이온화 방사선 다음 γH2AX의 공간적 분포 평가

Summary

DNA 이중 가닥의 휴식 시간에 대한 응답으로 빼앗아 - 139에서 H2AX의 인산화 다음 양식 γH2AX foci,의 현미경 분석 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기서 우리는 핵 내에서 방사선 유발 γH2AX 형성의 공간적 분포를 평가하기 위해 적극적으로 속기 euchromatin의 epigenetic 마커로 라이신 4 모노 - methylated 히스톤 H3에 항체를 사용합니다.

Abstract

DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs)에 초기 분자 응답은 히스톤 H2AX ^1,2의 터미널 SQEY의 모티브 내에서 빼앗아 - 139 잔기의 인산화입니다. H2AX 이러한 인산화은 phosphatidyl - inosito 3 키나제 (PI3K) 단백질의 가족 운동 실조증 telangiectasia 변이된 (ATM), DNA - 단백질 키나제 촉매 subunit와 ATM과 RAD3 관련 (ATR) ³ 중재입니다. γH2AX이라고 H2AX의 phosphorylated 양식, immunofluorecence 현미경 ³ 쉽게 시각 아르 이산 foci를 형성 DSB의 사이트에서 염색질의 인접 지역으로 확산됩니다. γH2AX foci의 분석 및 quantitation 널리 특히 이온화 방사선에 대한 응답과 화합물 및 세포 독성 화합물 ^4를 수정 각종 방사선의 효능을 평가 DSB 형성 및 수리를 평가하는 데 사용되었습니다.

DSBs이 드 노보 마커의 절묘한 특이성과 감도 감안할 때, 그것은 염색질의 맥락에서 DNA 손상과 복구의 프로세스에 새로운 통찰력을 제공하고 있습니다. 예를 들어, 방사선 생물학의 중심 패러다임은 핵 DNA가 방사선 민감도와 관련하여 중요한 목표는 것입니다. 사실, 현장에서 일반적인 합의는 크게 DNA 손상 및 수리를위한 단일 템플릿으로 염색질을 볼 수있다. 그러나, DSBs의 분자 마커, euchromatin과 heterochromatin의 γ - 방사선 유발 γH2AX foci 형성의 차이로 γH2AX의 사용과 ^5-7 관찰되었습니다. 최근, 우리는 항체의 패널을 사용하거나 모노, 제정 heterochromatin 및 transcriptional 입을와 라이신 4 epigenetic 인쇄물 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 아르 디 또는 리신 9 트라이 - methylated 히스톤 H3 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) ), 단단히 이온화 방사선 ⁸ 다음 γH2AX의 공간적 분포를 조사하기 위해 적극적으로 euchromatic 지역을 해독하는 상호. 염색질 생물학에 관한 일반적인 아이디어에 따라, 우리의 연구 결과는 γH2AX 형성과 적극적인 전사 ^구 사이에 밀접한 상관 관계를 지적했다. 여기는 다른 epigenetic 마커, 이미지 분석 및 3D 모델링과 함께 공동 지방화에 특히 초점, 비 점착 성의 세포에 γH2AX foci의 감지 및 quantitation위한 immunofluorescence 방법을 보여줍니다.

Protocol

셀 준비

1. 인간 erythroleukemic K562 세포는 37 humidified 5 % CO ₂ 환경에서 10 % (V / V) 태아 소 혈청 20 MG / ML gentamicin과 보충 RPMI - 1640 배지 ° C.에 재배
2. 이전 얼룩에 약 18시간 37 새로운 미디어 및 반환에 resuspend 호수 (PBS)를 버퍼 인산과 함께 기하 급수적으로 성장 세포 (5 × 10 ⁵ 세포 / ML에 최적) 씻어 ° C 5 % CO _2.
3. 5 분 약 1,500 rpm으로 원심 분리하여 두 번 PBS로 세포를 씻어 신선한 미디어 resuspend.
4. 세포를 카운트하고 약 5 × 10 ⁵ 세포 / ML에 세포 밀도를 조정합니다.

전지는 자동화된 방법 (예 : Sysmex 또는 5-20 미크론 사이의 필터 크기 쿨터 카운터) 또는 trypan 파랑 제외 방법과 혈구계를 사용하여 어느 계산하실 수 있습니다. 세포의 수가 초과 (> 800 세포 / cm ²⁾ 비 균일한 얼룩이 발생할 수 있습니다.

조사 및 immunofluorescence 염색법

1. 적절한 라벨과 cytospin 클립, 필터 카드 및 슬라이드 조립.

조립하면 cytospin 장치 필터 카드에 구멍이 유입 경로와 일치하는지 확인.

2. γ - 방사선 또는 X - 레이 (이 예제의 2Gy)로 세포를 노출.

조사 기간 동안 foci의 형성을 방지하기 위해, 이전과 조사 중에 5~10분 위해 얼음에 세포를 유지.

다음 조사는 37 세포를 품어 ° C, 5 %를 소요 시간 (최대 γH2AX 수준 30 분 1 시간,이 예제에서는 1 시간)에 대한 CO _2.

3. 신선한 PBS에서 원심 분리하고 resuspend에 의해 감기에 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
4. 5 분 500 RPM 각 cytospin 퍼널 및 스핀에 세포 현탁액의 100-150 μL를 분배.
5. cytospins에서 슬라이드를 분리하고 전지가 적당히 약 15 분 동안 건조 공기 수 있습니다.

세포 형태는 분해 수 있으므로 세포가 완전히 건조시키지 마십시오.

6. 소수성 펜으로 세포 주위에 원을 그립니다.
7. 실온 (RT)에서 5 분 4 % paraformaldehyde로 세포를 수정.

우리의 경험에서, paraformaldehyde로 고정이 에탄올이나 메탄올로 고정하는 우수합니다. 긴 고정 시간 (15-20분)가 자기편 세포의 최적의 고정에 필요한 반면, 서스펜션 전지는 RT에서 5 분 동안 고정이 필요합니다.

우리는 얼룩 즉시 일반적으로 높은 배경 형광 결과 -20 ° C에서 고정 슬라이드를 저장하는보다 더 나은 결과를 산출 찾으십시오.

8. 오분 각 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
9. 0.1 % 5 분 RT에서 트리톤 - X 100 세포 Permeabilize.

트윈 - 80에 비해 우리는 일반적으로 트라이 튼 - X 100 permeabilized 세포에서 더 나은 신호를 관찰합니다. 세포 종류에 따라 그것은 permeabilisation 시간을 변경해야 할 수 있습니다. 자기편 세포에서 15 분 permeabilization이 필요한 반면, 예를 들어, K562 세포에서 RT에서 5 분 permeabilization은 충분합니다.

10. 오분 각 세포에게 PBS로 세 번 씻으십시오.
11. RT 30 분 (3 * 10 분)에 대한 1 % BSA의 세포를 차단합니다.

우리는 혈청 (보조 항체와 동일한 종류에서 파생)와 PBS의 소 혈청 알부민을 사용하여 차단 효율성을 비교. BSA는 혈청에 비해 이차 항체가 아닌 특정 바인딩을 최소화에보다 효율적되었습니다. 우리는 하루 4 차단, 다른 차단 시간을 비교 ° C 3에 비해 X 십분 3 실온에서 X 이십분 차단 단계, 3 X 10 분 동안 차단하는 것이 최적이라고 판단.

12. 각 슬라이드 : 기본 항체의 50 μL (500 1% BSA에 희석 1) 추가합니다.

감소 배경 얼룩 60 분 결과에 대한 RT에서 일차 항체와 배양 4에서 하룻밤 배양에 비해 ° C.

13. 다른 마커를 얼룩이 동시에 종 (이 예제의 경우 예를 들어 마우스 방지 γH2AX와 토끼 안티 methylated H3K4)에 제기 항체를 사용합니다.
14. 250 RPM에서 락을 플랫폼에서 RT 90 분 기본 항체와 부화.

모든 incubations은 humidified 얼룩의 여물 수행됩니다.

15. 오분 각 세포에게 PBS로 세 번 씻으십시오.
16. 50 μL 추가 (1 : 1000 1 % BSA로 희석) 이차 항체를 각각의 슬라이드.

같은 슬라이드에 다른 마커에 대한 얼룩하기​​ 위해서는 D와 보조 항체를 사용하여ifferent 종의 특이성 (기본 항체에 따라)과 형광 방출 파장 (예 : 안티 - 마우스 알렉사 488 (녹색)이 예제에서 안티 - 토끼 알렉사 - 546 (적색)).

17. 250 RPM에서 락을 플랫폼에서 RT에서 60 분 세포를 품어.

이것은 페이딩 및 이차 항체의 건조 방지하기 어두운 습한 챔버에서 세포를 부화하는 것이 좋습니다.

18. 오분 각 세포에게 PBS로 세 번 씻으십시오.
19. 각 슬라이드 (PBS에 희석 1:500) TOPRO - 3의 50 μL를 추가합니다.
20. 배 5 분 PBS로 슬라이드를 씻으십시오.
21. 슬라이드에서 초과 수분을 제거하고 방지 페이드 솔루션을 추가합니다.

그것은 완전히 방지 페이드 솔루션을 추가하기 전에 세포를 건조하지 않는 것이 좋습니다.

22. Coverslip, 손톱 바니와 인감 및 실온에서 어둠 속에서 야간 슬라이드를 두십시오.

그것은 공촛점 특정 coverslips # 1.5 (0.16-19 미크론 두꺼운)와 투명 매니큐어를 사용하는 것이 좋습니다.

슬라이드에 coverslip을 배치하는 동안주의가 공기 거품의 형성을 피하기 위해 이동해야합니다.

이미지 수집

1. 자이스 혈구 LSM510 메타 공촛점 현미경은 표준 GFP (녹색, 488 NM), PI (적색 543 NM)와 (블루 633 NM)까지 적색 레이저를 사용하여 이미지를 획득하는 데 사용됩니다.

이미지 더 공간적 해상도를 공개 공촛점 현미경을 사용하여 인수했다.

γH2AX foci의 크기가 0.5 μicrons보다 낮을 수 있기 때문에, 그것은 Z - 축을 따라 최소한 0.5 μicron 단계 크기의 이미지를 얻기위한 권장합니다.

63 X 오일 침지 객관적인 렌즈 중 높거나 낮은 배율에 비해 선호합니다. 계산 foci를위한 이미징 많은 세포에 대한 그것은 스캔 8 속도와 1024 X 1024 픽셀의 이미지 크기를 사용하는 것이 바람직합니다. 그것이 2048 X 2048 픽셀의 이미지 크기와 함께 6 스캔 속도를 사용하는 것이 좋습니다 다른 핵 단백질 사이의 공간적 관계를 설명합니다.

여러 채널의 영상은 라인 스캔 인수는 프레임 스캔에 비해 좋습니다 때. 이것은 표백 방지하고 더 나은 해상도 이루어진다. 연속 스캔은 채널 사이를 통해 출혈을 방지하는 데 사용됩니다.

Foci의 계산

이미지 분석 및 foci의 카운트는 다양한 소프트웨어 패키지를 (Metamorph, 이미지 - J와 Imaris를 inlcuding)를 사용하여 수행할 수 있습니다. Metamorph를 사용하여 foci의 계산에 대한 절차는 여기에 설명되어 있습니다.

1. 직접 파일 메뉴에서 또는 빌드 번호 스택 옵션을 사용하여 오픈 γH2AX 이미지 스택.
2. 메뉴를 처리하는 이동하여 스택 연산을 선택했습니다.
3. 최대 투영을 선택하고 포함하는 비행기를 선택하고 확인을 누릅니다.
4. γH2AX 티파니로 결과 이​​미지를 저장합니다. 파일과 TOPRO - 3 (블루) 이미지를 엽니다.
5. 지역으로 이동하여 영역 그리기 도구를 선택하고 핵 주변 지역을 그립니다.
6. γH2AX TIFF 이미지를 클릭하고 프로세스 메뉴로 이동하여 형태학의 필터를 선택합니다.
7. 최상위 모자를 선택하고 원본 이미지로 γH2AX 이미지를 선택합니다.
8. 적용 최상위 햇 필터 및 결과 이​​미지는 foci 강도에 적은 소음 및 감소 변화와 바이너리 이미지 것입니다.

최상층의 가치를 선택할 때주의해야합니다. 최적의 값은 이전과 필터를 적용한 후에 이미지를 시각적으로 비교하여 얻을 수 있습니다.

9. 프로세스 메뉴로 이동 및 임계값 이미지를 선택합니다.
10. 포함 임계값을 선택하고 아래와 높은 임계값 값을 선택합니다.

그것은 일반적으로 foci 번호에 영향을 문턱 값입니다. 임계값 값을 선택할 때 따라서, 많은 관심이 필요합니다. 이것은 최고의 γ - 방사선보다 낮은이 쥐 세포에 노출 서로 다른 임계값 값을 사용하여 계산 foci 번호로 달성하고 수동 계산 (눈으로)와 foci 번호를 비교할 수 있습니다. 최적의 임계값은 배경의 포함을 최소화하고 foci의 포함을 극대화 하나입니다.

11. TOPRO - 3 이미지를 선택하고 지역 메뉴로 이동하여 전송 영역 옵션을 선택합니다. TOPRPO - 3으로 원본 이미지와 최상위 모자로 목적지를 선택하고 확인을 클릭합니다.
12. 일단 핵 지역은 측정 메뉴로 이동하여 통합 Morphometry 분석을 선택 최상위 햇 이미지로 전송됩니다.
13. 지역으로 팝업 창을 선택 원본 이미지 톱 - 모자와 측정에.
14. 모든 영역을 측정 선택하고 최상층의 이미지에 해당 핵의 모든 foci 번호를 얻기 위해 측정을 클릭하십시오.
15. 각 지역에서 foci 번호는 로그 데이터 옵션을 사용하여 MS - Excel 파일에 내보낼 수 있습니다.

3D이미지의 재건

Metamorph를 사용하여 스택에서 3D 이미지를 생성하려면 :

1. 스택 메뉴로 이동 및 3D 재건을 선택합니다.
2. 회전 각도 (예 : 160 °, 320 °)를 선택합니다.
3. 3D 재건 유형 최대를 선택합니다.
4. 회전 비행기 (가로 또는 세로)을 선택할 수 있습니다.
5. Z - 보정 거리를 선택할 수 있습니다.

그것은 (최적 0.5 μicrons됩니다) Z - 거리 지정된 사용자를 사용하는 것이 바람직합니다.

6. 3D 재건을 만드는 확인을 선택할 수 있습니다.

라인 스캔 분석

Metamorph를 사용하여 라인 스캔 분석 :

1. 하나의 비행기 이미지 또는 스택 파일 중 하나를 엽니다.
2. 측정 도구 막대 명령으로 이동하여 라인 스캔 분석을 선택합니다.
3. 세포를 통해 선을 그릴이 자동으로 라인의 경로를 따라 각 마커의 형광 강도와 거리를 보여줄 것입니다.

다양한 염색질 마커의 공간적 관계를 명료하게하다하려면, 예를 들어, γH2AX foci와 히스톤 methylation, 그건이 마커의 밀도와 가난한 높은 지역에 걸쳐있는 라인을 그릴 것이 바람직합니다.

대표 데이터

이 예제의 목적을 위해 우리는 적극적으로 euchromatin을 속기의 epigenetic 결정자에게 DSBs의 공간적 분포를 평가하기 위해 γH2AX foci과 H3K4me하는 항체를 사용합니다. 마찬가지로 2Gy와 함께 조사에 따라 그림 1에 나타난 γH2AX foci 모두 H3K4me 얼룩과 TOPRO - 3 얼룩 DNA (밝은 스테인드 DNA 영역이 heterochromatin 나타내는 있습니다)에 대한 재미 있었다 지역에서 주로 형성했다.

이온화 방사선에 대한 응답으로 euchromatin에서 주로 그림 1. γH2AX foci 양식. 인간 erythroleukemic K562 세포에서 γH2AX foci (녹색)의 (A) Immunofluorescence 시각화 1 시간 γ - 방사선 후 (2 쥐). γH2AX foci가 적극적으로 euchromatin (적색)을 해독 대표, H3K4me 관련하여 표시됩니다. DNA는 TOPRO - 3 (파란색)과 함께 표시됩니다. 통합 이미지 (청색, 적색, 녹색)이 heterochromatic 지역에서 제외 γH2AX foci을 보여줍니다. 라인 스캔 분석 (형광 강도 대 거리)는 하나의 평면에있는 마커의 상대 분포를 나타냅니다. (B) 병합된 이미지의 3D 재구성 다른 비행기의 조각은 위에서 설명한.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)	Growth medium	Invitrogen	22400071	RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid
Fetal Bovine Serum (FBS)		Sigma-Aldrich	F2442
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
Trypan blue		Sigma-Aldrich	T6146	Used to distinguish between live and dead cells.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	EMD Millipore	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
HistoneH3 (Mono-methyl K4)	Primary Antibody	Abcam	AB8895
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11035
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.
Polylysine slides		Menzel-Glaser
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Glaser	CS2250100
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Biosciences	353112
Shandon Cytospin 4		Thermo Fisher Scientific, Inc.
Cytofunnels		Shandon, Inc.
Filter Cards		Shandon, Inc.	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
PAP Pen		Zymed Laboratories, Inc.	008877
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope			Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices