Utvärdering av den geografiska fördelningen av γH2AX efter joniserande strålning

Summary

Mikroskopisk analys av γH2AX härdar, som utgör efter fosforyleringen av H2AX vid Ser-139 som svar på DNA dubbel-strängbrott, har blivit ett ovärderligt verktyg i strålningsbiologi. Här har vi använt en antikropp mot mono-metylerat histon H3 på lysin 4 som en epigenetisk markör för aktivt transkribera euchromatin, för att utvärdera den geografiska fördelningen av strålningsinducerad γH2AX bildning inom kärnan.

Abstract

En tidig molekylärt svar på DNA dubbel-strängbrott (DSBs) är fosforyleringen av Ser-139 rester i terminalen SQEY motiv av histon H2AX ^1,2. Denna fosforylering av H2AX medieras av det fosfatidyl-inosito 3-kinas (PI3K) familj av proteiner, ataxi telangiectasia muterad (ATM), DNA-protein kinas katalytiska subenheten och ATM och RAD3-relaterade (ATR) ^3. Den fosforyleras form av H2AX, kallad γH2AX, sprider sig till angränsande regioner i kromatin från platsen för DSB, som utgör diskreta fokus, som är lätt synliga genom immunofluorecence mikroskopi ^3. Analys och kvantifiering av γH2AX foci har i stor utsträckning används för att utvärdera DSB bildning och reparation, särskilt som svar på joniserande strålning och för att utvärdera effekten av olika strålning ändra föreningar och cytostatika ^4.

Med tanke på den utsökta specificitet och känslighet för denna de novo markör av DSBs har det gett nya insikter i processer av DNA-skador och reparation i samband med kromatin. Till exempel i strålningsbiologi den centrala paradigmet är att kärn-DNA är den kritiska mål med avseende på strålning känslighet. Faktum är att den allmänna uppfattningen i fältet till stor del att se kromatin som en homogen mall för DNA-skador och reparation. Har dock med hjälp av γH2AX som molekylär markör av DSBs, en skillnad i γ-bestrålning-inducerad γH2AX härdar bildas i euchromatin och heterochromatin observerats ^5-7. Nyligen använde vi en panel av antikroppar mot antingen mono-, di-eller tri-metylerat histon H3 på lysin 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) som är epigenetiska avtryck av konstitutivt heterochromatin och transkriptionell tysta och lysin 4 H3K4me1 (, H3K4me2, H3K4me3 ), som är tätt korrelerade aktivt transkribera euchromatic regioner, för att undersöka den geografiska fördelningen av γH2AX efter joniserande strålning ^8. I enlighet med rådande idéer om kromatin biologi, visade våra resultat ett nära samband mellan γH2AX bildning och aktiv transkription ^9. Här kan vi visa vår immunofluorescens metod för detektion och kvantifiering av γH2AX foci i icke-häftande celler, med särskilt fokus på samarbete lokalisering med andra epigenetiska markörer, bildanalys och 3D-modellering.

Protocol

Cellberedningen

1. Mänskliga erythroleukemic K562-celler odlas i RPMI-1640 mediet kompletteras med 10% (v / v) fetalt bovinserum och 20 mg / ml gentamicin i en fuktig 5% CO ₂ miljö vid 37 ° C.
2. Cirka 18 timmar före färgningen tvätta exponentiellt växande celler (optimal vid 5 x 10 ⁵ celler / ml) med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), resuspendera i färskt media och återgå till 37 ° C, 5% CO _2.
3. Tvätta cellerna två gånger med PBS genom centrifugering vid ca 1500 rpm i 5 minuter och återsuspendera i färskt medier.
4. Räkna celler och justera celltäthet till cirka 5 x 10 ⁵ celler / ml.

Cellerna kan räknas antingen genom en automatisk metod (t.ex. Sysmex eller Coulter räknare med filter storlek mellan 5 och 20 mikrometer) eller genom att använda trypan blå uteslutning metod och en haemocytometer. Överskjutande antal celler (> 800 celler / cm ²⁾ kan leda till icke-enhetlig färgning.

Bestrålning och immunofluorescens färgning

1. Montera cytospin klipp, filter kort och bilder med lämplig märkning.

Vid montering av cytospin apparaten se till att hålet i filtret kort sammanfaller med tratten.

2. Exponera celler till antingen γ-strålning eller röntgenstrålning (2Gy i detta exempel).

Att förhindra uppkomsten av foci vid bestrålning, hålla cellerna på is i 5 till 10 minuter före och under bestrålning.

Efter bestrålning Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO ₂ för den tid som krävs (för topp γH2AX nivåer 30 minuter till 1 timme, 1 timme i detta exempel).

3. Tvätta cellerna två gånger med kallt PBS genom centrifugering och återsuspendera i färskt PBS.
4. Fördela 100 till 150 mikroliter av cellsuspensionen i varje cytospin tratt och snurra på 500 rpm i 5 minuter.
5. Separera bilder från cytospins och låta cellerna till måttligt lufttorka i ca 15 minuter.

Låt inte cellerna torka fullständigt som cellulär morfologi kan upplösas.

6. Rita en cirkel runt cellerna med ett hydrofobt penna.
7. Fix celler med 4% paraformaldehyd i 5 minuter vid rumstemperatur (RT).

Enligt vår erfarenhet är fixering med paraformaldehyd överlägsen fastställande med etanol eller metanol. Fjädring celler kräver fixering i 5 minuter vid RT medan längre fixering gånger (15 till 20 minuter) behövs för optimal fixering av anhängare celler.

Vi finner att färgning omedelbart ger bättre resultat än att lagra den fasta bilderna vid -20 ° C, vilket normalt resulterar i hög bakgrundsfluorescens.

8. Tvätta cellerna två gånger med PBS i 5 minuter vardera.
9. Permeabilize cellerna med 0,1% Triton-X 100 vid RT i 5 minuter.

Jämfört med Tween-80 observerar vi normalt sett bättre signaler i celler permeabilized med Triton-X 100. Beroende på celltyp kan det vara nödvändigt att ändra permeabilisation tiden. Till exempel i K562 celler permeabilization i 5 minuter vid RT är tillräcklig medan anhängare celler 15 minuters permeabilization krävs.

10. Tvätta cellerna tre gånger med PBS i 5 minuter vardera.
11. Block celler i 1% BSA i 30 minuter (3 x 10 minuter) vid RT.

Vi jämförde blockerar effektivt med hjälp av serum (från samma art som den sekundära antikroppar) och bovint serumalbumin i PBS. BSA var mer effektiva i att minimera icke-specifik bindning av sekundära antikroppar jämfört med serum. Vi jämförde olika blockerade tider, övernattning blockering vid 4 ° C jämfört med 3 x 10 minuter och 3 x 20 minuters blockering steg vid rumstemperatur, och bestämt att blockera för 3 x 10 minuter var optimal.

12. Tillsätt 50 mikroliter av primär antikropp (1: 500 späds i 1% BSA) till varje bild.

Inkubation med primära antikroppen vid RT 60 minuter resulterar i minskad bakgrundsfärgning jämfört med en övernattning inkubation vid 4 ° C.

13. Att fläcken olika markörer samtidigt använda antikroppar upp i olika arter (t ex mus-anti-γH2AX och kanin anti-metylerat H3K4 i detta exempel).
14. Inkubera med primära antikroppar i 90 minuter vid RT på en gungande plattform vid 250 rpm.

Alla inkubationer utförs i en fuktig färgning tråg.

15. Tvätta cellerna tre gånger med PBS i 5 minuter vardera.
16. Tillsätt 50 mikroliter av (1: 1000 späds i 1% BSA) sekundär antikropp till varje bild.

Att fläcken för olika markörer på samma bild används sekundära antikroppar med different artspecificitet (enligt den primära antikroppen) och fluorescens utsläpp våglängd (t.ex. anti-mus Alexa 488 (grön) och anti-kanin Alexa-546 (röd) i detta exempel).

17. Inkubera cellerna i 60 minuter vid RT på en gungande plattform vid 250 rpm.

Det rekommenderas att inkubera celler i en mörk fuktig kammare för att undvika blekning och torkning av den sekundära antikroppen.

18. Tvätta cellerna tre gånger med PBS i 5 minuter vardera.
19. Tillsätt 50 mikroliter av (1:500 spätts i PBS) TOPRO-3 till varje bild.
20. Tvätta objektglasen med PBS för 3X 5 minuter.
21. Ta bort fukt från bilder och lägga till anti-fade lösning.

Det rekommenderas inte att torrbatterier helt innan du lägger anti-fade lösning.

22. Täckglas, tätning med nagellack och lämna glider över natten i mörker vid rumstemperatur.

Det rekommenderas att använda konfokala specifika täckglas # 1,5 (0,16 till 19 mikrometer tjock) och klart nagellack.

Medan placera täckglas på bild, bör försiktighet iakttas för att undvika bildandet av luftbubblor.

Bild förvärv

1. En Zeiss LSM510 Meta konfokalmikroskop används för att förvärva bilder med standarden GFP (grön, 488 nm), PI (röd 543 nm) och det röda (blå 633 nm) lasrar.

Bilder fått hjälp av en konfokalmikroskop avslöja bättre rumslig upplösning.

Eftersom storleken γH2AX foci kan vara lägre än 0,5 μicrons, rekommenderas att skaffa bilder med minst 0,5 μicron steglängd längs z-axeln.

En 63 x oljeimmersion objektiv är att föredra jämfört med antingen högre eller lägre förstoring. För avbildning många celler för foci räkna är det att föredra att använda en skanningshastighet på 8 och bildstorlek på 1024 x 1024 pixlar. För att illustrera den rumsliga relationen mellan olika nukleära proteiner är det rekommenderat att använda en skanningshastighet på 6 med bildstorleken 2048 x 2048 pixlar.

Vid avbildning från flera kanaler en linje skanning förvärv rekommenderas jämfört med en ram skanna. Detta undviker blekning och bättre upplösning. Sekventiell scanning används för att förhindra blöda igenom mellan kanalerna.

Foci räkna

Bildanalys och fokus räkna kan utföras med hjälp av olika programpaket (inlcuding metamorfa, Bild-J och Imaris). Förfarandet för foci räkna med metamorfa beskrivs här.

1. Öppna γH2AX Bildstaplar antingen direkt från Arkiv-menyn eller genom att använda build-nummer stackar alternativ.
2. Gå till Process-menyn och valde stack aritmetik.
3. Välj Högsta projektion och välja de plan som ska ingå och klicka på OK.
4. Spara den resulterande bilden som en γH2AX Tiff. filen och öppna den TOPRO-3 (blå) bild.
5. Gå till regioner och välja ett verktyg region ritning och rita regioner runt kärnor.
6. Klicka på γH2AX TIFF-bild och gå till process-menyn och välj morfologiska filter.
7. Välj Top-Hat och välj γH2AX bild som en källbild.
8. Applicera Top-Hat filter och resulterande bilden kommer att bli en binär bild med mindre buller och minskad variation i fokus intensitet.

Försiktighet bör iakttas när man väljer Top-Hat värden. Optimala värden kan erhållas genom visuell jämförelse av bilder före och efter applicering filter.

9. Gå till processen menyn och välj tröskeln bild.
10. Välj inklusive tröskeln och välj den lägre och högre tröskelvärden.

Det är oftast de tröskelvärden som påverkar foci nummer. Därför är mycket uppmärksamhet krävs vid val av tröskelvärden. Detta kan bäst uppnås genom att räkna härdar numret med olika tröskelvärden i celler som utsätts för mindre än 2 Gy av γ-strålning och sedan jämföra fokus nummer med manuell räkning (genom ögat). Den optimala Tröskelvärdet är den som minimerar införandet av bakgrunden och maximerar inkludering av foci.

11. Välj TOPRO-3 bilden och gå till de regioner menyn och välj överföringen regionerna alternativet. Välj källan bilden som TOPRPO-3 och destinationen som Top-Hat och klicka på OK.
12. När nukleära regioner överförs till Top-Hat bilden går till den åtgärd-menyn och välj Integrated morfometri analys.
13. I popup-fönstret väljer källbilden-Top-Hat och mäta efter område.
14. Välj mäta alla regioner och klicka på åtgärd för att få härdar antalet i alla motsvarande kärnor i Top-Hat bild.
15. Den foci nummer från varje region kan exporteras till en MS-Excel-fil med hjälp av log-data som alternativ.

3Drekonstruktion av bilder

För att skapa en 3D-bild från en stapel med metamorfa:

1. Gå till stacken menyn och välj 3D-rekonstruktion.
2. Markera rotationsvinkeln (t ex 160 °, 320 °).
3. Välj 3D-rekonstruktion typ maximalt.
4. Välj planet rotation (horisontellt eller vertikalt).
5. Valde Z-kalibrering avstånd.

Det är bättre att använda den användare som anges Z-avstånd (optimalt är 0,5 μicrons).

6. Välj OK för att skapa en 3D-rekonstruktion.

Linje skanna analys

För linje skanna analys med metamorfa:

1. Öppna antingen en enda plan bild eller en staplade fil.
2. Gå till åtgärden verktygsfält kommando och välj analys line scan.
3. Rita en linje tvärs över cellen och denna kommer automatiskt att avslöja fluorescensintensitet och avstånd för varje markering på vägen mot linjen.

Att klarlägga den rumsliga förhållandet mellan olika kromatin markörer, till exempel, γH2AX foci och histoner metylering är det bättre att rita linjer som spänner regioner som är både tät och fattiga i dessa markörer.

Representativa data

För denna demonstration använde vi antikroppar mot γH2AX härdar och H3K4me att utvärdera den geografiska fördelningen av DSBs till en epigenetisk faktor för aktivt transkribera euchromatin. Som visas i figur 1, efter bestrålning med 2Gy bildade γH2AX härdar främst i regioner som var tråkigt för både H3K4me färgning och DNA fläcken TOPRO-3 (ljust färgade DNA-regioner är ett tecken på heterochromatin).

Figur 1. ΓH2AX härdar formulär främst euchromatin som svar på joniserande strålning. (A) Immunofluorescens visualisering av γH2AX foci (grön) i mänskliga erythroleukemic K562 celler, 1 timme efter γ-bestrålning (2 Gy). γH2AX härdar visas i förhållande till H3K4me, som representerar aktivt transkribering euchromatin (röd). DNA är märkt med TOPRO-3 (blå). Det sammanslagna bilden (blå, röd och grön) visar att utesluta γH2AX härdar från heterochromatic regioner. Linjen skanna analys (fluorescensintensiteten vs avstånd) anger den relativa fördelningen av markörer i ett enda plan. (B) Slices på olika plan från 3D rekonstruktion av den sammanslagna bilden som beskrivs ovan.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)	Growth medium	Invitrogen	22400071	RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid
Fetal Bovine Serum (FBS)		Sigma-Aldrich	F2442
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
Trypan blue		Sigma-Aldrich	T6146	Used to distinguish between live and dead cells.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	EMD Millipore	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
HistoneH3 (Mono-methyl K4)	Primary Antibody	Abcam	AB8895
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11035
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.
Polylysine slides		Menzel-Glaser
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Glaser	CS2250100
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Biosciences	353112
Shandon Cytospin 4		Thermo Fisher Scientific, Inc.
Cytofunnels		Shandon, Inc.
Filter Cards		Shandon, Inc.	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
PAP Pen		Zymed Laboratories, Inc.	008877
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope			Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices