコーディとISKAカーマイケル）のサポートは、この仕事のための非常に貴重でした。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640) | Growth medium | Invitrogen | 22400071 | RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Used to distinguish between live and dead cells. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | EMD Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| HistoneH3 (Mono-methyl K4) | Primary Antibody | Abcam | AB8895 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11035 | |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. |
| Polylysine slides | Menzel-Glaser | |||
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Glaser | CS2250100 | |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Biosciences | 353112 | |
| Shandon Cytospin 4 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | |||
| Cytofunnels | Shandon, Inc. | |||
| Filter Cards | Shandon, Inc. | 353025 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| PAP Pen | Zymed Laboratories, Inc. | 008877 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm. | ||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
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