Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Application Notes

CryoStor Cryopreservatie Protocol

doi: 10.3791/2206 Released: October 7, 2010
Aby Mathew1
1BioLife Solutions, Inc.

Sign in to register to receive emails with product information.

Summary

CryoStor cryopreservatie oplossingen worden gebruikt om voor te bereiden en cellen te behouden in ultra lage temperaturen, zonder de noodzaak van serum, eiwitten, of hoge niveaus van cytotoxische middelen.

Abstract

Cryopreservatie werkzaamheid - die na de dooi het herstel, de levensvatbaarheid en functionaliteit omvat is van belang voor zowel onderzoek als klinische toepassingen. De cumulatieve benadrukt dat het gevolg zijn van de cryopreservatie proces en suboptimale bevriezen media resultaat in cel dood door necrose en apoptose. 1-5 Cellen en weefsels kunnen worden bereid en bewaard in ultra lage temperaturen (-80 ° C tot -196 ° C) met behulp van CryoStor cryopreservatie oplossingen. Aangezien deze oplossingen zijn geformuleerd om de moleculair biologische aspecten van de cellen tijdens het proces van cryopreservatie adres, verminderen ze het niveau van de cryopreservatie-geïnduceerde delayed-onset celdood, waardoor het verbeteren van post-dooi levensvatbaarheid van de cellen en functie. Daarnaast moeten zij serum, eiwitten, of hoge niveaus van cytotoxische middelen wordt geëlimineerd met dit protocol op te nemen. In deze video artikel zullen we laten zien van de procedures voor het bevriezen, opslag en ontdooien van de cellen, alsook een beoordeling levensvatbaarheid van de cellen na ontdooien.

Protocol

1. Voorbereiden Cellen voor Cryopreservatie

  1. Ter voorbereiding op cryopreservatie, plaats cellen in suspensie door mechanische of enzymatische dissociatie.
  2. Vervolgens centrifuge cellen tot een cel pellet te verkrijgen.
  3. Na het centrifugeren, verwijder zoveel mogelijk van de cultuur media supernatant mogelijk, om verwatering van het CryoStor oplossing, die zal worden toegevoegd in de volgende stap te verlagen.
  4. Voor het openen van de fles koud CryoStor oplossing, veeg de buitenkant van de container met 70% ethanol.
  5. ISOLATIE: Voeg koud CryoStor naar cel concentraties van 0,5-10 x 10 6 cellen / ml te verkrijgen.
  6. PRE-FREEZE: Incubeer de celsuspensie bij 2-8 ° C gedurende ongeveer 10 minuten.

2. Invriezen en opslaan van cellen

  1. Te bevriezen de meeste zoogdiercelsystemen, gebruik dan een standaard langzame snelheid gecontroleerde afkoeling protocol met een bevriezing apparaat of isopropanol container pre-gekoeld tot 2-8 ° C.
  2. Nucleatie: Freeze monsters bij -80 ° C.
  3. Na ongeveer 10 minuten. bij -80 ° C, het initiatief tot ijs nucleatie binnen de steekproef (zaaien) bij ongeveer -5 ° C met behulp van een vloeibare stikstof burst-programma-instelling op een gecontroleerde snelheid vriezer of mechanische agitatie (flick of tik) van de cryovial / monsterhouder.
  4. Bevriezing van de cellen gedurende 3-4 uur (voor isopropanol container).
  5. OPSLAG: Voor langdurige opslag, plaats monsters op vloeibare stikstof temperaturen, onder de -130 ° C. Monster opslag bij -80 ° C is alleen aanbevolen voor de korte termijn opslag van weken tot maanden.

3. Ontdooien Cellen

  1. Bevroren monsters moeten snel worden ontdooid in een 37 ° C waterbad. Zwenk het monster (s) totdat alle zichtbare ijs is gesmolten. De geschatte dooi tijd voor een 1 mL monster in een cryovial is ongeveer 3 minuten.
  2. Zorg ervoor dat de sample (s) op te warmen boven koel (0-10 ° C). Bij het verwijderen uit het water bad, de cryovial (s) moet worden koel aan.
  3. Onmiddellijk verwatering van de cel / CryoStor mengsel met cultuur media die ligt tussen 20 ° C en 37 ° C, met behulp van een verdunningsverhouding van 1:10 of groter van het monster de media.
  4. Plaat cellen in de juiste configuratie.
  5. Plaats cellen in kweekomstandigheden of gebruiken onmiddellijk.
  6. Vierentwintig uur na de dooi, beoordelen van de cellen voor levensvatbaarheid.

4. Representatieve resultaten

  1. Resultaten van de levensvatbaarheid van de cellen beoordeling 24 uur na de dooi worden gezien in figuur 1. Vergelijk de resultaten van de ontdooide cellen met niet-bevroren controles.

Figuur 1
Figuur 1. Herstel van de menselijke fibroblasten na cryopreservatie in de traditionele cultuur media / serum / DMSO of het serum-vrij en eiwit-vrij intracellulair-achtige CryoStor: normale menselijke dermale fibroblasten (NHDF) werden gecryopreserveerd in cultuur media / serum / DMSO of in CryoStor cryopreservatie media. Na het ontdooien, werden cellen toegestaan ​​om te herstellen bij standaard kweekomstandigheden (37 ° C / 5% CO 2 / vochtige lucht) in fibroblast groei media. Cellen werden getest bij 24 uur na ontdooien met alamarBlue levensvatbaarheid van de cellen adequaat te beoordelen naar aanleiding van de manifestatie van een vertraagd celdood processen zoals apoptose en secundaire necrose.

Discussion

Deze video aangetoond dat de cryopreservatie werkzaamheid van een intracellulaire-achtig serum-vrij en eiwit-vrij cryopreservatie oplossing in vergelijking met een traditionele cryococktail gemaakt van cultuur medium, serum, en DMSO. Hoe kan ik cellen cryopreserve, werden de voordelen van het gebruik van een intracellulaire-achtige cryopreservatie oplossing, en een voorbeeld van hoe de Ware Levensvatbaarheid van cellen na ontdooien te beoordelen geschetst. Het is belangrijk op te merken dat, omdat cellen sterven door apoptose en necrose na de dooi over een periode van uren tot dagen, wat is waargenomen als Perceived Levensvatbaarheid direct na de dooi niet mogelijk de Ware levensvatbaarheid op lange termijn. Dit vertraagde aanvang van celdood kan vervolgens invloed hebben op de kwaliteit van de cel innesteling en de effectieve terugvordering van cellulaire functionele mogelijkheden, die beide zijn cruciaal voor het succes van klinisch cellen en weefsels therapieën.

Disclosures

Aby Mathew is in dienst van BioLife Solutions, Inc, dat het reagens dat wordt gebruikt in dit artikel oplevert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Human Dermal Fibroblasts Lonza Inc.
Fibroblast Growth Media Lonza Inc.
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9269
TrypLE Express GIBCO, by Life Technologies
Centrifuge tubes Sigma-Aldrich T1818
Culture Flask Sigma-Aldrich C7231
96-well microplates Sigma-Aldrich M0687
CryoStor Sigma-Aldrich
DMSO - USP grade Sigma-Aldrich D7941
Cryovials Sigma-Aldrich V4757
Nalgene Mr. Frosty freezing container Sigma-Aldrich C1562
-80°C Freezer VWR international
Liquid Nitrogen dewar VWR international
Liquid Nitrogen Praxair, Inc.
Waterbath VWR international
alamarBlue TREK Diagnostics, Thermo Scientific
Tecan Fluorescent Plate Reader Tecan Group Ltd.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathew, A.J. I m Losing Cell Viability and Function at Different Points in My Process, and I Don t Know Why! BioProcess International 8(6), 54-7 (2010).
  2. Baust, J.M., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Van Buskirk, R.G., Baust, J.G. Steps to Improving Cryopreservation Outcome: Understanding Key Factors Influencing Efficacy. Bioscience Technology (2006).
  3. Van Buskirk, R.G., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Baust, J.G., Baust, J.M. Navigating the post-preservation viability fog. Genetic Engineering News 38-39 (2006).
  4. VanBuskirk, R.G., Snyder, K.K., Baust, J.G., Mathew, A.J., Baust, J.M. Cryopreservation: it s not just about cell yield. BioProcess International 2-8 (2005).
  5. Snyder, K.K., VanBuskirk, R.G., Baust, J.M., Mathew, A.J., Baust, J.G. Biological packaging for the global cell and tissue therapy markets. BioProcessing Journal 1-7 (2004).
CryoStor Cryopreservatie Protocol
Play Video

Cite this Article

Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).More

Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter