Оценка пространственного распределения γH2AX следующие ионизирующих излучений

Summary

Микроскопический анализ γH2AX очагов, которые образуют следующие фосфорилирование H2AX в Ser-139 в ответ на ДНК двунитевых разрывов, стал бесценным инструментом в области радиационной биологии. Здесь мы использовали антитела к моно-метилированных гистонов H3 на 4, как лизин эпигенетических маркеров активное переписывание эухроматин, оценивать пространственное распределение радиационных формирование γH2AX внутри ядра.

Abstract

Ранней молекулярной ответ на ДНК двунитевых разрывов (ДР) является фосфорилирование Ser-139 остаток в мотиве терминал SQEY из гистонов ^1,2 H2AX. Это фосфорилирование H2AX опосредовано фосфатидил-inosito 3-киназы (PI3K), семейство белков, атаксия телеангиэктазия мутировал (ATM), ДНК-протеинкиназа каталитической субъединицы и банкоматов и RAD3 связанных (ATR) ^3. Фосфорилированные формы H2AX, именуемые γH2AX, распространяется на соседние регионы хроматина с сайта DSB, образуя дискретные фокусы, которые легко визуализируется immunofluorecence микроскопии ^3. Анализ и количественное определение γH2AX очаги широко используется для оценки DSB формирования и ремонта, особенно в ответ на ионизирующее излучение и для оценки эффективности различных излучений изменения соединений и цитотоксических соединений ^4.

Учитывая изысканные специфичность и чувствительность этого заново маркер ДР, он предоставил новому взглянуть на процессы повреждения и восстановления ДНК в контексте хроматина. Например, в области радиационной биологии центральной парадигмы в том, что ядерная ДНК является критическим цель в отношении радиационной чувствительности. Действительно, общий консенсус в области в значительной степени, чтобы просмотреть хроматина в виде однородной шаблон для повреждения ДНК и ремонта. Однако в связи с использованием γH2AX как молекулярным маркером ДР, неравенство в γ-облучения вызванных γH2AX очагов формирования в эухроматин и гетерохроматин наблюдается ^5-7. В последнее время мы использовали панели антител либо моно-, ди-или три-метилированных гистонов H3 на лизина 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3), которые являются эпигенетические отпечатки конститутивного гетерохроматина и транскрипционной глушителей и лизин 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), которые тесно связано активное переписывание эухроматиновых регионах, исследовать пространственное распределение γH2AX следующие ионизирующего излучения ^8. В соответствии с преобладающим представлениям о хроматина биологии, полученные нами данные указывают на тесную взаимосвязь между γH2AX формирования и активной транскрипции ^9. Здесь мы демонстрируем нашу иммунофлюоресценции методом для обнаружения и количественного определения γH2AX очагов не соблюдают клеток, при этом особое внимание на сотрудничестве с другими локализации эпигенетических маркеров, анализ изображений и 3D-моделирования.

Protocol

Сотовые подготовки

1. Человек erythroleukemic клеток К562 выращивают в RPMI-1640 с добавлением 10% (об. / об) эмбриональной телячьей сыворотки и 20 мг / мл гентамицина в увлажненной 5% CO ₂ окружающей среды на 37 ° C.
2. Около 18 часов до окрашивания вымыть экспоненциально растущих клеток (оптимально на 5 х 10 ⁵ клеток / мл) с фосфатным буферным раствором (PBS), ресуспендируют в свежей информации и возвращения до 37 ° C, 5% СО _2.
3. Вымойте клетки дважды с PBS путем центрифугирования при примерно 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут и ресуспендируют в свежей информации.
4. Граф клеток и регулировать плотность клеток примерно 5 х 10 ⁵ клеток / мл.

Клетки можно рассчитывать либо автоматизированный метод (например, Sysmex или Coulter счетчик с фильтром размером от 5 до 20 микрон) или с помощью трипанового синего метод изоляции и гемоцитометра. Избыточное количество клеток (> 800 клеток / см ²⁾ может привести к неравномерному окрашиванию.

Облучение и иммунофлуоресцентного метода

1. Соберите цитоспина клипы, фильтр карты и слайды с соответствующей маркировкой.

При сборке аппарата цитоспина обеспечения того, чтобы отверстия в фильтре карты совпадает с воронкой.

2. Выставляют клетки либо γ-излучения или рентгеновских лучей (2Gy в данном примере).

Для предотвращения формирования очагов в процессе облучения, держать клетки на льду в течение 5 до 10 минут до и во время облучения.

После облучения клетки инкубировать при температуре 37 ° C, 5% СО ₂ в течение требуемого времени (для пика γH2AX уровней за 30 минут до 1 часа, 1 час в данном примере).

3. Вымойте клетки в два раза с холодным PBS путем центрифугирования и ресуспендируют в свежем PBS.
4. Внесите 100 до 150 мкл клеточной суспензии в каждую воронку цитоспина и вращаются на 500 оборотов в минуту в течение 5 минут.
5. Отдельные слайды из cytospins и позволяют клеткам умеренно сухой воздух в течение примерно 15 минут.

Не позволяйте клетки полностью высохнуть, как сотовые морфологии может распадаться.

6. Нарисуйте круг вокруг клетки с гидрофобным пера.
7. Fix клетки с 4% параформальдегида в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).

По нашему опыту, фиксация с параформальдегида превосходит крепление с этаноле или метаноле. Подвеска клетки требуют фиксации в течение 5 минут при комнатной температуре в то время как больше фиксации раза (от 15 до 20 минут), необходимые для оптимальной фиксации прилипшие клетки.

Мы считаем, что окрашивание сразу дает лучшие результаты, чем при хранении фиксированной слайды при температуре -20 ° С, что обычно приводит к высокой флуоресценции фон.

8. Вымойте клетки дважды с PBS в течение 5 минут каждый.
9. Permeabilize клеток с 0,1% Triton-X 100 при комнатной температуре в течение 5 минут.

По сравнению с Твин-80, которые мы обычно наблюдаем лучше сигналы в клетках с проницаемыми Triton-X 100. В зависимости от типа клеток может оказаться необходимым изменить permeabilisation времени. Например, в клетках К562 пермеабилизации в течение 5 минут при комнатной температуре достаточно, тогда как в прилипшие клетки 15 минут пермеабилизации не требуется.

10. Вымойте клетки три раза PBS в течение 5 минут каждый.
11. Блок клеток в 1% BSA в течение 30 минут (3 х 10 минут) при комнатной температуре.

Мы сравнили эффективность блокировки использованием сыворотки (взято из того же вида, как вторичные антитела) и бычьего сывороточного альбумина в ФБС. BSA был более эффективным в минимизации неспецифического связывания вторичных антител по сравнению с сывороткой. Мы сравнили различные блокировки раза, в одночасье блокировки при 4 ° С по сравнению с 3 х 10 минут и 3 х 20 минут блокировки шагов при комнатной температуре, и определили, что блокировка на 3 х 10 минут был оптимальным.

12. Добавить 50 мкл первичных антител (1: 500 разводят в 1% BSA) для каждого слайда.

Инкубация с первичными антителами при комнатной температуре в течение 60 минут приводит к снижению окрашивания фона по сравнению с ночной инкубации при 4 ° C.

13. Для окраски различных маркеров одновременно использовать антитела поднял у разных видов (например, мыши анти-γH2AX и кроличьих анти-метилированных H3K4 в данном примере).
14. Инкубируйте с первичными антителами в течение 90 минут при комнатной температуре на качалке платформы при 250 оборотах в минуту.

Все инкубации проводятся в увлажненной корыта окрашивания.

15. Вымойте клетки три раза PBS в течение 5 минут каждый.
16. Добавить 50 мкл (1: 1000 разводят в 1% BSA) вторичные антитела к каждому слайду.

Для окрашивания различных маркеров на одном слайде использования вторичных антител с гifferent видовой специфичности (в соответствии с первичными антителами) и флуоресценции длина волны излучения (например, анти-мышиных Alexa 488 (зеленый) и анти-кролик Alexa-546 (красный) в данном примере).

17. Инкубируйте клетки в течение 60 минут при комнатной температуре на качалке платформы при 250 оборотах в минуту.

Рекомендуется для инкубации клеток в темной влажной камере, чтобы избежать выцветания и сушки вторичных антител.

18. Вымойте клетки три раза PBS в течение 5 минут каждый.
19. Добавить 50 мкл (1:500 разводят в PBS) TOPRO-3 для каждого слайда.
20. Вымойте слайды с PBS для 3X 5 минут.
21. Удалите излишки влаги с горки и добавить борьбу с исчезать решение.

Не рекомендуется сушить клетки полностью, прежде чем добавлять анти-Fade решение.

22. Покровное, печать с лаком для ногтей и оставить на ночь в слайдах темноте при комнатной температуре.

Рекомендуется использовать конфокальной конкретных покровные # 1.5 (0.16-19 микрон) и прозрачным лаком ногтей.

При размещении покровное на слайде, следует проявлять осторожность, чтобы избежать образования воздушных пузырей.

Image Acquisition

1. Zeiss LSM510 Мета конфокальный микроскоп используется для получения изображений с помощью стандартного GFP (зеленый, 488 нм), П. И. (красный 543 нм) и дальнего красного (синего 633 нм) лазеры.

Изображения получены с помощью конфокальной микроскопии выявить лучшего пространственного разрешения.

Поскольку размер γH2AX очагов может быть ниже, чем 0,5 μicrons, рекомендуется приобретать изображения, по крайней мере 0,5 μicron шагом по Z-оси.

63 х нефти погружения объектива является предпочтительным по сравнению с выше или ниже увеличения. Для визуализации многих клеток для подсчета очагов желательно использовать скорость сканирования от 8 и размер изображения 1024 х 1024 пикселей. Для иллюстрации пространственных отношениях между различными ядерные белки, рекомендуется использовать скорость сканирования в 6 с выводом изображения размером 2048 х 2048 пикселей.

Когда изображений из нескольких каналов приобретения линии сканирования рекомендуется по сравнению с кадра сканирования. Это позволяет избежать отбеливания и более высокое разрешение достигается. Последовательное сканирование используется для предотвращения кровотечения через между каналами.

Очаги подсчета

Анализ изображений и очагов подсчета, могут быть выполнены с использованием различных программных пакетов (inlcuding Метаморф, Image-J и Imaris). Процедура подсчета очагов использованием Метаморф описан здесь.

1. Открыть изображение γH2AX стеки либо непосредственно из меню файла или с помощью номер сборки стеки вариант.
2. Переход к меню Процесс и выбрал стек арифметики.
3. Выбрал Максимальная проекции и выбрать самолеты, которые будут включены и нажмите кнопку ОК.
4. Сохранить полученное изображение как γH2AX Tiff. файл и открыть TOPRO-3 (синий) изображения.
5. К регионам и выбрать инструмент рисования региона и привлечь районов вокруг ядер.
6. Нажмите на изображение γH2AX Tiff и перейти к процессу меню и выберите морфологических фильтров.
7. Выбрал Top-Hat и выберите γH2AX изображения в качестве исходного изображения.
8. Применить Top-Hat фильтр и в результате изображение будет бинарного изображения с меньшим уровнем шума и снижение изменение интенсивности очагов.

Следует проявлять осторожность при выборе Top-Hat ценностей. Оптимальные значения могут быть получены путем визуального сравнения изображений до и после применения фильтров.

9. К процессу меню и выбрать порог изображения.
10. Выберите включительно порог и выберите нижний и более высокие значения порога.

Как правило, пороговые значения, которые влияют очагов номер. Поэтому большое внимание необходимо при выборе пороговых значений. Это может быть наилучшим образом достигается путем подсчета числа очагов с использованием различных пороговых значений в клетках подвергаются ниже 2 Гр γ-излучения, а затем сравнить очагов номера с ручным подсчетом (на глаз). Оптимальное значение порога является тот, который минимизирует включение фона и максимизирует включение очагов.

11. Выберите TOPRO-3 изображение и перейдите в меню регионов и выберите вариант передачи регионам. Выбор исходного изображения, как TOPRPO-3 и назначения, а Top-Hat и нажмите кнопку ОК.
12. После ядерных областей передаются в Top-Hat изображение пойти в меру меню и выберите пункт комплексного анализа Морфометрия.
13. В появившемся окне выбора источника изображения-Top-Hat и измерять по области.
14. Выберите мера всех регионов и нажмите на меру, чтобы получить количество очагов во всех соответствующих ядер в Top-Hat изображения.
15. Очаги номера от каждого региона можно экспортировать в MS-Excel-файл с помощью лог-данные опции.

3Dвосстановления изображений

Для создания 3D изображения из стека, используя Метаморф:

1. К стек меню и выберите 3D реконструкции.
2. Выберите угол поворота (например, 160 °, 320 °).
3. Выберите 3D-реконструкции типа максимума.
4. Выбрал плоскости вращения (по горизонтали или вертикали).
5. Выбрал Z-калибровки расстояния.

Желательно использовать указанный пользователем Z-расстояние (оптимальным является 0,5 μicrons).

6. Выберите ОК для создания 3D-реконструкции.

Линия сканирования анализа

Для линии сканирования анализа с использованием Метаморф:

1. Открытые либо одной плоскости изображения или сложены файл.
2. Перейти в меру команды панели инструментов и выберите Анализ строки развертки.
3. Нарисуйте линию поперек клетки и это автоматически выявить интенсивность флуоресценции и расстояние до каждого маркера по пути линии.

Для выяснения пространственного отношения различных маркеров хроматина, например, γH2AX очагов и гистонов метилирование, предпочтительнее для рисования линий, которые охватывают регионы, которые являются одновременно плотными и бедными в этих маркеров.

Представитель данных

Для этой демонстрации мы использовали антитела к γH2AX очагов и H3K4me, оценивать пространственное распределение ДР к эпигенетической определитель активное переписывание эухроматин. Как показано на рисунке 1, после облучения с 2Gy, γH2AX очаги образуются в основном в регионах, которые были скучно и H3K4me окрашивания и ДНК пятна TOPRO-3 (ярко окрашенных участков ДНК свидетельствуют о гетерохроматин).

Рисунок 1. ΓH2AX очаги преимущественно в форме эухроматин в ответ на ионизирующее излучение. (А) иммунофлуоресценции визуализации γH2AX очагов (зеленый) в человеческой erythroleukemic клеток К562, через 1 час после γ-облучения (2 Гр). γH2AX очагов показаны по отношению к H3K4me, представляющий активное переписывание эухроматин (красный). ДНК, меченных TOPRO-3 (синий). Объединенного изображения (синий, красный и зеленый) показывает, исключение γH2AX очагов от гетерохроматиновых регионах. Анализ линии сканирования (флуоресценция расстояние против интенсивности) указывает на относительное распределение маркеров в одной плоскости. (B) Ломтики в разных плоскостях с 3D-реконструкция объединенного изображения, описанные выше.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)	Growth medium	Invitrogen	22400071	RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid
Fetal Bovine Serum (FBS)		Sigma-Aldrich	F2442
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
Trypan blue		Sigma-Aldrich	T6146	Used to distinguish between live and dead cells.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	EMD Millipore	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
HistoneH3 (Mono-methyl K4)	Primary Antibody	Abcam	AB8895
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11035
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.
Polylysine slides		Menzel-Glaser
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Glaser	CS2250100
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Biosciences	353112
Shandon Cytospin 4		Thermo Fisher Scientific, Inc.
Cytofunnels		Shandon, Inc.
Filter Cards		Shandon, Inc.	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
PAP Pen		Zymed Laboratories, Inc.	008877
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope			Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices