Summary
El análisis microscópico de γH2AX focos, que forman después de la fosforilación de H2AX en la Ser-139 en respuesta a ADN de doble filamento se rompe, se ha convertido en una herramienta indispensable en la biología de la radiación. Aquí hemos utilizado un anticuerpo mono-metílico de la histona H3 lisina 4 como marcador epigenético de la eucromatina activa la transcripción, para evaluar la distribución espacial de la radiación inducida por la formación de γH2AX dentro del núcleo.
Abstract
Una primera respuesta molecular a roturas en el ADN de doble cadena (DSB) es la fosforilación de la Ser-139 de residuos en el motivo SQEY terminal de la histona H2AX 1,2. Esta fosforilación de H2AX está mediada por la fosfatidil-inosito 3-quinasa (PI3K), la familia de las proteínas, la ataxia telangiectasia mutada (ATM), el ADN-proteína de la subunidad catalítica y la quinasa ATM y RAD3 relacionadas con 3 (ATR). La forma fosforilada de H2AX, conocido como γH2AX, se extiende a las regiones adyacentes de la cromatina en el sitio del OSD, la formación de focos discretos, que son fácilmente visualizados por microscopía immunofluorecence 3. Análisis y cuantificación de γH2AX focos ha sido ampliamente utilizada para evaluar la formación de OSD y la reparación, en particular en respuesta a la radiación ionizante y para la evaluación de la eficacia de la radiación y varios compuestos de la modificación de los compuestos citotóxicos 4.
Dada la especificidad y la sensibilidad exquisita de este marcador de novo de DSBs, ha proporcionado nuevos conocimientos sobre los procesos de daño y reparación del ADN en el contexto de la cromatina. Por ejemplo, en biología de la radiación del paradigma central es que el ADN nuclear es el objetivo fundamental con respecto a la sensibilidad a la radiación. De hecho, el consenso general en el campo ha sido en gran parte para ver la cromatina como un modelo homogéneo de los daños y reparación del ADN. Sin embargo, con el uso de γH2AX como marcador molecular de DSBs, una disparidad en γ-inducida por irradiación formación γH2AX focos en la eucromatina y heterocromatina se ha observado 5-7. Recientemente, hemos utilizado un panel de anticuerpos para cualquier mono-, di-o tri-metilación de histonas H3 en la lisina 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) que se imprime epigenética de la heterocromatina constitutiva y silenciamiento transcripcional y la lisina 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), que están estrechamente correlacionados activa la transcripción de las regiones eucromática, para investigar la distribución espacial de la radiación ionizante γH2AX siguientes 8. De acuerdo con las ideas dominantes sobre la biología de la cromatina, nuestros resultados indican una estrecha correlación entre la formación de γH2AX y activa la transcripción 9. Aquí demostramos nuestro método de inmunofluorescencia para la detección y cuantificación de γH2AX focos en las células no adherentes, con especial hincapié en la co-localización con otros marcadores epigenéticos, análisis de imágenes y modelos 3D.
Protocol
Preparación de células
- Eritroleucemia humana K562 células se cultivan en medio RPMI-1640 suplementado con 10% (v / v) de suero fetal bovino y 20 mg de gentamicina / ml en un humidificado 5% de CO2 el medio ambiente a 37 ° C.
- Aproximadamente 18 horas antes de la tinción de las células en crecimiento exponencial de lavado (óptima a 5 x 10 5 células / ml) con tampón fosfato salino (PBS), se resuspenden en medio fresco y volver a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Lavar las células dos veces con PBS por centrifugación a aproximadamente 1500 rpm durante 5 minutos y resuspender en medio fresco.
- Recuento de células y ajustar la densidad celular de aproximadamente 5 x 10 5 células / ml.
Las células se pueden contar, ya sea por un método automatizado (por ejemplo, Sysmex o Coulter contador con el tamaño del filtro de 5 a 20 micrones) o mediante el método de exclusión del azul tripano y un hemocitómetro. Exceso en el número de células (> 800 células / cm 2) puede conducir a la no-uniforme manchado.
La irradiación y la tinción de inmunofluorescencia
- Montar clips citospina, tarjetas de filtro y se desliza con un etiquetado adecuado.
Durante el montaje del aparato citospina asegurarse de que el agujero en la tarjeta del filtro coincide con el embudo.
- Exponer las células a cualquiera de γ-radiación o los rayos X (2Gy en este ejemplo).
Para evitar la formación de focos durante la irradiación, mantener las células en hielo durante 5 a 10 minutos antes y durante la irradiación.
Después de la irradiación se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante el tiempo necesario (para los niveles máximos de γH2AX 30 minutos a 1 hora, 1 hora en este ejemplo).
- Lavar las células dos veces con PBS frío mediante centrifugación y se resuspenden en PBS.
- Prescindir de 100 a 150 l de la suspensión celular en cada embudo citospina y giran a 500 rpm durante 5 minutos.
- Separar las diapositivas de cytospins y permitir que las células de aire moderadamente seco durante unos 15 minutos.
No deje que se seque por completo las células de morfología celular puede desintegrarse.
- Dibuje un círculo alrededor de las células con una pluma hidrofóbicas.
- Fijar las células con paraformaldehído al 4% durante 5 minutos a temperatura ambiente (TA).
En nuestra experiencia, la fijación con paraformaldehído es superior a la fijación con etanol o metanol. Células en suspensión exigen la fijación durante 5 minutos a temperatura ambiente, mientras más tiempo de fijación (15 a 20 minutos) son necesarios para la fijación óptima de las células adherentes.
Nos encontramos con que la tinción de inmediato da mejores resultados que el almacenamiento de los portaobjetos fijados a -20 ° C, que por lo general los resultados de la fluorescencia de fondo elevado.
- Lavar las células dos veces con PBS durante 5 minutos cada uno.
- Permeabilizar las células con 0,1% Triton X-100 a temperatura ambiente durante 5 minutos.
En comparación con Tween-80 que suelen observar mejor las señales en las células permeabilized con Triton X-100. Dependiendo del tipo de célula que puede ser necesario cambiar el tiempo de permeabilización. Por ejemplo, en la permeabilización de las células K562 durante 5 minutos a temperatura ambiente es suficiente, mientras que en las células adherentes una permeabilización de 15 minutos es necesario.
- Lavar las células tres veces con PBS durante 5 minutos cada uno.
- Bloquear las células en el 1% de BSA durante 30 minutos (3 x 10 minutos) a temperatura ambiente.
Se comparó la eficacia de bloquear el uso de suero (derivado de la misma especie que la secundaria de anticuerpos) y albúmina sérica bovina en PBS. BSA fue más eficiente en la reducción de la unión no específica de anticuerpos secundarios en comparación con el suero. Se compararon los diferentes tiempos de bloqueo, el bloqueo de la noche a 4 ° C en comparación con 3 x 10 minutos y 3 x 20 minutos pasos bloqueo a temperatura ambiente, y se determinó que el bloqueo de 3 x 10 minutos, fue óptimo.
- Añadir 50 l de anticuerpo primario (1: 500 diluido en BSA al 1%) para cada diapositiva.
La incubación con el anticuerpo primario a temperatura ambiente durante 60 minutos los resultados de la tinción de fondo reducido en comparación con una incubación durante la noche a 4 ° C.
- Para teñir los diferentes marcadores utilizan simultáneamente anticuerpos producidos en distintas especies (por ejemplo, ratón anti-γH2AX y conejo anti-metilado H3K4 en este ejemplo).
- Incubar con anticuerpos primarios durante 90 minutos a temperatura ambiente en una plataforma oscilante a 250 rpm.
Todas las incubaciones se realizan a través de una tinción humidificado.
- Lavar las células tres veces con PBS durante 5 minutos cada uno.
- Añadir 50 l de (1: 1000 diluido en BSA al 1%) anticuerpo secundario para cada diapositiva.
Para la tinción de los marcadores diferentes en la misma diapositiva secundaria de anticuerpos con el uso despecificidad de especie ifferent (de acuerdo con el anticuerpo primario) y la fluorescencia de onda de emisión (por ejemplo, anti-ratón Alexa 488 (verde) y anti-conejo Alexa-546 (rojo) en este ejemplo).
- Se incuban las células durante 60 minutos a temperatura ambiente en una plataforma oscilante a 250 rpm.
Se recomienda para la incubación de las células en una cámara oscura húmeda para evitar la decoloración y el secado de la secundaria de anticuerpos.
- Lavar las células tres veces con PBS durante 5 minutos cada uno.
- Añadir 50 l de (1:500 diluido en PBS) TOPRO-3 para cada diapositiva.
- Lavar los portaobjetos con PBS durante 5 minutos 3 veces.
- Retire el exceso de humedad a partir de diapositivas y añadir anti-fade solución.
Se recomienda que no se seque completamente antes de añadir las células anti-fade solución.
- Cubreobjetos, sellado con laca de uñas y dejar diapositivas durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente.
Se recomienda el uso confocal cubreobjetos específico # 1.5 (0.16 a 19 micras de espesor) y esmalte de uñas transparente.
Al colocar el cubreobjetos sobre el portaobjetos, se debe tener cuidado para evitar la formación de burbujas de aire.
De adquisición de imágenes
- Un microscopio Zeiss LSM510 Meta confocal se utiliza para adquirir imágenes utilizando el estándar de buenas prácticas agrarias (verde, 488 nm), PI (rojo 543 nm) y el láser rojo lejano (azul 633 nm).
Las imágenes obtenidas con un microscopio confocal muestran una mejor resolución espacial.
Dado que el tamaño de γH2AX focos pueden ser inferiores a 0,5 μicrons, se recomienda la adquisición de imágenes con al menos un 0,5 tamaño de paso μicron a lo largo del eje Z.
A 63 de aceite de inmersión x lente del objetivo se prefiere frente a cualquier aumento superior o inferior. Para las células de imagen de muchos focos de contar, es preferible utilizar una velocidad de escaneo de 8 y tamaño de imagen de 1024 x 1024 píxeles. Para ilustrar la relación espacial entre las diferentes proteínas nucleares que se recomienda utilizar una velocidad de escaneado de 6, con tamaño de imagen de 2048 x 2048 píxeles.
Cuando la imagen de múltiples canales de adquisición de una línea de exploración se recomienda en comparación con un análisis del marco. Esto evita la decoloración y una mejor resolución se logra. El escaneo secuencial se utiliza para evitar sangrar por entre los canales.
Focos de contar
Análisis de imágenes y contando los focos se puede realizar utilizando diversos paquetes de software (inlcuyendo Metamorph, Image J y Imaris). El procedimiento para el recuento de los focos con Metamorph se describe aquí.
- Abrir γH2AX pilas imagen directamente desde el menú Archivo o mediante el número de construir pilas de opción.
- Ir al menú de Procesos y optó por la aritmética de la pila.
- Eligió proyección máxima y seleccionar los planos que se incluirán y haga clic en Aceptar.
- Guardar la imagen resultante como Tiff γH2AX. archivo y abrir el TOPRO-3 (azul) de la imagen.
- Ir a las regiones y seleccionar una herramienta de dibujo región y elaborar las regiones alrededor de los núcleos.
- Haga clic en la imagen γH2AX Tiff y vaya al menú de proceso y seleccionar los filtros morfológicos.
- Elija Top-Hat y seleccione la imagen γH2AX como una imagen de origen.
- Aplicar Top-Hat de filtro y la imagen resultante será una imagen binaria con menos ruido y menor variación en la intensidad de los focos.
Se debe tener cuidado al elegir los valores Top Hat. Los valores óptimos se pueden obtener mediante la comparación visual de las imágenes antes y después de la aplicación de filtros.
- Ir al menú de proceso y seleccionar la imagen del umbral.
- Elija umbral incluyente y seleccionar los valores umbral inferior y superior.
Es por lo general los valores de umbral que afectan a varios focos. Por lo tanto, se requiere mucha atención al elegir los valores de umbral. Esto puede lograrse mejor por el número de focos de contar con diferentes valores de umbral en las células expuestas a menos de 2 Gy de radiación γ-y luego comparar los números de los focos con el conteo manual (a ojo). El valor del umbral óptimo es el que reduce al mínimo la inclusión de antecedentes y maximiza la inclusión de los focos.
- Seleccione la imagen TOPRO-3 y vaya al menú de las regiones y seleccionar la opción de transferencia de las regiones. Seleccione la imagen de origen como TOPRPO-3 y el destino como sombrero de copa y haga clic en Aceptar.
- Una vez que las regiones nucleares son transferidos a la imagen Top-Hat, vaya al menú de medida y seleccione Análisis Morfometría Integrada.
- En la ventana emergente de selección de fuente de imagen-Top-Hat y medir por área.
- Seleccione medida de todas las regiones y haga clic en medida para obtener el número de focos en todos los núcleos correspondientes a la imagen Top-Hat.
- El número de focos de cada región se pueden exportar a un archivo de MS-Excel mediante el uso de la opción de registro de datos.
3Dreconstrucción de imágenes
Para crear una imagen 3D a partir de una pila utilizando Metamorph:
- Ir al menú de pila y elegir la reconstrucción 3D.
- Seleccionar el ángulo de rotación (por ejemplo, 160 °, 320 °).
- Seleccione la reconstrucción 3D de tipo máximo.
- Eligió el plano de rotación (horizontal o vertical).
- Elija la distancia Z-calibración.
Es preferible utilizar el usuario especificado Z-distancia (óptima es de 0,5 μicrons).
- Elija Aceptar para crear una reconstrucción en 3D.
Línea de análisis de seguridad
Para el análisis de línea de exploración utilizando Metamorph:
- Abra una imagen en un solo plano o un archivo de apilado.
- Ir a la herramienta de medida de barras de comandos y seleccione el análisis de línea de exploración.
- Dibuja una línea a través de la célula y esto automáticamente va a revelar la intensidad de la fluorescencia y la distancia de cada marcador a lo largo de la trayectoria de la línea.
Para dilucidar la relación espacial de los marcadores de la cromatina diferentes, por ejemplo, γH2AX focos y metilación de las histonas, es preferible para dibujar líneas que abarcan las regiones que son densos y pobres en estos marcadores.
Los datos representativos
Con el propósito de esta demostración se utilizó anticuerpos para γH2AX focos y H3K4me, para evaluar la distribución espacial de DSBs a un determinante epigenético de forma activa la transcripción de la eucromatina. Como se muestra en la figura 1, después de la irradiación con 2Gy, γH2AX focos formado sobre todo en regiones que estaban aburridos de tanto tinción H3K4me y de la mancha de ADN TOPRO-3 (regiones brillantes manchas de ADN son indicativos de la heterocromatina).
Figura 1. ΓH2AX focos forma predominante en la eucromatina en respuesta a la radiación ionizante. (A) de visualización de inmunofluorescencia γH2AX focos (verde) en humanos eritroleucemia K562 células, una hora después de la γ-irradiación (2 Gy). γH2AX focos se muestran en relación con H3K4me, lo que representa activamente a la transcripción de eucromatina (rojo). ADN está marcado con TOPRO-3 (azul). La imagen combinada (azul, rojo y verde), demuestra la exclusión γH2AX focos de las regiones de heterocromatina. El análisis de escaneo en línea (distancia de fluorescencia vs intensidad) se indica la distribución relativa de los marcadores en un solo plano. (B) Sectores en diferentes planos de la reconstrucción en 3D de la imagen fusionada se ha descrito anteriormente.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El apoyo del Instituto Australiano de Ciencia Nuclear e Ingeniería se reconoce. TCK es el ganador de premios AINSE. Laboratorio de Medicina epigenómico el apoyo de la Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia (566.559). Este trabajo está financiado por el CRC de Imágenes Biomédicas Development Ltd, establecido y apoyado en los Centros del Gobierno de Australia s de Investigación Cooperativa (CRC). LM con el apoyo de Melbourne de Investigación (Universidad de Melbourne) y de Imágenes Biomédicas becas complementarias CRC. El apoyo de Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody y Carmichael Iska) fue muy valiosa para este trabajo.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640) | Growth medium | Invitrogen | 22400071 | RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Used to distinguish between live and dead cells. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | EMD Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| HistoneH3 (Mono-methyl K4) | Primary Antibody | Abcam | AB8895 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11035 | |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. |
| Polylysine slides | Menzel-Glaser | |||
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Glaser | CS2250100 | |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Biosciences | 353112 | |
| Shandon Cytospin 4 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | |||
| Cytofunnels | Shandon, Inc. | |||
| Filter Cards | Shandon, Inc. | 353025 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| PAP Pen | Zymed Laboratories, Inc. | 008877 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm. | ||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Bonner, W. M. Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).
- Cowell, I. G. gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation. PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).
- Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &, I. liakis, G, Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
- Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci. Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).
- Goodarzi, A. A. ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin. Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).
